蛋白酶K編制說明

1、蛋白酶K編制說明（征求意見稿）一、任務(wù)來源本國家標(biāo)準(zhǔn)的制定任務(wù)列入國家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì)二0五年國家標(biāo)準(zhǔn)制修訂項(xiàng)目，項(xiàng)目編號(hào)“-T-424”。本項(xiàng)任務(wù)由中國標(biāo)準(zhǔn)化研究院提出并歸口，定于2016年完成。本標(biāo)準(zhǔn)起草工作組由中國標(biāo)準(zhǔn)化研究院、河北農(nóng)業(yè)大學(xué)、浙江工商大學(xué)等單位共同組成。二、目的及意義絲氨酸蛋白酶是一類裂解肽鍵的蛋白酶，其活性中心的親和氨基酸為絲氨酸，它們?cè)谏镉袡C(jī)體中起著重要而廣泛的生理作用。絲氨酸蛋白酶超家族被分為胰蛋白酶和枯草桿菌蛋白酶兩個(gè)大家族，蛋白酶K（EC，是由林伯氏白色念球菌（TritirachiumalbumLimber）產(chǎn)生的一類主要蛋白酶。因其能消化角蛋白（kerati

2、n），故將其稱作蛋白酶K。蛋白酶K擁有典型的絲氨酸活性位點(diǎn)：Asp39-His69-Ser224。蛋白酶K具有穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)、極高的酶活力和廣泛的底物特異性，但偏好于帶有脂肪族及芳香烴的肽鏈，能優(yōu)先分解與疏水性氨基酸、含硫氨基酸、芳香族氨基酸羧基端連接的肽鍵，因而被廣泛應(yīng)用于工業(yè)、農(nóng)業(yè)和科學(xué)研究領(lǐng)域，也因此吸引了來自學(xué)術(shù)界、工業(yè)和農(nóng)業(yè)團(tuán)體的研究興趣?；蚬こ碳夹g(shù)的發(fā)展依賴于生物技術(shù)用的一些酶類，這些酶對(duì)與基因工程技術(shù)的作用，就如同CPU對(duì)與電腦的重要性一樣，它們是現(xiàn)代生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)中用于研究和開發(fā)基因工程產(chǎn)品和分子生物學(xué)研究的最基礎(chǔ)物質(zhì)。如果我國沒有獨(dú)立的生物技術(shù)用酶的生產(chǎn)體系，就不會(huì)有獨(dú)立的現(xiàn)代化

3、生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)。作為一個(gè)大國，我國應(yīng)該建立自主的蛋白酶K生產(chǎn)體系，以適應(yīng)生物產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展。在政府監(jiān)管中，標(biāo)準(zhǔn)的重要價(jià)值在于它架起了法律與科學(xué)之間的橋梁，提高了行政決定過程的公開性與結(jié)果的準(zhǔn)確性，為規(guī)范和控制行政裁量權(quán)提供了工具。目前我國在誠信制度沒有健全、存在巨大經(jīng)濟(jì)利益誘惑的情況下，對(duì)于生物產(chǎn)業(yè)的監(jiān)督，政府主管部門才是最有公信力和最能承擔(dān)責(zé)任的。因此，開展蛋白酶K技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)研究是政府實(shí)施科學(xué)監(jiān)管、有效監(jiān)管的必要技術(shù)支撐。通過研究制定基因工程常用蛋白酶K國家標(biāo)準(zhǔn)，有利于加快分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的速度、提高分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性和可重復(fù)性，從而提升整體分子生物學(xué)研發(fā)水平，產(chǎn)生廣泛的社會(huì)效益。建立我國

4、獨(dú)立自主的蛋白酶K工業(yè)系統(tǒng)，即可創(chuàng)造出可觀的經(jīng)濟(jì)效益又能解決我國目前主要依賴國外進(jìn)口蛋白酶K的問題，突破國內(nèi)生物技術(shù)酶產(chǎn)業(yè)發(fā)展受制于人的瓶頸。要對(duì)所檢測(cè)的產(chǎn)品或相關(guān)過程的特性進(jìn)行符合性判定，就需要制定技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)。要對(duì)產(chǎn)品或相關(guān)過程的特性進(jìn)行定量檢測(cè)，就需要依據(jù)經(jīng)過科學(xué)評(píng)估的、可重復(fù)的、公認(rèn)的檢測(cè)方法。目前，基因工程進(jìn)步如此之快，對(duì)相關(guān)的定性定量分析方法進(jìn)行全面的分析方法的驗(yàn)證非常有必要，只有可靠穩(wěn)定的系列檢測(cè)方法才能得出可靠的結(jié)果，才能保障這一新興的產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展。在我國涉及蛋白酶產(chǎn)品的現(xiàn)行國家標(biāo)準(zhǔn)中，提供的產(chǎn)品指標(biāo)不具有普適性，尤其是對(duì)于作為生化試劑主要用于核酸提取等分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)領(lǐng)域的蛋白酶K

5、，針對(duì)性差。這就導(dǎo)致不同廠商的蛋白酶K酶活力單位定義不統(tǒng)一，標(biāo)識(shí)不統(tǒng)一，從而無法對(duì)產(chǎn)品質(zhì)量做出準(zhǔn)確的判定，繼而影響到其合理的使用。因此，亟待系統(tǒng)研究并確定影響蛋白酶K產(chǎn)品使用的重要指標(biāo)，以建立蛋白酶K產(chǎn)品的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)。目前，我國蛋白酶產(chǎn)品的標(biāo)準(zhǔn)很少，僅有一項(xiàng)推薦性國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T23527-2009蛋白酶制劑，其適用范圍是以淀粉質(zhì)(或糖質(zhì))為原料，經(jīng)微生物發(fā)酵、提純制得的蛋白酶制劑的生產(chǎn)、檢驗(yàn)和銷售，不適用于動(dòng)植物組織提取的蛋白酶制劑；有兩項(xiàng)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)QB1806-1993洗滌劑用堿性蛋白酶制劑和QB1805.3-1993工業(yè)用蛋白酶制劑，前者的適用范圍是以地衣芽孢桿菌(Bacillusliche

6、niformisNo.2709及CW30)1、嗜堿性短小芽孢桿菌(AlkaliphilicBacilluspumilusNo.SMJ、枯草芽抱桿菌(BacillussubtilisNo.CW302深層培養(yǎng)，經(jīng)提純制取的洗滌劑用堿性蛋白酶制劑。后者的適用范圍是采用該標(biāo)準(zhǔn)中指定的菌種，以發(fā)酵法生產(chǎn)，經(jīng)提純制取的蛋白酶制劑。到目前為止，國家尚未發(fā)布相關(guān)蛋白酶K產(chǎn)品的標(biāo)準(zhǔn)，這給人們使用蛋白酶K帶來很大的不變，而且不同的生產(chǎn)廠家因其標(biāo)識(shí)出的產(chǎn)品指標(biāo)不同、檢測(cè)方法不同，故對(duì)蛋白酶K的酶活力定義也不同，使得使用者無法對(duì)不同廠家的蛋白酶K活力進(jìn)行正確的評(píng)價(jià)與比較，為購買與使用帶來困難。因此，對(duì)其產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)的需求

7、也越來越迫切。蛋白酶K產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)的建立，將為更多的行業(yè)使用蛋白酶K帶來很大的便利。三、標(biāo)準(zhǔn)制定原則及主要內(nèi)容（一）標(biāo)準(zhǔn)編制原則標(biāo)準(zhǔn)的制定過程中采用文獻(xiàn)調(diào)查法、專家座談法、科學(xué)試驗(yàn)法等多種研究方法，方法科學(xué)先進(jìn)、過程周密嚴(yán)謹(jǐn)、數(shù)據(jù)真實(shí)可信、結(jié)果明確。本標(biāo)準(zhǔn)是為相關(guān)組織的蛋白酶K檢測(cè)提供技術(shù)支撐，考慮到生產(chǎn)、監(jiān)管等不同需求，在方法選擇上，主要基于產(chǎn)業(yè)現(xiàn)狀、現(xiàn)有成熟的技術(shù)以及試驗(yàn)結(jié)果驗(yàn)證基礎(chǔ)確定的，因此實(shí)用性較強(qiáng)。（二）標(biāo)準(zhǔn)制訂主要依據(jù)1、標(biāo)準(zhǔn)編寫遵循GB1.1-2009標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)構(gòu)和編寫規(guī)則的有關(guān)要求。2、標(biāo)準(zhǔn)編寫內(nèi)容參考了與蛋白酶K檢測(cè)相關(guān)文獻(xiàn)，標(biāo)準(zhǔn)參照了GB/T6379.1

8、-2004測(cè)量方法與結(jié)果的準(zhǔn)確度（正確度與精密度）第1部分總則與定義和GB/T6379.2-2004測(cè)量方法與結(jié)果的準(zhǔn)確度第2部分確定標(biāo)準(zhǔn)測(cè)量方法重復(fù)性與再現(xiàn)性的基本方法。3、本標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法參考了GB/T23527-2009蛋白酶制劑、QB1806-1993洗滌劑用堿性蛋白酶制劑和QB1805.3-1993工業(yè)用蛋白酶制劑中的重要指標(biāo)的選取、酶活力和酶活力單位的定義及檢測(cè)流程，同時(shí)，還借鑒了Sigma公司和Merk公司有關(guān)蛋白酶K酶活力測(cè)定的文件。同時(shí)，通過系統(tǒng)地試驗(yàn)，驗(yàn)證了蛋白酶K比活力測(cè)定的方法和分子量的測(cè)定方法。（三）本標(biāo)準(zhǔn)的主要內(nèi)容本標(biāo)準(zhǔn)主要包括以下7個(gè)部分：1）范圍；2）術(shù)語和定義；

9、3）技術(shù)要求；4）試驗(yàn)方法；5）校驗(yàn)規(guī)則；（6）標(biāo)志、包裝、運(yùn)輸、貯存；四、主要工作過程（一）組成標(biāo)準(zhǔn)起草小組根據(jù)國家標(biāo)準(zhǔn)制修訂有關(guān)程序和要求，2015年10月下旬，中國標(biāo)準(zhǔn)化研究院主持召開了蛋白酶K酶活力及雜質(zhì)檢測(cè)方法國家標(biāo)準(zhǔn)制定研討會(huì)。會(huì)上，組成了標(biāo)準(zhǔn)起草工作組，明確了任務(wù)要求，安排了工作進(jìn)度，成立了標(biāo)準(zhǔn)起草工作小組，會(huì)議研究討論了蛋白酶K初稿，對(duì)起草小組在標(biāo)準(zhǔn)起草過程中的一些思考及難點(diǎn)問題進(jìn)行了深刻討論，各單位代表就標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)容及方法選擇進(jìn)行了討論。（二）開展相關(guān)調(diào)研情況蛋白酶K產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)屬于生物產(chǎn)業(yè)領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)，是支撐生產(chǎn)方、第三方組織開展產(chǎn)品評(píng)價(jià)的技術(shù)依據(jù)。起草工作小組首先針對(duì)生產(chǎn)和檢測(cè)開展

10、了大量的調(diào)研工作。從滿足實(shí)際檢測(cè)需要出發(fā)，開展了國內(nèi)外相關(guān)資料的收集和確認(rèn)工作，資料的檢索和信息的收集過程中，分析比較了大量的國內(nèi)外文獻(xiàn)方法。（三）標(biāo)準(zhǔn)起草完善過程在廣泛調(diào)查研究的基礎(chǔ)上，標(biāo)準(zhǔn)起草單位組織相關(guān)技術(shù)人員對(duì)蛋白酶K產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)項(xiàng)目進(jìn)行了預(yù)研，課題組成員廣泛收集了國內(nèi)外蛋白酶K產(chǎn)品的標(biāo)準(zhǔn)、文獻(xiàn)，了解了國內(nèi)外相關(guān)技術(shù)動(dòng)態(tài)，并且明確了工作思路和進(jìn)程安排，分析了通過前期的實(shí)驗(yàn)摸索、反復(fù)論證，確定了本標(biāo)準(zhǔn)方法設(shè)定的重要參數(shù)，開展了實(shí)際樣品的檢測(cè)。然后依據(jù)GB/T1.12000標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)構(gòu)和編寫規(guī)則、GB/T1.22002標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第2部分：標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)范性技術(shù)要素內(nèi)容的確定

11、方法等標(biāo)準(zhǔn)編制要求，對(duì)蛋白酶K標(biāo)準(zhǔn)開展了起草工作。于2016年3月中旬，起草工作小組完成了蛋白酶K國家標(biāo)準(zhǔn)（草案）。2016年6月，在北京組織有關(guān)單位和專家分別召開了標(biāo)準(zhǔn)草案討論會(huì)，重點(diǎn)對(duì)蛋白酶K的重要指標(biāo)選取提出了完善建議。同時(shí)對(duì)方法進(jìn)行了驗(yàn)證，針對(duì)驗(yàn)證所出現(xiàn)的問題，在2016年11月11組織專家對(duì)標(biāo)準(zhǔn)逐字逐句進(jìn)行了討論完善，形成了蛋白酶K國家標(biāo)準(zhǔn)征求意見稿。五、國內(nèi)外研究概況通過測(cè)試蛋白酶K水解經(jīng)尿素變性的血紅蛋白的酶活性，顯示出蛋白酶K在范圍內(nèi)都具有較高的酶活性。目前蛋白酶K通常使用的pH范圍是，蛋白酶K的最適pH是8.0。在37C時(shí)，蛋白酶K顯示出最高的活性，在20-60C之間蛋白酶K

12、的酶活性可保持在80%以上。Shu-QunLiu等人探討了蛋白酶K在催化過程中動(dòng)力學(xué)機(jī)制，提出了在蛋白酶K的催化三分子中，Asp39和His69以及His69和eSer224之間靜電和氫鍵的相互作用，使得一些在催化過程中起到不同功能的催化殘基，具有不同的熱動(dòng)力學(xué)和取向。之后，陶燕分別對(duì)沒有底物結(jié)合的蛋白酶K和結(jié)合了肽底物AAPA勺蛋白酶K進(jìn)行長時(shí)間分子動(dòng)力學(xué)模擬，以研究底物結(jié)合對(duì)蛋白酶K的動(dòng)力學(xué)行為和分子運(yùn)動(dòng)特征的影響。結(jié)果顯示，在動(dòng)力學(xué)模擬過程中，與底物結(jié)合的蛋白酶K比沒有底物結(jié)合的蛋白酶K具有更加致密穩(wěn)定的構(gòu)象。提出了大尺度的協(xié)同運(yùn)動(dòng)所導(dǎo)致的底物結(jié)合口袋動(dòng)力學(xué)行為與底物的識(shí)別、結(jié)合、定位以

13、及產(chǎn)物的釋放相關(guān)聯(lián)，發(fā)現(xiàn)底物結(jié)合口袋區(qū)域運(yùn)動(dòng)模式可以調(diào)整酶與底物之間的動(dòng)態(tài)相互作用。補(bǔ)充了前人的生物化學(xué)和結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究結(jié)果，從分子運(yùn)動(dòng)和蛋白質(zhì)動(dòng)力學(xué)角度闡釋了蛋白酶K的催化機(jī)制。蛋白酶K含有兩個(gè)CaT結(jié)合位點(diǎn)，距離酶的活性中心有一定的距離，它們與催化機(jī)理并無直接關(guān)系，但當(dāng)用EDTA去除CaT之后，催化活性將在6h之內(nèi)降低至原來的20%這是由于C/的去除引發(fā)了底物識(shí)別位點(diǎn)構(gòu)象的改變。同時(shí)Cf的去除會(huì)影響氯甲烷類較長肽抑制劑的結(jié)合，提高了48h之后的自溶率，降低了蛋白酶K的熱穩(wěn)定性等。蛋白酶K在抑制劑如尿素和SDS存在時(shí)仍能保持較高的穩(wěn)定性。在除去CeT后其剩余活性通常不足以降解在一般情況下污染

14、酸制品的蛋白質(zhì)，所以蛋白酶K消化過程中通常加入EDTA但是，如果要消化對(duì)蛋白酶K具有較強(qiáng)耐性的蛋白，如角蛋白一類，則可能需要使用含有1mmol/LCa2+而不含EDTA的緩沖液。在消化完畢后、純化核酸前要加入EGTA(pH8.0)至終濃度為2mmol/L，以鰲合CaT。蛋白酶K是一種絲氨酸蛋白酶，因此可以用苯甲基磺酰氟抑制其作用，苯甲基磺酰氟是一種絲氨酸蛋白酶的抑制劑，在純化蛋白質(zhì)時(shí)用于防止蛋白質(zhì)的降解。此外，AnilkumarR.Kore等人合成了一種五肽化合物，即MeOSuc-AAAPF-C2CHl，可以抑制蛋白酶K的水解活性，濃度僅需要0.1mM。JurgenBajorath等人用單肽或

15、二肽氯甲基酮對(duì)蛋白酶K進(jìn)行了處理，發(fā)現(xiàn)該化合物對(duì)蛋白酶K的水解起到了一定的抑制作用。蛋白酶K的比活力測(cè)定，可以衡量酶制劑的純度，是蛋白酶K產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)的一個(gè)重要指標(biāo)。在測(cè)定比活力時(shí)，需要先測(cè)定出酶制劑的酶活力和蛋白質(zhì)含量，在此基礎(chǔ)上計(jì)算出比活力。蛋白酶K酶活力的測(cè)定方法按照GB/Txxxx-201x蛋白酶K酶活力及雜質(zhì)檢測(cè)。蛋白酶K蛋白質(zhì)含量的測(cè)定方法按照SN/T3926-2014出口乳、蛋、豆類食品中蛋白質(zhì)含量的測(cè)定考馬斯亮藍(lán)法。在目前的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)中，可用于蛋白質(zhì)含量的測(cè)定方法有以下幾種，每種實(shí)驗(yàn)方法都有各自的優(yōu)缺點(diǎn)，實(shí)驗(yàn)者需根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求和實(shí)驗(yàn)條件來選擇適合的檢測(cè)方法。紅外光譜法。該法的原理是：均

16、質(zhì)牛乳中肽鍵的胺基在6.5卩m處紅外吸收測(cè)定蛋白質(zhì)。該方法的適用范圍是：牛乳中蛋白質(zhì)的快速測(cè)定(NY/T2659-2014牛乳脂肪、蛋白質(zhì)、乳糖、總固體的快速測(cè)定)。雙縮脲比色法。該法的原理是：利用三氯乙酸沉淀樣品中的蛋白質(zhì)，將沉淀物與雙縮脲試劑進(jìn)行顯色，通過分光光度計(jì)測(cè)定顯色液的吸光度值，采用外標(biāo)法定量，計(jì)算樣品中的蛋白質(zhì)含量。該法的適用范圍是：乳與乳制品中蛋白質(zhì)含量的測(cè)定(NY/T1678-2008乳與乳制品中蛋白質(zhì)的測(cè)定雙縮脲比色法)。凱氏定氮法。該法的原理是：食品中的蛋白質(zhì)在催化加熱條件下被分解，產(chǎn)生的氨與硫酸結(jié)合生成硫酸銨。堿化蒸餾使氨游離，用硼酸吸收后以硫酸或鹽酸標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液滴定，

17、根據(jù)酸的消耗乘以換算系數(shù)，即為蛋白質(zhì)含量。該法的適用范圍：各種食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定(GB5009.5-2010食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定)。分光光度法。該法的原理是：食品中的蛋白質(zhì)在催化加熱條件下被分解，分解產(chǎn)生的氨與硫酸結(jié)合生成硫酸銨，在pH4.8的乙酸鈉-乙酸緩沖溶液中與乙酰丙酮和甲醛反應(yīng)生成黃色的3,5-二乙酰-2,6-二甲基-1,4-二氫化吡啶化合物。在波長400nm下測(cè)定吸光度值，與標(biāo)準(zhǔn)系列比較定量，結(jié)果乘以換算系數(shù)，即為蛋白質(zhì)含量該法的適用范圍：各種食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定(GB5009.5-2010食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定）。（5）燃燒法。該法的原理是：試樣在900C1

18、200E高溫下燃燒，燃燒過程中產(chǎn)生混合氣體，其中的碳、硫等干擾氣體和鹽類被吸收管吸收，氮氧化物被全部還原成氮?dú)?，形成的氮?dú)鈿饬魍ㄟ^熱導(dǎo)檢測(cè)儀（TCD進(jìn)行檢測(cè)。該法的適用范圍：蛋白質(zhì)含量在10g/100g以上的糧食、豆類、奶粉、米粉、蛋白質(zhì)粉等固體試樣的篩選測(cè)定（GB5009.5-2010食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定）。（6）免疫檢測(cè)法。該法的原理是：從測(cè)試樣品中按照一定的程序抽提出含有目標(biāo)蛋白質(zhì)的基質(zhì)，利用抗體與目標(biāo)蛋白（抗原）特異性結(jié)合特性，通過偶聯(lián)抗體與抗原抗體復(fù)合物的作用產(chǎn)生可檢測(cè)的信號(hào)該法的適用范圍是：以檢測(cè)目標(biāo)蛋白為基礎(chǔ)的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品定性定量檢測(cè)（GB/T19495.8-2004

19、轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測(cè)蛋白質(zhì)檢測(cè)方法）。（7）考馬斯亮藍(lán)法。該法的原理是：考馬斯亮藍(lán)G-250在稀酸溶液中與蛋白質(zhì)結(jié)合后變?yōu)樗{(lán)色，其最大吸收波長從465nm變?yōu)?95nm其藍(lán)色蛋白質(zhì)染料復(fù)合物在595nm波長下的吸光度與蛋白質(zhì)含量成正比。該法適用于乳、蛋、豆類食品中蛋白質(zhì)含量的測(cè)定（SN/T3926-2014出口乳、蛋、豆類食品中蛋白質(zhì)含量的測(cè)定考馬斯亮藍(lán)法）。六、關(guān)鍵試驗(yàn)內(nèi)容和技術(shù)指標(biāo)說明主要儀器與設(shè)備721G型可見分光光度計(jì)（上海儀電分析儀器有限公司），F(xiàn)A1004型電子天平（上海良平儀器儀表有限公司）等。主要材料與試劑（1）牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液：準(zhǔn)確稱取100mg牛血清白蛋白，溶于100mL蒸餾

20、水中，即為1000卩g/mL標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液。（2）考馬斯亮藍(lán)G-250（0.01%）染液：稱取100mg考馬斯亮藍(lán)G-250,溶于50ml95%乙醇中，加入85%（m/v）的磷酸100ml,最后用蒸餾水定容至1000ml（此溶液不宜久存，在常溫中可放置12個(gè)月）；將定容好的染液過濾并裝入棕色瓶中保存。（3）蛋白酶K樣品液：分別準(zhǔn)確稱取四種不同廠家的蛋白酶K0.0100g，加入pH8.0的0.01mol/LTris-HCI緩沖液10mL,配成1mg/mL蛋白酶K樣品溶液。四種蛋白酶K分別來自Solarbio公司，一種國產(chǎn)蛋白酶K,Merck公司，Calbiochem公司。6.3主要試驗(yàn)方法01000卩g/ml蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線參考GB/T28715-2012分光光度法測(cè)定。取6支10mL具塞試管，編號(hào)后，按下表加入試劑，