免疫學(xué)檢驗(yàn)試劑的制備

1、1免疫學(xué)檢驗(yàn)試劑的制備2免疫學(xué)檢驗(yàn)免疫學(xué)測定（immunoassay）是基于抗原抗體反應(yīng)的一種方法，一般指定量測定，但廣義上講，也應(yīng)包括定性分析。免疫學(xué)測定用于疾病診斷時(shí)稱為免疫學(xué)診斷或免疫學(xué)檢驗(yàn)。免疫學(xué)檢驗(yàn)內(nèi)容不僅包括激素、維生素、藥物、毒物、蛋白質(zhì)和酶等檢驗(yàn)項(xiàng)目，還滲透到環(huán)境衛(wèi)生、食品衛(wèi)生、畜牧獸醫(yī)、作物保護(hù)、司法鑒定和寵物保健等領(lǐng)域。3免疫學(xué)檢驗(yàn)試劑免疫學(xué)檢驗(yàn)的方法和試劑的研究、開發(fā)和商業(yè)化已經(jīng)有幾十年的歷史20世紀(jì)60年代起發(fā)展加快20世紀(jì)70年代形成產(chǎn)業(yè)體系現(xiàn)在已經(jīng)成為生物高科技產(chǎn)業(yè)的一大支柱現(xiàn)代免疫學(xué)檢驗(yàn)不再是單純血清，試劑也不再是單純的抗血清，采用各種標(biāo)記和結(jié)合蛋白等手段，豐富和

2、發(fā)展了免疫學(xué)檢驗(yàn)的內(nèi)容。4免疫學(xué)檢驗(yàn)試劑免疫沉淀反應(yīng)測定免疫吸附劑固相酶免疫測定快速酶免疫測定均相酶免疫測定粒子免疫測定5第一章 免疫沉淀反應(yīng)測定可溶性抗原和可溶性抗體反應(yīng)形成不溶性抗原抗體復(fù)合物（IC）的過程稱為沉淀反應(yīng)?？乖贵w反應(yīng)存在最適比問題免疫沉淀反應(yīng)測定的常用方法主要有： 免疫濁度法 凝膠內(nèi)的沉淀試驗(yàn)61 免疫濁度法定義 可溶性抗原和可溶性抗體反應(yīng)后，抗原抗體結(jié)合形成的免疫復(fù)合物，并以懸浮顆粒的形式存在于反應(yīng)體系中。當(dāng)這種免疫復(fù)合物顆粒足夠大時(shí)，因其對光的散射作用而產(chǎn)生肉眼可見的濁度，或足以使儀器分辨的濁度變化，這種通過觀察濁度變化以確定反應(yīng)體系中是否有抗原存在的方法即稱為免疫濁度

3、法。7免疫濁度法20世紀(jì)30年代出現(xiàn)，60年代后隨著葡聚糖（dextran）和聚乙二醇（PEG）等高分子聚合物應(yīng)用發(fā)現(xiàn)，才逐漸成為實(shí)用的測定方法。免疫濁度法分為終點(diǎn)法和速率法兩種。免疫濁度法廣泛應(yīng)用于血漿蛋白、免疫活性蛋白、自身免疫抗體、藥物、激素和各種傳染病因子的測定。81.1 基礎(chǔ)知識懸浮液或膠體的光散射作用可以用Rayleigh公式表示： (m2-m02)N2U Iq=I0 ( 1+cos2q) m2l4g2Iq-散射光強(qiáng)度，I0-入射光強(qiáng)度，l-入射光波長，q-入射光與散射光夾角，m,N,U分別表示微粒的折射率、數(shù)目和體積，m0為介質(zhì)的折射率，g為光源至檢測器的半徑； q-為0時(shí)即為透

4、射光比濁測定法91.2 試劑的制備主要試劑包括：抗血清聚合物溶液標(biāo)準(zhǔn)溶液參考抗原溶液10抗血清基本要求： 高特異性、高效價(jià)、高親和力、澄清度好、穩(wěn)定性佳。制備：將免疫原免疫山羊或兔等動物，獲得抗血清。在抗血清中溶入無水氯化鈣（0.6%,w/v）和葡聚糖硫酸酯（ 0.05%，w/v ）， 于 40C 放置過夜，離心或過濾除去脂蛋白沉淀，上清夜或?yàn)V液加0.02 mol/L, pH5.2 PBS 于40C透析，分離去沉淀物，上清液用 0.1 M NaOH 溶液調(diào)至 pH 7.4，加0.1%NaN3和0.01%柳硫汞防腐。11PEG0.05% pH7.4 PBS溶液：每升含NaCl90g, 2-硫代珀

5、瑞玲氧化鈉鹽0.1g，Tween20或Triton x-100 15ml，NaN3 1.0gPEG 6000用該緩沖液配制成： 80g/L溶液散射法 48g/L溶液透射法12標(biāo)準(zhǔn)液或參考抗原溶液自行制備參考抗原溶液購買標(biāo)準(zhǔn)液、參考標(biāo)準(zhǔn)溶液13樣品處理試劑或樣品的濁度會干擾免疫濁度法測定，故試劑應(yīng)經(jīng)離心或過濾等處理。高血脂是新鮮樣品混濁的主要原因，血清擱置一定時(shí)間后某些蛋白成分也會自行聚合混濁?；鞚針悠烦吻鍎╟leaing agent for turbid samlpe,CATS） 主要成分：去垢劑或表面活性劑 濕潤劑：糖類或聚乙二醇142 凝膠內(nèi)免疫沉淀反應(yīng)單向免疫擴(kuò)散法雙向免疫擴(kuò)散法152

6、.1 單向免疫擴(kuò)散法材料準(zhǔn)備用載玻片或一定規(guī)格的玻片作為底板，洗凈，干燥。pH 7.2 PBS配制預(yù)試確定合適的抗血清濃度抗血清瓊脂板的澆制PBS配制2%瓊脂，加熱溶解，煮沸數(shù)分鐘，冷卻至500C。抗血清按預(yù)試確定的稀釋度用PBS配制，加熱至500C，與等體積的瓊脂溶液混合。以0.2ml/cm2的量澆注玻片上，冷卻至室溫凝固后，密封，4 0C冰箱保存，備用。162.2 雙向免疫擴(kuò)散法瓊脂板的澆制瓊脂溶液配方為： 純化瓊脂9.0g，NaCl 0.9g，甘氨酸7.5g，檸檬酸三鈉0.4g，酚0.25g，NaN30.1g，加水至100ml，板的澆制方法同單擴(kuò)法。使用前打孔。17小結(jié)免疫濁度法：基本知

7、識、試劑制備 Rayleigh公式凝膠內(nèi)的免疫沉淀反應(yīng)： 1.單向擴(kuò)散法：材料準(zhǔn)備、抗血瓊瓊脂板制備 2.雙向擴(kuò)散法：瓊脂板的澆注18第二章 免疫吸附劑定義：與固相載體結(jié)合的抗原或抗體稱為 免疫吸附劑免疫吸附劑是固相免疫測定中的主要試劑19第一節(jié) 固相載體載體的基本要求載體的性質(zhì)載體的選擇載體的質(zhì)量檢定20載體的基本要求載體在固相標(biāo)記免疫測定中作為分離游離的和結(jié)合的抗原或抗體的工具，其基本要求是：效 率：與免疫吸附劑的質(zhì)量、反應(yīng)性能密切相關(guān)實(shí)用性：與試劑成本及用戶對方法的認(rèn)可性直接有 關(guān)：96孔板效率最高，聚苯乙烯廉價(jià)、質(zhì)優(yōu)通用性：應(yīng)用廣泛安全性：材料無毒、環(huán)保，穩(wěn)定21載體的性質(zhì)1.材料：塑

8、料和膜常用的塑料有：聚苯乙烯PS、聚氯乙烯PVC、聚丙酰胺(尼龍)等,PS最常用。常用的膜：玻璃纖維、硝酸纖維、醋酸纖維和混合纖維等，2.性質(zhì)分為：物理吸附性和化學(xué)交聯(lián)性22載體的選擇載體的選擇應(yīng)根據(jù)效率、安全性、實(shí)用性和通用性四條原則為準(zhǔn)，結(jié)合具體方法和情況而定。 如：急診或病人床邊、家庭診斷用的快速簡易檢驗(yàn)應(yīng)注重實(shí)用性。而大醫(yī)院或大量過篩試驗(yàn)，則應(yīng)講求效率。23載體的質(zhì)量檢定以96孔板為例，檢定主要包括：表面光潔度及加工的一致性吸附量孔間和板間吸附量變異性24表面光潔度及加工的一致性完好的微孔板載體應(yīng)是外光潔、平整，無可見氣泡、裂縫和雜質(zhì)等，以空氣、水或有色溶液作測定，孔間和板間的吸光度變

9、異質(zhì)應(yīng)在允許的范圍內(nèi)。 要求： CV 值2-5%以內(nèi)25吸附量常以BSA-抗BSA和抗人IgG系統(tǒng)作為研究對象。研究某一載體對其的吸附性。也可用抗原、抗體本身為研究對象26孔間和板間吸附量變異性CV值符合要求不同廠商產(chǎn)品，同一廠商不同批號產(chǎn)品對BSA的吸附量差別很大，選用前應(yīng)檢定，合格的大量購入。27第二節(jié) 配 體配體( ligand ) 指以可逆的非共價(jià)結(jié)合的成對物質(zhì)之一。如抗原與抗體、酶與底物或輔基、生物素與親和素、血凝素與碳水化合物或糖蛋白等，它們互為配體。28配體的純度免疫學(xué)測定以配體間的結(jié)合反應(yīng)為基礎(chǔ)，配體的質(zhì)量十分重要。衡量配體質(zhì)量的主要指標(biāo)是純度和活性。最理想的配體是高純度、活性

10、強(qiáng)的。配體的純度應(yīng)以測定需要達(dá)到的靈敏度和特異性等為標(biāo)準(zhǔn)純化方法：DEAE柱層析，親和層析29配體的活性代表抗原和抗體活性的主要指標(biāo)是免疫學(xué)效價(jià)或滴度、特異性以及抗體的親和力。配體的特異性是保證免疫測定試劑特異性的必要條件，而效價(jià)或滴度的高低、親和力與親和性的強(qiáng)弱則是決定試劑靈敏度的主要因素。多數(shù)蛋白質(zhì)抗原和抗體的免疫學(xué)活性劑純度可用免疫擴(kuò)散和免疫電泳法加以檢測。30第三節(jié) 配體的固相化配體經(jīng)物理吸附或化學(xué)交聯(lián)的方式與固相載體結(jié)合的過程稱為配體的固相化（immobilization） 。31一、物理吸附法物理吸附作用力：Van der Waals力、Coulombic forces、疏水作用力

11、等。電解質(zhì)的性質(zhì)和濃度、離子強(qiáng)度均影響吸附。包被液（coating solution） 1.pH值：高于其pI 0.2-0.5。pH9.6 碳酸鹽緩沖液 2.緩沖液離子強(qiáng)度和性質(zhì) 3.去垢劑包被與效率：與配體濃度、溫度密切相關(guān) 低溫包被，邊緣效應(yīng)問題配體的預(yù)處理：IgG聚合、細(xì)菌病毒裂解、超聲 處理細(xì)胞膜等32二、化學(xué)交聯(lián)法乳膠經(jīng)共聚反應(yīng)或化學(xué)修飾而具有表面活性基團(tuán)，故常用化學(xué)交聯(lián)法與配體結(jié)合。常用的化學(xué)基團(tuán)：羧基、氨基、酰胺基、羥基、肼基等。優(yōu)點(diǎn)：配體與載體結(jié)合牢固 缺點(diǎn)：配體的活性基團(tuán)被交聯(lián)反應(yīng)消耗，活性降低，成本高。33二、化學(xué)交聯(lián)法方法：戊二醛活化法處理載體表面活化劑改良法處理載體34

12、三、間接包被法抗原間接包被法抗體間接包被法血凝素間接包被法BSA間接包被法親和素-生物素間接包被法纖維結(jié)合蛋白35抗原間接包被法 載體與抗體有較好的吸附性，因此包被有某種抗體的載體可經(jīng)抗原抗體特異性反應(yīng)而與抗原結(jié)合。36抗體間接包被法 用于對抗體間接包被的結(jié)合蛋白有A蛋白或G蛋白、第二抗體、抗IgG Fc段抗體等37血凝素間接包被法 碳水化合物、多糖、糖脂和糖蛋白等抗原與血凝素有親和作用，因此可借血凝素再與載體結(jié)合38BSA間接包被法 對預(yù)先包被的BSA作化學(xué)改性（活化）處理后，經(jīng)化學(xué)交聯(lián)反應(yīng)與配體結(jié)合39親和素-生物素間接包被法 大多數(shù)蛋白質(zhì)與生物素結(jié)合后仍能保持原有活性，一個(gè)親和素分子可以

13、結(jié)合4分子生物素，效率較高40四、洗滌和封閉洗滌：是把非單層結(jié)合的吸附配體和結(jié)合于載體的非特異性物質(zhì)洗掉。洗滌液的制備和洗滌操作是關(guān)鍵技術(shù)。封閉（blocking）:是掩蓋載體表面未被配體占領(lǐng)的空位或未與配體結(jié)合的化學(xué)活性基團(tuán)，以免在測定中與樣品發(fā)生非特異性結(jié)合。常用1%BSA,10%小牛血清41第四節(jié) 免疫吸附劑的穩(wěn)定化免疫吸附劑起有效作用的是暴露的結(jié)合配體的單層分子膜，它受微生物污染后可被分解而失活，也可因不斷地干燥失水或吸水潮解而進(jìn)一步變形失活。氧化亦是導(dǎo)致失活的因素之一。 因此，免疫吸附劑在制備后， 應(yīng)作穩(wěn)定化處理，以求在較長時(shí)期內(nèi)保持其有效性 和可用性。42一、穩(wěn)定劑抑菌劑：常用的有

14、NaN3、柳硫汞、抗菌素抗氧化劑：有些配體易被氧化，常加入抗氧化劑如Vit E親水穩(wěn)定劑：大多數(shù)配體都是親水性的，如抗體和蛋白類抗原等，保護(hù)其親水結(jié)構(gòu)對維持和發(fā)揮固相配體的活性極為重要。與樣品水溶液接觸時(shí)能迅速水合的物質(zhì)，常作為親水穩(wěn)定劑，有BSA、蔗糖等。43二、穩(wěn)定化處理根據(jù)具體情況選擇不同的穩(wěn)定劑，以適濃度溶入有關(guān)緩沖液中。在免疫吸附劑制備和封閉、洗滌后，用穩(wěn)定劑再作一次封閉處理。也可用穩(wěn)定劑代替封閉液直接封閉。44三、包裝處理法合適的包裝也是維持穩(wěn)定性的重要環(huán)節(jié)。用氣密性良好的復(fù)合塑料封裝，或用置換氮?dú)馄胶夥庋b，或真空封裝。均可達(dá)到維持恒定的內(nèi)部濕度和衛(wèi)生環(huán)境、防止進(jìn)一步氧化等作用。4

15、5小結(jié)免疫吸附劑固相載體：基本要求、載體性質(zhì)、載體的選擇、載體的質(zhì)量檢定配體：配體的純度要求、配體的活性配體的固相化：物理吸附法、化學(xué)交聯(lián)法、間接包被法、洗滌和封閉免疫吸附劑的穩(wěn)定化46 第三章 固相酶免疫測定在醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)應(yīng)用最廣的標(biāo)記免疫測定為酶免疫測定，特別是固相酶免疫測定。 近十年來，在適合于醫(yī)院大量標(biāo)本集中（centralization）測定，和適合于小型醫(yī)院及私人診甚至病人家庭的分散性（decentralization）測定兩個(gè)方面，在免疫診斷試劑市場都有很大的發(fā)展。固相酶免疫測定的主要試劑為免疫吸附劑，酶結(jié)合物及酶的底物。47第一節(jié) 酶結(jié)合物的制備酶與免疫球蛋白、抗原及半抗原等結(jié)合體

16、（ binder ） 經(jīng)化學(xué)交聯(lián)形成的結(jié)合物稱為酶標(biāo)記結(jié)合物或簡稱結(jié)合物（conjugate）抗原或抗體分子中的 氨基、 羧基、 酰氨基、巰基和羥基等都可被適當(dāng)?shù)慕宦?lián)劑活化，而與酶分子相結(jié)合48半抗原一般需先引人某一化學(xué)活性基團(tuán)后才可與酶分子進(jìn)行化學(xué)交聯(lián)反應(yīng)。制備酶結(jié)合物的具體方法很多，大致分為一步法、二步法、三步法和保護(hù)法四類，前兩類較為多用。辣根過氧化物酶（HRP）和堿性磷酸酶（AP）仍是現(xiàn)今最常用的標(biāo)記酶。49一、HRP-IgG結(jié)合物的制備最常用的制備方法為： 過碘酸鹽法 戊二醛法501.過碘酸鹽法在新鮮配制的0.3mol/L NaHCO3緩沖液1.0 ml中溶入HRP (RZ3.0)

17、5mg， 加 4080 mmol/L NaIO4 水溶液1.0ml， 室氣溫輕輕攪拌 30 分鐘，混合液由棕色變?yōu)辄S綠色指示反應(yīng)正常。經(jīng)NaIO4活化的HRP加10mmol/L pH9.5磷酸緩沖液1L，4透析，更換透析液3次。在已透析處理的活化 HRP 溶液內(nèi)加IgG 5mg，室溫輕輕攪拌反應(yīng)3小時(shí)后加NaBH4 5mg，置4 318小時(shí)。再加0.1 mol/L pH7.4 PBS透析。512.改良過碘酸鹽法 抗血清的分離和純化 DEAE 纖維素 100 g ( DE52，Whatman ) 加 0.0l mol/L，pH8.0 PBS 850ml，加1.0mol/L HCl調(diào)節(jié)該懸浮液pH

18、至8.0， 靜宜30分鐘后分掉上消部分細(xì)顆粒，如此重復(fù)處理 DEAE 3次， 最后沉淀經(jīng)布氏漏斗過濾后抽干30秒鐘。抗血清l0ml加水30ml稀釋，加如上處理的DEAE50g，置4 1 小時(shí)，期間每隔10 分鐘攪拌 1次,經(jīng)布氏漏斗抽濾，DEAE 用上述PBS洗3次，每次20ml，合并全部濾液，測定蛋白濃度，IgG得率約70%，純度約96%。IgG洛液用0.lmmo1/L，pH9.5碳酸鈉緩沖液稀釋至8mg/ml濃度。522.改良過碘酸鹽法HRP的活化 HRP用水溶解成4mg/ml濃度溶液，每毫升HRP溶液內(nèi)加0.1mol/L NaIO4溶液200l，室溫?cái)嚢?0min?；旌弦恨D(zhuǎn)變成淺黃綠色指

19、示反應(yīng)正常，加1mmol/L，pH4.4乙酸緩沖液(A液含乙酸鈉8.20g/L，B液含乙酸6.0g/L，A液1份與B液2份混合后稀釋10倍) ，于44透析過夜。532.改良過碘酸鹽法HRP-IgG結(jié)合物的制備 在每毫升活化HRP溶液內(nèi)加0.lmol/L pH9.5碳酸鈉緩沖液20l調(diào)節(jié)pH至99.5，隨即與等體積上述純化的IgG溶液混合，置室溫反應(yīng)，時(shí)而搖動之。反應(yīng)2小時(shí)后在反應(yīng)混合液每2ml內(nèi)加新鮮配制的4mg/ml硼氫化納溶液100l，置4 2小時(shí)。加0.1mol/L pH7.4硼酸緩沖液（A液：Na2B4O7l0H2O 9.54g溶解于水250mml；B液：硼酸24.7g溶解于水4L。A

20、液115ml加于B液4L內(nèi)） 4透析過夜。在透析的結(jié)合物溶液內(nèi)加等體積的60%甘油（溶于硼酸緩沖液），必要時(shí)可添加BSA至1%濃度，置4保存。如作冷凍干燥處理，可不必加甘油溶液。542.改良過碘酸鹽法酶結(jié)合物的純化結(jié)合物制備后需要純化以去除游離的酶或抗體。按改良過碘鹽法制備的酶結(jié)合物雖不一定要再純化，但游離酶的存在將使以后測定時(shí)信號與本底比 (P/N)減?。挥坞x的IgG可成為反應(yīng)系統(tǒng)中的競爭性性抑制劑，兩者均會引起靈敏度的下降。因此對于測定靈敏度要求較高的試驗(yàn)，還應(yīng)對酶結(jié)合物作進(jìn)一步分離純化。利用酶結(jié)合物與游離酶或IgG之間的溶解度、電荷和分子量的差別，可采用沉淀法、離子交換層析法和凝膠過濾或

21、透析等方法進(jìn)行分離和純化，以凝膠過濾法較為方便。552.改良過碘酸鹽法沉淀法去除游離HRP HRP分子量小，即使在高達(dá)70%80%飽和度的硫酸銨溶液中仍呈溶解狀態(tài)，但與IgG的結(jié)合物則隨IgG沉淀析出。因此，用此法只能分離游離的HRP而不能去除掉游離IgG。沉淀法為：在酶結(jié)合物溶液內(nèi)加等體積飽和硫酸接溶液，混勻后靜置1小時(shí)，于4 6000rpm離心15分鐘，收集沉淀。沉淀物再用半飽和的硫酸銨溶液洗2次，離心方式如前，最后沉淀物用少量 0.l mol/L PH7.2PBS (含NaCl 0.lmol/L)溶解，并用PBS充分透析。562.改良過碘酸鹽法Sephadex G200凝膠過濾法 操作參

22、見本節(jié)，ALP-IgG結(jié)合物的制備所述。經(jīng)過凝膠分子篩后，可分段收集到游離酶、游離IgG和酶結(jié)合物部分。573.戊二醛（GA）法以戊二醛作為同雙功能交聯(lián)劑制備酶結(jié)合物分為一步法和二步法兩種。一步法除了酶結(jié)合物外，還可形成GA與酶、GA與抗體、酶結(jié)合物進(jìn)一步在GA作用下產(chǎn)生聚合反應(yīng)的不利副產(chǎn)品。所以建議采用二步法制備酶結(jié)合物.583.戊二醛（GA）法HRP的活化 HRP10mg溶解于0.lmol/L pH6.8 PB 0.2ml 內(nèi)，加1%GA 0.15ml，于室溫反應(yīng)18小時(shí)，經(jīng)由0.9% NaCl平衡的 Sephadex G25 柱流竄，或?qū)?.9%NaCl 充分透析除去GA。流出液濃縮至1

23、.0ml。593.戊二醛（GA）法與抗體的結(jié)合 免疫球蛋白5mg（或Fab段多肽25mg）溶于0.5mol/L pH9.5碳酸鈉緩沖液，加于上述已經(jīng)凝膠過濾或透析處理的GA活化HRP溶液內(nèi)(HRP與IgG摩爾比約7:1，與Fab的摩爾比約4:1)，于室溫反應(yīng)2h后，加1mol/L HCl，中和反應(yīng)混合液至pH7.0，加1mol/L賴氨酸0.1ml，于4反應(yīng)2h，以封閉其余活化的基團(tuán)。603.戊二醛（GA）法反應(yīng)混合液于4對0.15mol/LpH7.2 PBS透析過夜。有時(shí)為使HRP活性得以更有效的保護(hù)，可使其先與1-氟-2，4-二硝基苯（DNFB）反應(yīng)，即在上述HRP溶液1.0ml內(nèi)加1%DN

24、FB無水乙醇溶液0.1ml，在室溫反應(yīng)1h。以后操作同前。61二、ALP-IgG結(jié)合物的制備 過碘酸鹽法 戊二醛法 621.過碘酸鹽法ALP的硫酸銨沉淀懸浮液5ml經(jīng)0.3mol/L pH8.0碳酸鹽緩沖液充分透析去除硫酸銨和穩(wěn)定劑。在已經(jīng)透析處理的ALP溶液內(nèi)加1%DNFB無水乙醇溶液0.lml，于室溫反應(yīng)1小時(shí)。加新鮮配制的0.08mol/L NaIO4溶液lm1，于室溫?cái)嚢?0分鐘，加0.16mol/L乙二醇溶液lml，繼續(xù)反應(yīng)1小時(shí)。此活化的ALP經(jīng)0.0lmol/L pH9.5碳酸鹽緩沖液于4透析24小時(shí)，期間至少更換透析液3次。631.過碘酸鹽法將IgG 5mg溶解于0.0lmol

25、/L pH9.5碳酸鹽緩沖溶液，于4對該溶液透析過夜，加于上述透析處理的活化ALP溶液3ml內(nèi)，室溫反應(yīng)3小時(shí)后加硼氫化鈉5mg，攪拌溶解，置43小時(shí)，然后對0.15mol/L pH7.2PBS于4透析24小時(shí)，離心除去沉淀，上清液經(jīng)Sephadex G200柱分離純化。641.過碘酸鹽法 酶結(jié)合物的純化：Sephadex G200約17g懸浮于0.15mol/L pH7.2PBS 750ml內(nèi)，置沸水浴加熱5小時(shí)以加速溶脹和排除凝膠內(nèi)氣泡，冷卻至室溫后裝入100 * 25 cm柱，在凝膠過濾工作溫度下減壓抽掉氣泡，用體積2倍量的PBS平衡。標(biāo)記后的酶結(jié)合物溶液上樣后以與5ml/小時(shí)流速和每管

26、2ml量收集流出液和該P(yáng)BS洗脫液，于403nm波長進(jìn)行監(jiān)測，ALP結(jié)合物應(yīng)存在于第一峰洗脫部分內(nèi)。652.戊二醛法小試管內(nèi)加運(yùn)量ALP硫酸錢沉淀物，離心后倒凈上清液，稱取沉淀物5mg，加含IgG 2mg /ml的上述PBS溶液1.0m1，溶解后裝人透析袋內(nèi)，4對PBS透析過夜，如PBS至1.25ml。662.戊二醛法在透析處理的ALP溶液內(nèi)加25%(v/v)戊二醛溶液10l，混勻，置室溫2小時(shí)，反應(yīng)混合液于4對PBS充分透析，更換透析液5次。再對0.lmol/L pH 7.4Tris-HCl；透析，更換透析液2次。在此透析處理的ALP溶液內(nèi)最后加含1%BSA和0.02%疊氮納的Tris-HC

27、i溶液至4.0ml。必要時(shí)可參照前述有關(guān)方法純化。672.戊二醛法本法除可得到ALP-IgG結(jié)合物外，ALP和IgG也可在GA作用下自聚。用以下方法可避免這種缺點(diǎn)，且反應(yīng)條件溫和，可較好地保持酶和IgG的活性。683.N-琥珀酸胺基-3-(2吡啶基硫代)丙酸酯（SPDP活化法臨用時(shí)稱取SPDP 3mg，加甲醇0.3ml溶解；ALP或HRP用0.2mol/L pH7.5磷酸交聯(lián)緩沖液（PSCB，每升含NaH2PO44H2O 27.6g和Na2HPO4 28.4g）配制成2.0mg/ml溶液，在lml溶液內(nèi)加SPDP甲醇溶液100l，于室溫下攪拌反應(yīng)1小時(shí)，反應(yīng)混合液經(jīng)PSCB平衡的Sephade

28、x G25柱流竄分離掉剩余的SPDP，得到純化的活化ALP或HRP(A)； 693.N-琥珀酸胺基-3-(2吡啶基硫代)丙酸酯（SPDP活化法IgG的活化：IgG用PSCB配成2.0mg/ml溶液，取1ml加SPDP溶液16l，用上述方法反應(yīng)和分離得活化的IgG，在活化的IgG內(nèi)加lmol/L蘇糖醇(cithiothrcitol，DTT)溶液至終濃度為50mmol/L，室溫反應(yīng)15分鐘后分離純化如前（B）；A與B混合，室（溫?cái)嚢璺磻?yīng)58小時(shí)，加碘乙酰胺（iodoacetamide）至終濃度為30mmol/L，室溫反應(yīng)15分鐘，使未反應(yīng)的疏基烷基化而被封閉，經(jīng)Sephadex G25柱或Seph

29、adex G200柱層析分離純化。703.N-琥珀酸胺基-3-(2吡啶基硫代)丙酸酯（SPDP活化法活化的酶或IgG經(jīng)透析除去游離的SPDP也是可行的，但時(shí)間較長。用DTT還原活化的酶或IgG都是可以的，目的是使某一配體有活潑的巰基，利于兩者的交聯(lián)反應(yīng)。71制備酶結(jié)合物的方法很多，即使同一方法，不同研究者或使用者的具體操作也不盡相同。但任何標(biāo)記方法的基本要求是：快速、簡便、產(chǎn)生的結(jié)合物分子結(jié)構(gòu)重演性良好( 酶與被標(biāo)記物質(zhì)的克分子比的批間均一性 )、結(jié)合物比例高而游離物比例小( 高得率)、結(jié)合物仍保持良好的游離酶活性及被標(biāo)記物的免疫反應(yīng)性等。72第二節(jié) 酶結(jié)合物的穩(wěn)定化高濃度的結(jié)合物較為穩(wěn)定，而

30、工作濃度稀釋的結(jié)合物的穩(wěn)定化處理較為困難。酶結(jié)合物經(jīng)冷凍干燥處理后較為穩(wěn)定，但使用時(shí)需復(fù)溶，且可引起誤差。以下介紹液體酶結(jié)合物穩(wěn)定化處理法。73一、基本要求液態(tài)酶結(jié)合物的穩(wěn)定化基本要求是：盡可能在結(jié)合物的工作濃度保持其穩(wěn)定；生物試劑一般在冰箱溫度保存，但應(yīng)能在室溫條件下運(yùn)輸；在試劑盒效期內(nèi)其pH和濁度等也至是過規(guī)定指標(biāo)；活性下降不低于原值的90%。741.底物穩(wěn)定化法HRP在氫供體為氫受體同時(shí)存在時(shí)發(fā)生有效顯色反應(yīng)，其主要作用在于催化氫供體的分解。在氫供體單獨(dú)存在時(shí)不發(fā)生顯色反應(yīng)，但適度的氫供體有一定的保護(hù)酶活性的作用。用于穩(wěn)定HRP的底物有中氨基安替吡啉（AAT）、四甲基聯(lián)苯膠(TMB)和鄰

31、苯二胺（OPD）。分為ATT穩(wěn)定法和TMB穩(wěn)定法75AAT穩(wěn)定法 (舉例)山羊癌胚抗原（CEA）抗體(IgG)與HRP結(jié)合，溶解于含20%正常山羊血清的0.2mol/L pH6.5 PBS （內(nèi)含0.5g/L柳硫汞），終濃度0.1mg/L ；再加AAT至0.2g/L，經(jīng)0.22m孔徑濾膜過濾除菌于37下保存7和14天后，其活性分別為100%和77%，未加AAT穩(wěn)定劑的對照組只分別保留2%和0%76TMB穩(wěn)定法抗雌三醇（E3）單克隆抗體與HRP的結(jié)合物溶解于新鮮配制的含0.2%BSA和0.02%Tween20乙酸納-檸檬酸緩沖液成為含2mol/L HRP的溶液，加TMB達(dá)0.1mg/ml，除菌過

32、濾，作為實(shí)驗(yàn)組。置37 0天、1天和16天后，測定其A650nm值作為穩(wěn)定性指標(biāo)，以未加TMB穩(wěn)定劑的作為對照組。兩組在各天的A650nm值分別為0.463，0.427，0.413和0.486，0.08和0。77TMB穩(wěn)定法深入研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)TMB和H2O2同時(shí)存在并加有環(huán)化糊精（cyclodextrin）時(shí)可以達(dá)到更佳的穩(wěn)定效果。TMB溶解于二甲亞砜（DMSO）內(nèi)成為10mg/ml溶液，用含有0.004% H2O2 的0.1%mol/L pH6.0乙酸鈉-檸檬酸緩沖液稀釋100倍，依此溶液稀釋抗E3 IgG-HRP結(jié)合物成如上濃度，加環(huán)化糊精至0.25%（w/v）濃度，除菌過濾。酶結(jié)合物在50穩(wěn)

33、定保存7天，在室溫可穩(wěn)定一月余。782.親水物質(zhì)穩(wěn)定法親水的PEG對酶結(jié)合物分子蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)有保護(hù)作用，以分子量60008000者較佳。此外早已發(fā)現(xiàn)多價(jià)陽離子，如Ca2+和Mg2+等與HRP的輔基血紅素（hemin）的穩(wěn)定性相關(guān)。792.親水物質(zhì)穩(wěn)定法抗IgG抗體與HRP的結(jié)合物溶解于0.1mol/L pH6.0 PBS內(nèi)成為0.1mg/ml濃度溶液，加丙酸鈣至0.1%和PEG 8000至3%濃度，除菌過濾。在37至少可穩(wěn)定保存1周。80 第三節(jié) 底物的穩(wěn)定化 底物也是EIA試劑盒的重要組份之一。 測定 HRP活性的底物由氫供體和氫受體兩種試劑組成。 常用的受氫體為H2O2，易揮發(fā)且不穩(wěn)定。另有

34、兩種氫受體雖然不如H2O2應(yīng)用普遍，但也為某些試劑盒采用。葡萄糖氧化酶（ GO ）和底物耦合系統(tǒng)作為H2O2來源，應(yīng)為 GO 催化葡萄糖降解，可產(chǎn)生葡萄糖和 H2O2 。 采用有機(jī)過氧化物，可與OPD等一起軋成多孔片劑。8182第四章 快速酶免疫測定因相酶免疫測定除通常以微板或小珠作為載體的ELISA外，也多有應(yīng)用膜載體的。最普通的是斑點(diǎn)ELISA（Dot-ELISA），與ELISA檢測方法完全相同。此外利用膜的多孔性、可濾過性及毛細(xì)管作用等特性，發(fā)展了多種形式的測定，尤其是快速測定，其中己被認(rèn)可的方法可歸納為浸測式試劑條法、滲濾法和層析法。83第一節(jié) 浸測式試劑條法試劑條以濾紙、膜或塑料等制

35、成的棒Stick、漿狀(paddle)物等為載體，按其測試操作和用具形狀，可把試劑余（strip）反應(yīng)區(qū)或塊（pad）插入反應(yīng)混合液，取出后根據(jù)反應(yīng)塊或溶液的顯色情況來判斷結(jié)果，因此稱為浸測式試劑條法。 84一、原 理 以hCG試紙條為例抗bhCG 單抗經(jīng)親和素-生物素系統(tǒng)結(jié)合于濾紙，此試紙條與被測樣品及抗a-HCG 酶結(jié)合混合反應(yīng)后，HCG與抗b-hCG-IgG和酶結(jié)合物形成雙夾心復(fù)合物而固定于試紙，洗滌后把試劑條插入酶底物溶液，據(jù)該底物是非水溶性的或可溶性的區(qū)別，分別觀察試紙或溶液的顯色強(qiáng)度，既可肉眼觀象來判定結(jié)果，也可分別用反射式比色計(jì)或分光光度計(jì)作較精確的比色測定。85二、試劑的制備1

36、. 濾紙的處理2. 生物素化抗hCG IgG的制備 3. Bacp-IgG與固定了親和素載體的結(jié)合4. HCG陰性對照紙片的制備 5. 試紙條的裝配 6. 酶結(jié)臺物的制備 7. 底物的配制 8. 試劑盒的組成和裝配 86 1.濾紙的處理 濾紙的活化 親和素和活化載體的化學(xué)交聯(lián)結(jié)合 87濾紙的活化Whatman 541號濾紙浸于蒸餾水中5分鐘，取出吸干后浸于約3%溴化氰水溶液內(nèi)， 攪動下滴加1mol/L NaOH溶液，維持該溶液pH 1010.5 ，如此進(jìn)行30min?；罨臑V紙經(jīng)0.001mmol/L NaHCO3溶液充分洗滌后，再用蒸餾水洗2次，依次浸人丙酮濃度各為 25，50和 75的溶液

37、內(nèi)各 5分鐘，再用丙酮洗，晾干后置 4oC備用。88親和素和活化載體的化學(xué)交聯(lián)結(jié)合（1）親和素的活化：溶解親和素50mg于0.1mol/L HCl 溶液1.5ml，加預(yù)冷的0.2mol/L pH9.0硼酸緩沖液 73.5sml。另溶解琥珀酸酐 30ml于無過氧化物的二惡烷（dioxane）0.9ml，加人上述親和素溶液內(nèi)。攪拌1時(shí)后，把反應(yīng)混合液裝入透析袋，在10%乙酸溶液中透析過液。離心去除沉淀，上清液濃縮、測定蛋白濃度，等量分裝后，冷凍干燥備用。 （2）活化親和素的固相化：用0.1molL pH7.0磷酸緩沖液（PB）溶解活化親和素成0.10mg/ml，此溶液4ml加PB 40ml稀釋?；?/p>

38、化的紙片1g浸于此溶液內(nèi)，室溫輕輕攪拌反應(yīng)1小時(shí)后用 0.5mmolL NaHCO3溶液洗 3次，每次浸 10分鐘。吸干后再浸于 40ml含 5mmolL 乙醇胺的100mmolL Na2CO3溶液內(nèi)，室溫封閉1小時(shí)，洗滌如前。892.生物素化抗hCG IgG的制備 生物素-N-羥基琥珀酰亞胺（BNHS）的制備 生物素-N-e-氨基己酸-N-羥基琥珀酰酯（BacpNHS）的制備 90生物素-N-羥基琥珀酰亞胺（BNHS）的制備生物素0.6g溶解于熱的二甲酰胺 （DMF） 10ml， 冷至室溫。N-羥基琥珀酰亞胺（NHS） 0.6g溶解于 DMF 2.0ml內(nèi)，并加交聯(lián)劑二環(huán)已烷碳化二亞胺（DH

39、CD）0.8 g，攪拌下把此溶液加于含生物素的DMF溶液內(nèi)，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)過夜，過濾除去產(chǎn)生的二環(huán)己烷基脲，濾液經(jīng)適當(dāng)真空濃縮。在濃縮液內(nèi)加適量乙酸使合成的BNHS沉淀析出、過濾，沉淀物用乙酸洗2次，再用異丙醇洗一次，約得產(chǎn)物（BNHS）1g。也可用商品 BNHS。91生物素-N-e-氨基己酸-N-羥基琥珀酰酯（Bacp-NHS）的制備（1）生物素-N-e-氨基己酸（BACA）的合成： BNHS 1.0 g溶解于熱的 DMF 6.0 ml，冷至室溫。e-氨基己酸(6-ACA)0.5g 溶于0.1mol/L NaHCO3溶液6.0ml。攪拌反應(yīng) 4小時(shí)，加適量 1適量HCI溶液酸化，至不再析出沉淀

40、物。分離的沉淀物用該HCl溶液洗滌后懸溶于適量乙酸內(nèi)，抽干后置于放有NaOH的干燥器內(nèi)真空干燥，可得產(chǎn)物（BACA）約0.79g。 （2）Bacp-NHS的合成：BACA 0.36 g 溶解于 N-甲基吡咯烷酮7.0ml內(nèi)，并相繼溶入 NHS 0.14g和 DHCD 0.25g，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)過夜，如前過濾掉沉淀物。在濾液中慢慢加乙醚（約50ml）至無淀物析出，過濾收集沉淀，用乙醚充分洗滌后置于具有五氧化二磷（P2O5）的干燥器內(nèi)真空干燥，約得產(chǎn)物Bcap NHS 0.32g。（3）Bcap NHS與親和層析純化抗-hCG lgG結(jié)合： lgG 用20rnmolL pH7 .4 PB配制成約1m

41、gml溶液，BNHS或Bcap NHS 250mg溶于DMF20ml內(nèi)，攪拌下加入1ml IgG溶液內(nèi)，室溫繼續(xù)攪拌反應(yīng)6小時(shí)。使用BcapNHS和BNHS的區(qū)別是前者可使生物系與IgG之間有個(gè)6碳長度的手臂，即形成 B-cap-IgG結(jié)合物，便于抗體活性的充分發(fā)揮。923.Bacp-IgG與固定了親和素載體的結(jié)合Bacp-IgG用0.lmolL pH 7 .4 PBS（內(nèi)含1 BSA，0.05Tween20）配成0.5mg/ml溶液 l.0ml，再加該 PBS 40ml稀釋。在此溶液內(nèi)浸人固定了親和素的紙片1g，室溫輕輕攪拌反應(yīng) 2h。在Bacp-IgG與親和素結(jié)合而被固定于載體的同時(shí)BSA

42、和 Tween 20起到表面稀釋劑和封閉的作用。用含 0.05Tween 20的 0 .1 molL。PH7. 4 PBS 洗滌后吸干水份，放入置有P2O5的干燥器內(nèi)，干燥后即成免疫吸附劑。成為親和素-生物素復(fù)合物（ABC）系統(tǒng)，具有放大作用的間接包被的一個(gè)代表性實(shí)例。934.hCG陰性對照紙片的制備用含1%BSA和 0. 05Tween 20的 0. l molL pH 7. 4 PBS封閉紙片 2h，或用 Bcap-BSA代替前抗Bcap IgG，按上法操作后一方法較嚴(yán)密。945.試紙條的裝配將有一定硬度的尼龍或其它塑料片裁切成一定規(guī)格（例如 6 70mm）的基膜條，如上制成的免疫吸附劑試

43、紙和陰性對照試紙也切成相應(yīng)規(guī)格（如 6 6mm）的小方塊，用粘合劑，如Quickfix等把以上兩種試紙緊鄰貼于基膜條下端。956.酶結(jié)合物的制備用抗a-hCG及堿性磷酸酶或半乳糖苷酶，以前述ABC系統(tǒng)或常規(guī)過碘酸法等制成結(jié)合物均可。酶與hCG克分子比以 5:l為宜。967.底物的配制（參見本章第3節(jié)）。 978.試劑盒的組成和裝配試劑盒由試紙條、酶結(jié)合物、底物、hCG陽性和陰性控制品以及簡易定量從加液器如塑料管等組成。98三、測定操作在裝有酶結(jié)合物的小試管內(nèi)加人定量（一定滴數(shù)或至刻線）的尿液樣品，混勻，插入試紙使反應(yīng)塊浸沒，室溫放置一定時(shí)間（5分鐘左右）。取出后用自來水沖洗，并用吸水紙吸干。再

44、浸入底物溶液一定時(shí)間后取出，肉眼觀察結(jié)果。試劑塊與陰性對照塊有任何色差，指示hCG陽性，試劑塊顯色快而深提示 hCG濃度高。若附有比色板（color reference pad），比較后可作出半定量判斷。也可插人簡易反射式比色計(jì)作較正確的定量測定。99 四、發(fā)展前景近年發(fā)展了免疫測定多層試劑條（multi-layer strip），即根據(jù)某項(xiàng)免疫測定的原理和步驟，將其各步所需的試劑如抗原或抗體、酶結(jié)合物、底物等依次分層澆鑄于透明塑料基膜，形成極薄的分隔試劑膜層。各層之間為半透膜。只能使一定大小分子的物質(zhì)通過，可對游離的配體與其結(jié)合物等分離。與顯色反應(yīng)層相鄰的反光層起到反光和聚光作用，便于觀察或

45、測定。表面保護(hù)層和樣品處理層除可維持試劑穩(wěn)定性外，還可使紅細(xì)胞與血清分離，并使定量血清向下滲透和反應(yīng)。 100四、發(fā)展前景此類試劑條的特點(diǎn)是： （1）使復(fù)雜的操作合并為只需加樣一步操作； （2）可用血漿、血清和微量全血樣品；（3）既可肉眼觀察和判斷結(jié)果又可用儀器作精確定量測定。本法也可適用于熒光和化學(xué)發(fā)光分析。因大分子蛋白抗原和抗體通透性較差，目前主要用于半抗原及小分子量蛋白質(zhì)測定。但其發(fā)展?jié)摿Υ??？逻_(dá)和富士公司等以其特有技術(shù)優(yōu)勢已開發(fā)出多層免疫試劑條系列產(chǎn)品和配套儀器應(yīng)市。101四、發(fā)展前景各種形式的免疫試劑條除早已用于妊娠和排卵測定外，現(xiàn)已用于藥物、糧食和食品中黃曲酶素及殘留農(nóng)藥、鴉片和嗎

46、啡等毒品以及某些環(huán)境因素等的現(xiàn)場檢測。102第二節(jié) 酶免疫滲濾法酶免疫滲濾法（immunofiltration）根據(jù)測定方法可分直接過濾法和免疫濃縮法兩類，前者用膠乳作為試劑，后者基于親和層析的原理。美國 Hybritech 公司早在 1985年已生產(chǎn)測定 hCG的試劑盒。103一、酶免疫濃縮法檢測模式為雙抗體夾心法。因多孔膜可固定較多量抗體，并可對樣品分析物起濃縮作用，使反應(yīng)趨于假一級反應(yīng)，提高反應(yīng)速率，縮短測定時(shí)間。反應(yīng)裝置結(jié)構(gòu)：試劑盒的重要組分之一。其中具有免疫反應(yīng)性的膜上已吸附有抗a-hCG -IgG。104二、試劑制備 1. 固定抗 a-hCG IgG膜的制備 2. 抗hCG-IgG

47、-ALP結(jié)合物的制備 3. 底物溶液的配制 4. 洗滌液的配制 5. 測定操作105 1. 固定抗 a-hCG IgG膜的制備（1）尼龍膜的活化 尼龍66具有表面酰胺基，活化方法如下：與濃縮杯圓筒相吻合的尼龍圓片（disc）浸于 3.5rnolL HCl溶液約 24h時(shí)，取出后浸于蒸餾水中約 5分鐘，取出吸干后再浸于水，如此反復(fù)洗（約8次）至呈中性后，浸于0.1mol/L pH 9.5 Na2HCO3 溶液約5分鐘，再用0.05mol/L pH7.2 PBS洗滌如前，吸于后浸于4碳化二亞胺水溶液或8戊二醛乙酸溶液約1小時(shí)，取出后用PBS洗滌如前，吸干后待用。所有操作在室就進(jìn)行，適當(dāng)攪拌或翻動以

48、防薄膜相互粘貼而反應(yīng)不充分。106 1. 固定抗 a-hCG IgG膜的制備 （2）抗a-hCG與膜的化學(xué)交聯(lián)結(jié)合 按滴配實(shí)驗(yàn)結(jié)果，用上述PBS把單抗IgG稀釋成最佳包被濃度，在活化膜片中心點(diǎn)加約2m1，形成的0.2cm2的圓點(diǎn)，且室溫30分鐘，干燥后浸于0.1（w/v）賴氨酸或聚賴氨酸的上述 PBS溶液內(nèi)，于室溫封閉 1h，用 PBS洗滌，干燥后置4保存?zhèn)溆?。也可將單抗直接點(diǎn)加在硝酸纖維（NC）膜上，NC對蛋白質(zhì)的吸附性很強(qiáng)，也可達(dá)到同樣效果。反應(yīng)裝置的裝配 ：在外殼圓筒內(nèi)填裝吸水材料后再裝上圓盤；把膜貼于圓盤上；為克服非特異性反應(yīng)，必要時(shí)再復(fù)以透明的樣品濾膜；旋緊上蓋。檢定合格后作氣密性包

49、裝。1072.抗hCG-IgG-ALP結(jié)合物的制備參見本章第1節(jié)和第4節(jié)有關(guān)部分。1083.底物溶液的配制磷酸吲哚（indoxylphosphate）18.0mg溶解于乙醇2ml后加pH9.2二乙醇胺緩沖液（DEA）至 100ml。1094.洗滌液的配制pH8. 0 Tris 緩沖鹽水，含0.1% Triton X-100及0. lNaN3。1105.測定操作在反應(yīng)裝置內(nèi)加尿液5滴（250ml ）或至刻線，待流完后加酶結(jié)合物試劑3滴，濾過后稍待片刻（3060秒鐘 ），以便形成牢固的雙夾心物。加洗滌液至刻線， 濾過后加底物溶液3滴，陽性反應(yīng)在2 分鐘內(nèi)出現(xiàn)肉眼可見的藍(lán)色斑點(diǎn)。111三、內(nèi)在質(zhì)控所

50、謂內(nèi)在質(zhì)控是指在反應(yīng)膜上帶有指示試劑和反應(yīng)有效性的質(zhì)控斑點(diǎn)。對于用小鼠單抗制備的試劑之最簡便的質(zhì)控辦法是在膜上點(diǎn)有抗a-hCG抗體的鄰近處點(diǎn)加抗鼠抗體。但必須指出這種質(zhì)控措施對于定性試驗(yàn)是可以的，但用于定量測定尚不夠完善。112三、內(nèi)在質(zhì)控對定量試驗(yàn)的內(nèi)在質(zhì)控總的要求是既要客觀反映免疫化學(xué)，即抗原-抗體間的反應(yīng)（包括特異性和非特異性反應(yīng)），又要真實(shí)反映酶促反應(yīng)的動力學(xué)。具體要求是： （1）被固相抗體捕獲的抗原量應(yīng)與被測樣品內(nèi)抗原總量成正比，而與樣品濃度無關(guān)； （2）酶結(jié)合物和分析物-固相抗體間形成復(fù)合物的反應(yīng)以及作為固相內(nèi)在質(zhì)控的抗體間的反應(yīng)都須符合假一級反應(yīng)動力學(xué)， 而且它們的速率常數(shù)基本相

51、同； （3）酶底物的轉(zhuǎn)換必須正比于反應(yīng)時(shí)間。符合這3個(gè)條件時(shí)，與被測物反應(yīng)相關(guān)產(chǎn)生的信號和酶結(jié)合物與固相內(nèi)控抗體間反應(yīng)產(chǎn)生的信號強(qiáng)度才能建立正比關(guān)系。根據(jù)這些原則設(shè)計(jì)的定量試驗(yàn)的內(nèi)在質(zhì)控應(yīng)包括定量陽性質(zhì)控和陰性質(zhì)控。113三、內(nèi)在質(zhì)控 1. hCG定量陽性質(zhì)控試劑的制作和設(shè)定 2 . hCG陰性控制試劑的制作和設(shè)定 3 hCG定量陽性質(zhì)控點(diǎn)（陽控點(diǎn)）和陰 性質(zhì)控點(diǎn)（陰控點(diǎn)）的制作 1141.hCG定量陽性質(zhì)控試劑的 制作和設(shè)定用標(biāo)記抗 hCG lgG同樣的 ALP作為免疫原，免疫同種的小鼠，制取抗 ALP單抗。分離和純化抗 ALP- lgG，用0.1mol/L。pH9.0甘氨酸緩沖液（GBS）

52、稀釋至合理致敏濃度，即該濃度IgG致敏膠乳微粒后，與酶結(jié)合物和底物反應(yīng)產(chǎn)生的顯色強(qiáng)度與樣品中含有25lU hCG/L時(shí)反應(yīng)的顯色程度相當(dāng)，而陰性控制品不產(chǎn)生任何顯色反應(yīng)。在已經(jīng)調(diào)節(jié)好濃度的該抗體GBS溶液8.5體積內(nèi)，加10(w/v) 聚苯乙烯膠乳1.5體積，混勻后攪拌下吸附 2h， 以該 GBS洗 3次后用含 0.05% NaN3的 0.1molL pH 8.6 GBS懸浮最后沉淀物至原反應(yīng)混合物體積，即成1.5（w/v）抗ALP致敏膠乳試劑。1152 .hCG陰性控制試劑的 制作和設(shè)定與 hCG測定系統(tǒng)無關(guān)的任何單抗都可使用。1163.hCG定量陽性質(zhì)控點(diǎn)（陽控點(diǎn)） 和陰性質(zhì)控點(diǎn)（陰控點(diǎn)）

53、的制作將以上hCG陽性和陰性控制試劑分別點(diǎn)加在固定了抗hCG的膜上的適當(dāng)位置，共形成三個(gè)斑點(diǎn)，加標(biāo)本反應(yīng)后，結(jié)果有三種解釋。117（1）三個(gè)斑點(diǎn)均無顯色反應(yīng)，試驗(yàn)無效。其原因可能為：a.操作不當(dāng)，尤其是漏加樣品或某一試劑，或加液量過少；b.排除了前一情況后則為試劑盒質(zhì)量問題，多為酶結(jié)合物或底物失效。（2）三個(gè)斑點(diǎn)都顯色：陰性控制點(diǎn)較深，指示樣品內(nèi)有非特異性物質(zhì)或洗滌不充分。118（3）三個(gè)斑點(diǎn)雖都顯色，但陰控點(diǎn)顏色很淺，且陽控點(diǎn)顯色明顯深于陰控點(diǎn)，標(biāo)本反應(yīng)點(diǎn)亦顯色，指示操作正確。此時(shí)標(biāo)本反應(yīng)可能有以下情況：A.樣品反應(yīng)顯色程度等于或深于陽控點(diǎn)，指示其hCG呈陽性反應(yīng)，含量等于或大于25 lUL

54、 ；B.樣品反應(yīng)顯色程度淺于陽控點(diǎn)但深于陰控點(diǎn)，指示 hCG陽性，但其濃度小于 25lUL。C.陰控點(diǎn)無任何顯色反應(yīng)，陽控點(diǎn)有顯色反應(yīng)，被測樣品點(diǎn)呈不同程度顯色反應(yīng)，這是理想的反應(yīng)結(jié)果。D.陽控點(diǎn)是顯色，其余兩個(gè)斑點(diǎn)均無顯色，指示標(biāo)本hCG陰性。119近年來文發(fā)展了兩個(gè)測定方和兩個(gè)質(zhì)控點(diǎn)的四點(diǎn)法免疫濃縮杯測定法及其配套簡易儀器（ICON reader），即由兩個(gè)測定點(diǎn)的均值經(jīng)兩點(diǎn)校正后可得到更精確的結(jié)果。除用于測定hCG外，已形成了測定血清肌酸磷酸激酶同功醇（CK-MB）、藥物和淄體激素等快速檢驗(yàn)商品試劑。內(nèi)在質(zhì)控除可用最簡單的圓點(diǎn)表示外，可以作成“十域“一”號，或“I”線狀等。反應(yīng)裝置也由最

55、早的小杯形發(fā)展成扁平方塊和矩形等。因此有各種商品名稱，但基本原理相似。120第三節(jié) 直接過濾法直接過濾法中用乳膠作為載體，而利用膜來分離結(jié)合物和游離物，懸浮狀態(tài)的乳膠在近于液相狀態(tài)下與待檢物及酶結(jié)合物反應(yīng)。反應(yīng)混合物經(jīng)過濾器過濾，反應(yīng)形成固定的免疫復(fù)合物的乳膠因不能通過濾膜而留在濾膜表面。和底物反應(yīng)后，在膜表面形成可見得顯色反應(yīng)，顯色快慢和強(qiáng)度與被測物濃度成正相關(guān)性。加拿大 Murex公司等已有單價(jià)測定系統(tǒng) （single use detection system，SUDS）的系列試劑，用于檢測抗HIV抗體等。試劑盒主要由濾器和試劑兩部份組成，前者結(jié)構(gòu)大致與免疫濃縮法中反應(yīng)裝置相似，但股上無固

56、相配體121 一、試劑的制備1. 抗hCG lgG致敏膠乳的制備 抗hCG多抗或單抗IgG及聚苯乙膠乳 （0 20.8 mm），用0.1mol/LpH8.0 GBS稀釋成合約1.0mgml IgG和25% 膠乳固體終濃度的反應(yīng)混合物，室溫?cái)嚢璺磻?yīng) 3h時(shí)后，以該 GBS洗 4次，最后沉淀物用含 0.1%NaN3的 GBS 懸浮成含約0.5%（w/v）的致敏膠乳試劑。2.酶標(biāo)記抗 hCG結(jié)合物的制備 制備方法見前。3.酶底物溶液制備 同前。4.濾膜處理 為使膜能順利地游過反應(yīng)混合物中的游離蛋白質(zhì)，特別是酶結(jié)合物，以免產(chǎn)生非特異性反應(yīng)，可采用0.45mm的玻璃纖維膜，浸于含0.5%明膠或0.5%明

57、膠或0.51.0 BSA的0.1mol/L pH6. 0PBS內(nèi)預(yù)處理（室溫 2小時(shí)），洗滌干燥后裝配成濾器。122二、測定操作在濾器膜上先加蒸餾水或生理鹽水5 滴（250ml），使膜孔潤濕和暢通。在小試管或微板孔內(nèi)加尿液和免疫膠乳試劑各一滴，混合后在室溫反應(yīng)約 2min。再加酶結(jié)合物1滴，混勻反應(yīng) 2min，將混合液全部倒于濾膜上。用水或鹽水洗滌后加底物溶液。稍等片刻，肉眼觀察或比色測定結(jié)果。全部過程約 5 分鐘。美國 Abbott 公司對本方法作了改進(jìn)，把膠乳鑲嵌在膜孔中， 利用膠乳的高吸附性能和膜分離的簡易性， 提高了檢測的敏感度和速度， 其產(chǎn)品稱為Testpack 的定性試劑盒和定量測

58、定的 IMX，IDX和AXSTM等系統(tǒng)。 123第二十章 均相酶免疫測定均相免疫測定是指在溶液內(nèi)進(jìn)行的抗原抗體反應(yīng)。是一種不必將游離的與結(jié)合的標(biāo)記物加以分離的免疫測定方法。早在70年代初美國Syva公司便已研究成檢測激素的酶擴(kuò)大免疫測定技術(shù)(enzyme multiplied immunoassay techniques ，EMIT )，并制成相應(yīng)的試劑盒，從而奠定了均相免疫測定的基礎(chǔ)，并使酶免疫測定最早得以推廣使用。均相酶免疫測定靈敏度低于非均相酶免疫測定，可用發(fā)光底物等方法提高其靈敏度，但需用特殊儀器設(shè)備。在均相測定中國無分離和洗滌步驟，直接就反應(yīng)混合液對反應(yīng)信號及其強(qiáng)度進(jìn)行測定，操作簡便

59、、省時(shí)，依然是免疫測定方法租試劑研究開發(fā)的熱點(diǎn)之一。124除EMIT外，現(xiàn)已發(fā)展了底物標(biāo)記：熒光免疫測定(substrate-labeled f!uorence irnrnunoassay，SLFIA)輔基標(biāo)記免疫測定( prosthetic group labeled irnmunoassay，PGLIA)抑制劑標(biāo)記免疫測定(inhibitor labeled immunoassay，ILIA)克隆化酶供體免疫測定(cloned enzyme donor immnunoassay，CEDIA)。125第一節(jié) 酶擴(kuò)大免疫測定技術(shù) (EMIT)一、原理酶標(biāo)記抗原和被測樣品中的抗原與有限量的抗體競

60、爭性結(jié)合，酶標(biāo)記抗原與抗體形成復(fù)合物后，酶因空間位阻作用而失活，而游離的酶標(biāo)記抗原仍具有酶活性，可催化底物反應(yīng)，產(chǎn)生可測的信號。126EMIT試劑盒有被測物（半抗原或抗原）與酶標(biāo)記結(jié)合物、特異性抗體和酶底物組成?，F(xiàn)行EMIT主要適用于測定半抗原。葡萄糖-6-磷酸脫氫酶（G6PDH）、Gal、蘋果酸脫氫酶(MDH)和溶菌酶(LYZ)等都可用作EMIT的標(biāo)記酶，但LYZ作為標(biāo)記酶時(shí)，對尿液樣品產(chǎn)生較強(qiáng)的本底反應(yīng)。127酶結(jié)合物與抗體反應(yīng)后，酶活性被抑制的程度是判斷該結(jié)合物質(zhì)量的重要指標(biāo)。這又與酶的選擇及酶與半抗原或抗原合適的克分子比等有關(guān)。EMIT已用于數(shù)十種分析物的測定，現(xiàn)以甲狀腺素測定試劑盒制