臨床免疫學(xué)與檢驗(yàn)：第二十二章 金免疫技術(shù)

1、第二十二章 金免疫技術(shù)colloidal gold immunoassay technique金免疫技術(shù)（colloidal gold immunoassay technique）是一種以膠體金作為標(biāo)記物的免疫標(biāo)記技術(shù)。1970s由Faulk和Taylor始創(chuàng)，最初用于免疫電鏡技術(shù)。金免疫技術(shù)用于: 免疫組織化學(xué)染色; 金免疫測定第一節(jié) 膠體金與免疫金的制備一、膠體金特性及其制備二、免疫金的制備三、免疫金的保存一、膠體金特性及其制備1.膠體金的結(jié)構(gòu) 2.膠體金性狀3.膠體金的制備 4.膠體金鑒定 5.膠體金保存 6.注意事項(xiàng) 1.膠體金的結(jié)構(gòu)膠體金（colloidal gold）也稱金溶膠（g

2、old solution），是由金鹽被還原成原金后形成的金顆粒懸液。 膠體金顆粒由一個(gè)基礎(chǔ)金核（原子金Au）及包圍在外的雙離子層構(gòu)成，緊連在金核表面的是內(nèi)層負(fù)離子（AuC12），外層離子層H+則分散在膠體間溶液中，以維持膠體金游離于溶膠間的懸液狀態(tài)。膠體金顆粒的基礎(chǔ)金核并非是理想的圓球核，較小的膠體金顆粒基本是圓球形的，較大的膠體金顆粒（一般指大于30nm以上的）多呈橢圓形。在電子顯微鏡下可觀察膠體金的顆粒形態(tài)。2.膠體金性狀（1）膠體金一般性質(zhì)： 膠體金顆粒大小多在1100nm，微小金顆粒穩(wěn)定地、均勻地、呈單一分散狀態(tài)懸浮在液體中，成為膠體金溶液。膠體金因而具有膠體的多種特性，特別是對電解質(zhì)

3、的敏感性。（2）膠體金的顏色和光吸收性：對同一種物質(zhì)的水溶膠金顆粒來說，粒子大小不同，顏色亦不同：膠體金顆粒在520nm之間，吸收波長520nm，呈葡萄酒紅色。膠體金顆粒2040nm之間吸收波長530nm，液體為深紅色，60nm的金溶液主要吸收波長600nm，金溶液呈蘭紫色，若離心去掉較大的金顆粒，溶膠呈紅色。根據(jù)這一特點(diǎn)，用肉眼觀察膠體金的顏色或吸收峰波長大小可粗略估計(jì)金顆粒的大小。3.膠體金的制備（1）制備原理 向一定濃度的金溶液內(nèi)加入一定量的還原劑使金離子變成金原子，形成金顆粒懸液。目前常用的還原劑有：白磷、乙醇、過氧化氫、硼氫化鈉、抗壞血酸、枸櫞酸鈉、鞣酸等。（2）操作要點(diǎn) 最常用的制

4、備方法為檸檬酸鹽還原法。 表22-1 四種粒徑膠體金的制備及特性膠體金粒徑（nm）1檸檬酸三鈉加入量（ml）*膠體金特性呈色max16.002.00橙色518nm24.501.50橙紅522nm41.001.00紅色525nm71.500.70紫色535nm4.膠體金鑒定制好高質(zhì)量的膠體金卻也并非易事?？捎梅止夤舛扔?jì)掃描max來估計(jì)金顆粒的粒徑。制備的膠體金最好作電鏡觀察，并選一些代表性的作顯微攝影，可以比較精確地測定膠體金的平均粒徑。 良好的膠體金應(yīng)該是清亮透明的，若制備的膠體金混濁或液體表面有漂浮物，提示此次制備的膠體金有較多的凝集顆粒。5.膠體金保存膠體金在潔凈的玻璃器皿中可較長時(shí)間保存

5、，加入少許防腐劑（如0.02NaN3）可有利于保存。6.注意事項(xiàng) （1）氯金酸易潮解，應(yīng)干燥、避光保存。（2）氯金酸對金屬有強(qiáng)烈的腐蝕性，因此在配制氯金酸水溶液時(shí)，不應(yīng)使用金屬藥匙稱量氯金酸。（3）用于制備膠體金的蒸餾水應(yīng)是雙蒸餾水或三蒸餾水，或者是高質(zhì)量的去離子水。（4）用以制備膠體金的玻璃容器必須是絕對清潔的，用前應(yīng)先經(jīng)酸洗并用蒸餾水沖凈。最好是經(jīng)硅化處理的，硅化方法可用5二氯甲硅烷的氯仿溶液浸泡數(shù)分鐘，用蒸餾水沖凈后干燥備用。二、免疫金的制備免疫金（immunogold）是指膠體金與抗原（抗體）的結(jié)合物,在免疫組織化學(xué)技術(shù)中，習(xí)慣上要稱之為金探針。1.制備原理膠體金顆粒表面帶負(fù)電荷，與蛋

6、白質(zhì)的正電荷基團(tuán)間靠靜電力相互吸引，達(dá)到范德華引力范圍內(nèi)即形成牢固的結(jié)合,同時(shí)膠體金顆粒的粗糙表面也是形成吸附的重要條件。因此環(huán)境pH和離子強(qiáng)度是影響吸附的主要因素，其他如膠體金顆粒的大小、蛋白質(zhì)的分子量及蛋白質(zhì)濃度等也會影響蛋白質(zhì)的吸附2.技術(shù)要點(diǎn)（1）膠體金溶液的pH值調(diào)整 用K2CO3或 HCl溶液調(diào)節(jié)膠體金溶液的pH至選定 值。（2）蛋白質(zhì)最適標(biāo)記量的確定（3）標(biāo)記過程 在電磁攪拌下將1/10體積的合適濃 度的蛋白質(zhì)溶液加于膠體金溶液中，反應(yīng)一定 時(shí)間后加入 BSA并調(diào)整pH至8.5，放置室溫繼 續(xù)反應(yīng)數(shù)分鐘。（4）離心分離 三、免疫金的保存免疫金復(fù)合物最終用稀釋液配制成工作濃度保存。

7、稀釋液通常是加入含穩(wěn)定劑的緩沖液。緩沖溶液常用中性的PBS或Tris緩沖液。PEG和BSA是最常用的穩(wěn)定劑。穩(wěn)定劑有兩大作用：為保護(hù)膠體金的穩(wěn)定性，使之便于長期保存；為防止或減少免疫金復(fù)合物的非特異性吸附反應(yīng)。第二節(jié) 金免疫測定一、斑點(diǎn)金免疫滲濾試驗(yàn)二、 斑點(diǎn)金免疫層析試驗(yàn)一、斑點(diǎn)金免疫滲濾試驗(yàn)(dot immunogold filtration assay,DIGFA)原理: 斑點(diǎn)金免疫滲濾試驗(yàn)是將抗原或抗體點(diǎn)加在固相載體硝酸纖維素薄膜上（這種固相載體具有過濾性能）制成抗原或抗體包被的微孔濾膜貼置于吸水材料上，依次滴加在膜上的標(biāo)本、免疫金、及洗滌液等液體很快滲入吸水材料中，最后陽性反應(yīng)在膜上

8、呈現(xiàn)紅色斑點(diǎn)。液體通過微孔濾膜時(shí)，滲濾液中的抗原或抗體與膜上的抗體或抗原相接觸，起到親和層析的濃縮，達(dá)到快速檢測的目的。 方法類型1雙抗體夾心法 2間接法技術(shù)要點(diǎn)圖20-1 DIGFA滲濾裝置及操作示意圖 二、 斑點(diǎn)金免疫層析試驗(yàn)（dot immunogold chromatographic assay,DICA） (一) 原理：斑點(diǎn)金免疫層析試驗(yàn)中滴加在膜一端的標(biāo)本溶液受載體膜的毛細(xì)管作用向另一端移動，猶如層析一般，在移動過程中被分析物與固定于載體膜上某一區(qū)域的抗體或抗原結(jié)合而被固相化，無關(guān)物則越過該區(qū)域而被分離，然后通過膠體金的呈色條帶來判定實(shí)驗(yàn)結(jié)果。(二) 方法類型 1.雙抗體夾心法2.

9、競爭法 3.間接法 1.雙抗體夾心法圖22-2 免疫層析試驗(yàn)雙抗體夾心法測大分子抗原 2.競爭法 圖22-3 免疫層析試驗(yàn)競爭法測小分子抗原原理圖 3間接法為了消除待測血清標(biāo)本中大量的非特異性IgG與特異性IgG競爭結(jié)合金標(biāo)記抗人IgG，降低了試驗(yàn)敏感性，膠體金間接免疫層析法測抗體常設(shè)計(jì)成反流免疫層析法(圖22-4)。測定時(shí)先將緩沖液加在D處層析至C處使金標(biāo)物復(fù)溶，然后將標(biāo)本加在E處使其與染料一起在膜的層析作用下向F端移動，若標(biāo)本中有待測抗體存在，則與膜上抗原結(jié)合形成抗原抗體復(fù)合物，待有色染料延伸至膜上標(biāo)記線G處時(shí)，在F處加緩沖液，合上測試卡，A處的強(qiáng)大吸水作用使膜上液體反向流動，標(biāo)本中非特異

10、性IgG及無關(guān)物向E處反向?qū)游?，隨后而來的金標(biāo)羊抗人抗體與抗原抗體復(fù)合物結(jié)合，出現(xiàn)棕紅色線條。無棕紅色線條出現(xiàn)則表明血清中無特異性抗體。三. 臨床應(yīng)用及評價(jià)1.免疫金技術(shù)具有操作簡便、快捷以及操作人員不需技術(shù)培訓(xùn)，無需特殊儀器設(shè)備，試劑穩(wěn)定，便于保存等特點(diǎn)，因此特別符合“床邊檢驗(yàn)” (point of care test,POCT)項(xiàng)目要求。2.本法靈敏度不及酶標(biāo)法和酶發(fā)光免疫測定法，在臨床應(yīng)用中應(yīng)引起高度重視。3.該技術(shù)不能準(zhǔn)確定量，只能作為定性或半定量試驗(yàn)，目前主要應(yīng)用于正常體液中不存在的物質(zhì)（如傳染病抗原和抗體以及毒品類藥物等）和正常含量極低而在特殊情況下異常升高的物質(zhì)（如HCG等）的檢

11、測。第三節(jié) 金免疫組織化學(xué)染色技術(shù)一、免疫金（銀）光鏡染色技術(shù)二、免疫金電鏡染色技術(shù)一、免疫金（銀）光鏡染色技術(shù)（immunogold silver staining，IGSS）免疫金銀染色是在金免疫技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的更為敏感的技術(shù)。1983年，Holgate等人將IGS與銀顯影方法相結(jié)合創(chuàng)立了免疫金銀法。 (一)原理 免疫金銀染色技術(shù)是通過免疫反應(yīng)沉積在抗原位置的膠體金顆粒起著一種催化劑作用，用對苯二酚還原劑將銀離子(Ag+)還原成銀原子(Ag)。被還原的銀原子于是圍繞金顆粒形成一個(gè)“銀殼”，“銀殼”一旦形成本身亦具有催化作用，從而使更多銀離子還原并促使“銀殼”越長越大“，最終使抗原位置得

12、到清楚放大 。圖22-5 免疫金銀染色原理示意圖 （二） 技術(shù)要點(diǎn)1. 配制銀染色液 在pH3.5檸檬酸緩沖液中加入明膠、對苯二酚、硝酸銀配制而成。2染色被檢血清經(jīng)適當(dāng)稀釋后均勻滴加在細(xì)胞抗原片上，被檢血清中抗體與片上抗原結(jié)合，流水沖洗后再用緩沖液沖洗，加BSA進(jìn)行封閉；滴加適當(dāng)稀釋的SPA-膠體金進(jìn)行反應(yīng)；滴加新鮮配制的銀染液，室溫避光染色反應(yīng)；流水沖洗、晾干、中性樹膠封片后光鏡下檢查，銀灰色顆粒沉積者為陽性。（三）注意事項(xiàng)1此法具有分辨力高，定位精確的優(yōu)點(diǎn)。2所帶玻璃器皿應(yīng)潔凈，所用蒸餾水必須雙蒸或三蒸。3配制膠體金溶液時(shí)，調(diào)整各試劑的比例可獲直徑不同的金顆粒。直徑l0nm的金粒子不易穿透

13、組織，故作細(xì)胞內(nèi)抗原定位時(shí)，以配制直徑5nm的金溶膠為宜。4硝酸銀、對苯二酚溶液應(yīng)避光保存并臨用時(shí)現(xiàn)配。5被檢血清中有其他自身抗體，如抗平滑肌抗體，抗心肌抗體、抗線粒體抗體等其抗原片應(yīng)根據(jù)專門試驗(yàn)的要求制備。 二、免疫金電鏡染色技術(shù)（一） 原理 膠體金標(biāo)記物與鎳網(wǎng)上待檢標(biāo)本上相應(yīng)蛋白質(zhì)發(fā)生結(jié)合反應(yīng),由于膠體金顆粒具有高電子密度的特性，故金標(biāo)蛋白結(jié)合處，電鏡下可見黑褐色顆粒，而從對細(xì)胞膜或細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)進(jìn)行定性與定位。（二） 技術(shù)要點(diǎn)1標(biāo)本包理 戊二醛對標(biāo)本進(jìn)行固定，鋨酸后固定(固定膜結(jié)構(gòu))，丙酮或乙醇逐級脫水，包埋(Epon812樹脂)，超薄切片(80nm)置300目鎳網(wǎng)上。2免疫組化染色 白

14、蛋白封閉，加第一抗體，孵育，PBS沖洗，卵白蛋白封閉，加第二抗體(膠體金標(biāo)記IgG )，孵育，PBS沖洗，蒸餾水沖洗，醋酸雙氧鈾、枸櫞酸鉛復(fù)染，電鏡觀察。（三）注意事項(xiàng)1以上染色步驟除清洗外，皆在滴于蠟?zāi)ぃǚ饪谀ぃ┥系母鞣N液體小滴上進(jìn)行。應(yīng)注意始終保持鎳網(wǎng)濕潤，不得任何一種液體干于網(wǎng)上，并要吸去鑷子尖部夾起的多余液體。2用于電鏡的免疫金法可分為包埋前染色和包埋后染色兩大類，包埋后染色具有簡便可靠，結(jié)果重復(fù)性好，能在同一組織切片上進(jìn)行多重免疫染色的優(yōu)點(diǎn)。但本法會使某些抗原失活，細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)不易保持完整。三、臨床應(yīng)用與評價(jià)1、膠體金在電鏡水平主要應(yīng)用于：細(xì)胞懸液或單層培養(yǎng)中細(xì)胞表面抗原的觀察。單層培養(yǎng)中細(xì)胞內(nèi)抗原的檢測。組織抗原的檢測。該法樣本用量少、檢測速度快、對比明顯、