臨床免疫學(xué)與檢驗：第二十二章 金免疫技術(shù)

1、第二十二章 金免疫技術(shù)colloidal gold immunoassay technique金免疫技術(shù)（colloidal gold immunoassay technique）是一種以膠體金作為標(biāo)記物的免疫標(biāo)記技術(shù)。1970s由Faulk和Taylor始創(chuàng)，最初用于免疫電鏡技術(shù)。金免疫技術(shù)用于: 免疫組織化學(xué)染色; 金免疫測定第一節(jié) 膠體金與免疫金的制備一、膠體金特性及其制備二、免疫金的制備三、免疫金的保存一、膠體金特性及其制備1.膠體金的結(jié)構(gòu) 2.膠體金性狀3.膠體金的制備 4.膠體金鑒定 5.膠體金保存 6.注意事項 1.膠體金的結(jié)構(gòu)膠體金（colloidal gold）也稱金溶膠（g

2、old solution），是由金鹽被還原成原金后形成的金顆粒懸液。 膠體金顆粒由一個基礎(chǔ)金核（原子金Au）及包圍在外的雙離子層構(gòu)成，緊連在金核表面的是內(nèi)層負(fù)離子（AuC12），外層離子層H+則分散在膠體間溶液中，以維持膠體金游離于溶膠間的懸液狀態(tài)。膠體金顆粒的基礎(chǔ)金核并非是理想的圓球核，較小的膠體金顆?；臼菆A球形的，較大的膠體金顆粒（一般指大于30nm以上的）多呈橢圓形。在電子顯微鏡下可觀察膠體金的顆粒形態(tài)。2.膠體金性狀（1）膠體金一般性質(zhì)： 膠體金顆粒大小多在1100nm，微小金顆粒穩(wěn)定地、均勻地、呈單一分散狀態(tài)懸浮在液體中，成為膠體金溶液。膠體金因而具有膠體的多種特性，特別是對電解質(zhì)

3、的敏感性。（2）膠體金的顏色和光吸收性：對同一種物質(zhì)的水溶膠金顆粒來說，粒子大小不同，顏色亦不同：膠體金顆粒在520nm之間，吸收波長520nm，呈葡萄酒紅色。膠體金顆粒2040nm之間吸收波長530nm，液體為深紅色，60nm的金溶液主要吸收波長600nm，金溶液呈蘭紫色，若離心去掉較大的金顆粒，溶膠呈紅色。根據(jù)這一特點(diǎn)，用肉眼觀察膠體金的顏色或吸收峰波長大小可粗略估計金顆粒的大小。3.膠體金的制備（1）制備原理 向一定濃度的金溶液內(nèi)加入一定量的還原劑使金離子變成金原子，形成金顆粒懸液。目前常用的還原劑有：白磷、乙醇、過氧化氫、硼氫化鈉、抗壞血酸、枸櫞酸鈉、鞣酸等。（2）操作要點(diǎn) 最常用的制

4、備方法為檸檬酸鹽還原法。 表22-1 四種粒徑膠體金的制備及特性膠體金粒徑（nm）1檸檬酸三鈉加入量（ml）*膠體金特性呈色max16.002.00橙色518nm24.501.50橙紅522nm41.001.00紅色525nm71.500.70紫色535nm4.膠體金鑒定制好高質(zhì)量的膠體金卻也并非易事?？捎梅止夤舛扔嫆呙鑝ax來估計金顆粒的粒徑。制備的膠體金最好作電鏡觀察，并選一些代表性的作顯微攝影，可以比較精確地測定膠體金的平均粒徑。 良好的膠體金應(yīng)該是清亮透明的，若制備的膠體金混濁或液體表面有漂浮物，提示此次制備的膠體金有較多的凝集顆粒。5.膠體金保存膠體金在潔凈的玻璃器皿中可較長時間保存

5、，加入少許防腐劑（如0.02NaN3）可有利于保存。6.注意事項 （1）氯金酸易潮解，應(yīng)干燥、避光保存。（2）氯金酸對金屬有強(qiáng)烈的腐蝕性，因此在配制氯金酸水溶液時，不應(yīng)使用金屬藥匙稱量氯金酸。（3）用于制備膠體金的蒸餾水應(yīng)是雙蒸餾水或三蒸餾水，或者是高質(zhì)量的去離子水。（4）用以制備膠體金的玻璃容器必須是絕對清潔的，用前應(yīng)先經(jīng)酸洗并用蒸餾水沖凈。最好是經(jīng)硅化處理的，硅化方法可用5二氯甲硅烷的氯仿溶液浸泡數(shù)分鐘，用蒸餾水沖凈后干燥備用。二、免疫金的制備免疫金（immunogold）是指膠體金與抗原（抗體）的結(jié)合物,在免疫組織化學(xué)技術(shù)中，習(xí)慣上要稱之為金探針。1.制備原理膠體金顆粒表面帶負(fù)電荷，與蛋

6、白質(zhì)的正電荷基團(tuán)間靠靜電力相互吸引，達(dá)到范德華引力范圍內(nèi)即形成牢固的結(jié)合,同時膠體金顆粒的粗糙表面也是形成吸附的重要條件。因此環(huán)境pH和離子強(qiáng)度是影響吸附的主要因素，其他如膠體金顆粒的大小、蛋白質(zhì)的分子量及蛋白質(zhì)濃度等也會影響蛋白質(zhì)的吸附2.技術(shù)要點(diǎn)（1）膠體金溶液的pH值調(diào)整 用K2CO3或 HCl溶液調(diào)節(jié)膠體金溶液的pH至選定 值。（2）蛋白質(zhì)最適標(biāo)記量的確定（3）標(biāo)記過程 在電磁攪拌下將1/10體積的合適濃 度的蛋白質(zhì)溶液加于膠體金溶液中，反應(yīng)一定 時間后加入 BSA并調(diào)整pH至8.5，放置室溫繼 續(xù)反應(yīng)數(shù)分鐘。（4）離心分離 三、免疫金的保存免疫金復(fù)合物最終用稀釋液配制成工作濃度保存。

7、稀釋液通常是加入含穩(wěn)定劑的緩沖液。緩沖溶液常用中性的PBS或Tris緩沖液。PEG和BSA是最常用的穩(wěn)定劑。穩(wěn)定劑有兩大作用：為保護(hù)膠體金的穩(wěn)定性，使之便于長期保存；為防止或減少免疫金復(fù)合物的非特異性吸附反應(yīng)。第二節(jié) 金免疫測定一、斑點(diǎn)金免疫滲濾試驗二、 斑點(diǎn)金免疫層析試驗一、斑點(diǎn)金免疫滲濾試驗(dot immunogold filtration assay,DIGFA)原理: 斑點(diǎn)金免疫滲濾試驗是將抗原或抗體點(diǎn)加在固相載體硝酸纖維素薄膜上（這種固相載體具有過濾性能）制成抗原或抗體包被的微孔濾膜貼置于吸水材料上，依次滴加在膜上的標(biāo)本、免疫金、及洗滌液等液體很快滲入吸水材料中，最后陽性反應(yīng)在膜上

8、呈現(xiàn)紅色斑點(diǎn)。液體通過微孔濾膜時，滲濾液中的抗原或抗體與膜上的抗體或抗原相接觸，起到親和層析的濃縮，達(dá)到快速檢測的目的。 方法類型1雙抗體夾心法 2間接法技術(shù)要點(diǎn)圖20-1 DIGFA滲濾裝置及操作示意圖 二、 斑點(diǎn)金免疫層析試驗（dot immunogold chromatographic assay,DICA） (一) 原理：斑點(diǎn)金免疫層析試驗中滴加在膜一端的標(biāo)本溶液受載體膜的毛細(xì)管作用向另一端移動，猶如層析一般，在移動過程中被分析物與固定于載體膜上某一區(qū)域的抗體或抗原結(jié)合而被固相化，無關(guān)物則越過該區(qū)域而被分離，然后通過膠體金的呈色條帶來判定實驗結(jié)果。(二) 方法類型 1.雙抗體夾心法2.

9、競爭法 3.間接法 1.雙抗體夾心法圖22-2 免疫層析試驗雙抗體夾心法測大分子抗原 2.競爭法 圖22-3 免疫層析試驗競爭法測小分子抗原原理圖 3間接法為了消除待測血清標(biāo)本中大量的非特異性IgG與特異性IgG競爭結(jié)合金標(biāo)記抗人IgG，降低了試驗敏感性，膠體金間接免疫層析法測抗體常設(shè)計成反流免疫層析法(圖22-4)。測定時先將緩沖液加在D處層析至C處使金標(biāo)物復(fù)溶，然后將標(biāo)本加在E處使其與染料一起在膜的層析作用下向F端移動，若標(biāo)本中有待測抗體存在，則與膜上抗原結(jié)合形成抗原抗體復(fù)合物，待有色染料延伸至膜上標(biāo)記線G處時，在F處加緩沖液，合上測試卡，A處的強(qiáng)大吸水作用使膜上液體反向流動，標(biāo)本中非特異

10、性IgG及無關(guān)物向E處反向?qū)游?，隨后而來的金標(biāo)羊抗人抗體與抗原抗體復(fù)合物結(jié)合，出現(xiàn)棕紅色線條。無棕紅色線條出現(xiàn)則表明血清中無特異性抗體。三. 臨床應(yīng)用及評價1.免疫金技術(shù)具有操作簡便、快捷以及操作人員不需技術(shù)培訓(xùn)，無需特殊儀器設(shè)備，試劑穩(wěn)定，便于保存等特點(diǎn)，因此特別符合“床邊檢驗” (point of care test,POCT)項目要求。2.本法靈敏度不及酶標(biāo)法和酶發(fā)光免疫測定法，在臨床應(yīng)用中應(yīng)引起高度重視。3.該技術(shù)不能準(zhǔn)確定量，只能作為定性或半定量試驗，目前主要應(yīng)用于正常體液中不存在的物質(zhì)（如傳染病抗原和抗體以及毒品類藥物等）和正常含量極低而在特殊情況下異常升高的物質(zhì)（如HCG等）的檢

11、測。第三節(jié) 金免疫組織化學(xué)染色技術(shù)一、免疫金（銀）光鏡染色技術(shù)二、免疫金電鏡染色技術(shù)一、免疫金（銀）光鏡染色技術(shù)（immunogold silver staining，IGSS）免疫金銀染色是在金免疫技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的更為敏感的技術(shù)。1983年，Holgate等人將IGS與銀顯影方法相結(jié)合創(chuàng)立了免疫金銀法。 (一)原理 免疫金銀染色技術(shù)是通過免疫反應(yīng)沉積在抗原位置的膠體金顆粒起著一種催化劑作用，用對苯二酚還原劑將銀離子(Ag+)還原成銀原子(Ag)。被還原的銀原子于是圍繞金顆粒形成一個“銀殼”，“銀殼”一旦形成本身亦具有催化作用，從而使更多銀離子還原并促使“銀殼”越長越大“，最終使抗原位置得

12、到清楚放大 。圖22-5 免疫金銀染色原理示意圖 （二） 技術(shù)要點(diǎn)1. 配制銀染色液 在pH3.5檸檬酸緩沖液中加入明膠、對苯二酚、硝酸銀配制而成。2染色被檢血清經(jīng)適當(dāng)稀釋后均勻滴加在細(xì)胞抗原片上，被檢血清中抗體與片上抗原結(jié)合，流水沖洗后再用緩沖液沖洗，加BSA進(jìn)行封閉；滴加適當(dāng)稀釋的SPA-膠體金進(jìn)行反應(yīng)；滴加新鮮配制的銀染液，室溫避光染色反應(yīng)；流水沖洗、晾干、中性樹膠封片后光鏡下檢查，銀灰色顆粒沉積者為陽性。（三）注意事項1此法具有分辨力高，定位精確的優(yōu)點(diǎn)。2所帶玻璃器皿應(yīng)潔凈，所用蒸餾水必須雙蒸或三蒸。3配制膠體金溶液時，調(diào)整各試劑的比例可獲直徑不同的金顆粒。直徑l0nm的金粒子不易穿透

13、組織，故作細(xì)胞內(nèi)抗原定位時，以配制直徑5nm的金溶膠為宜。4硝酸銀、對苯二酚溶液應(yīng)避光保存并臨用時現(xiàn)配。5被檢血清中有其他自身抗體，如抗平滑肌抗體，抗心肌抗體、抗線粒體抗體等其抗原片應(yīng)根據(jù)專門試驗的要求制備。 二、免疫金電鏡染色技術(shù)（一） 原理 膠體金標(biāo)記物與鎳網(wǎng)上待檢標(biāo)本上相應(yīng)蛋白質(zhì)發(fā)生結(jié)合反應(yīng),由于膠體金顆粒具有高電子密度的特性，故金標(biāo)蛋白結(jié)合處，電鏡下可見黑褐色顆粒，而從對細(xì)胞膜或細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)進(jìn)行定性與定位。（二） 技術(shù)要點(diǎn)1標(biāo)本包理 戊二醛對標(biāo)本進(jìn)行固定，鋨酸后固定(固定膜結(jié)構(gòu))，丙酮或乙醇逐級脫水，包埋(Epon812樹脂)，超薄切片(80nm)置300目鎳網(wǎng)上。2免疫組化染色 白

14、蛋白封閉，加第一抗體，孵育，PBS沖洗，卵白蛋白封閉，加第二抗體(膠體金標(biāo)記IgG )，孵育，PBS沖洗，蒸餾水沖洗，醋酸雙氧鈾、枸櫞酸鉛復(fù)染，電鏡觀察。（三）注意事項1以上染色步驟除清洗外，皆在滴于蠟?zāi)ぃǚ饪谀ぃ┥系母鞣N液體小滴上進(jìn)行。應(yīng)注意始終保持鎳網(wǎng)濕潤，不得任何一種液體干于網(wǎng)上，并要吸去鑷子尖部夾起的多余液體。2用于電鏡的免疫金法可分為包埋前染色和包埋后染色兩大類，包埋后染色具有簡便可靠，結(jié)果重復(fù)性好，能在同一組織切片上進(jìn)行多重免疫染色的優(yōu)點(diǎn)。但本法會使某些抗原失活，細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)不易保持完整。三、臨床應(yīng)用與評價1、膠體金在電鏡水平主要應(yīng)用于：細(xì)胞懸液或單層培養(yǎng)中細(xì)胞表面抗原的觀察。單層培養(yǎng)中細(xì)胞內(nèi)抗原的檢測。組織抗原的檢測。該法樣本用量少、檢測速度快、對比明顯、