重組DNA技術(shù)2之表達系統(tǒng)

1、重組DNA表達系統(tǒng)1 體外表達：無細胞表達系統(tǒng) 原核表達系統(tǒng)：大腸桿菌表達系統(tǒng)等 體內(nèi)表達： 酵母表達系統(tǒng) 真核表達系統(tǒng) 昆蟲細胞表達系統(tǒng) 哺乳動物細胞表達系統(tǒng) 動物/植物表達系統(tǒng)（轉(zhuǎn)基因動物/植物） 2體系選擇研究基因功能: 大腸桿菌, 裂殖酵母,昆蟲細胞, CHO細胞多肽藥物生產(chǎn): 大腸桿菌, 畢氏酵母, CHO細胞, 乳腺組織疫苗: 大腸桿菌, 酵母, 大多數(shù)沿用細胞培養(yǎng)產(chǎn)物進行滅毒單抗生產(chǎn): 雜交瘤細胞工業(yè)酶生產(chǎn): 各種微生物 3一、體外表達系統(tǒng)（無細胞表達系統(tǒng)）4體外翻譯系統(tǒng)又稱無細胞蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)，是一種相對胞內(nèi)表達系統(tǒng)而言的開放型表達系統(tǒng)。 優(yōu)點：內(nèi)源型mRNA干擾很小，操作程序

2、簡單，獲得重組蛋白周期很短。主要用于蛋白質(zhì)快速分析鑒定；基因轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)控機理研究；分子間的相互作用的研究。缺點： 昂貴； 操作要求高； 表達量不夠高。 5主要的體外表達系統(tǒng)：1、兔網(wǎng)織紅細胞系統(tǒng)，由新西蘭大白兔制備。2、麥胚提取物系統(tǒng)，可穩(wěn)定地表達一些在兔網(wǎng)織紅細胞中翻譯受到抑制的DNA。 3、原核體外翻譯系統(tǒng)（S30原核體外翻譯系統(tǒng)）， E.coli S30提取物由OmpT內(nèi)切酶和Lon蛋白酶缺陷的E.coli B菌株制備，所以在S30系統(tǒng)中表達基因可以增加產(chǎn)物的穩(wěn)定性。6目前多家公司有商業(yè)化產(chǎn)品，常見的有：RTS E.Coli 系統(tǒng);RTS100 wheat germ CECF系統(tǒng) (R

3、oche)TNT快速偶聯(lián)轉(zhuǎn)錄/翻譯系統(tǒng) (Promega)；Gold TNT T7 Express 96系統(tǒng) （Promega），該系統(tǒng)有SP6和T7兩種類型，適合在96孔板上進行大規(guī)模高通量篩選分析； TNT T7 Quick for PCR DNA (promega)，PCR DNA 的TNT T7快速系統(tǒng)從PCR反應(yīng)液中直接取樣，無需純化DNA，直接用于偶聯(lián)的轉(zhuǎn)錄/翻譯反應(yīng)； TNT 偶聯(lián)小麥胚芽抽提系統(tǒng) (promega)。78二、原核表達系統(tǒng)9特點：產(chǎn)量高、生長速度快、操作容易、成本低。 缺點：翻譯后加工修飾體系不完善：無糖基化、?；纫话惚磉_獲得的蛋白常常以變性狀態(tài)存在，不具有生

4、物學(xué)活性。 （一）大腸桿菌表達系統(tǒng)10目前較常用的表達載體是具有可誘導(dǎo)的T7啟動子的表達載體，大部分蛋白均可獲得表達而且表達量較高，表達量可占細菌總蛋白的25以上。T7RNA聚合酶來源于T7噬菌體，期活性高于大腸桿菌RNA聚合酶很多倍，而且較少發(fā)生轉(zhuǎn)錄中止它只識別自己的啟動序列，不能啟動大腸桿菌DNA的轉(zhuǎn)錄，對抑制大腸桿菌RNA聚合酶的抗生素如利福平有抗性，因而可在利福平存在的條件下，使目的基因得到大量擴增正常大腸桿菌并不表達T7RNA聚合酶，為了能利用T7啟動子表達外源基因，將T7RNA聚合酶基因置于lacUV5啟動子控制下，整合到大腸桿菌染色體，構(gòu)建了能被IPTG誘導(dǎo)表達T7RNA聚合酶的

5、大腸桿菌菌株常用宿主細胞有BL21（DE3）、JM109（DE3）等還有受溫度變化誘導(dǎo)的具有噬菌體PL啟動子調(diào)控 的載體等。 11按蛋白質(zhì)類型分單純表達: pJLA系列, 用NcoI/NdeI導(dǎo)入AUG的載體融合表達: 融合各種tag, GST, CBD, MAL, GFP, etc 分泌表達: pel/ompT分泌肽按啟動子分lac及衍生的tac , trc, pac, rac等啟動子 IPTG誘導(dǎo)lamda phage PL和PR 啟動子 熱誘導(dǎo)T7 啟動子 IPTG誘導(dǎo)T5 啟動子 IPTG誘導(dǎo)ara啟動子 阿拉伯糖誘導(dǎo)大腸桿菌表達載體分類12常見的大腸桿菌商業(yè)化表達系統(tǒng)有：1、pET

6、system and pETBlue system（Novagen公司），是原核蛋白表達中應(yīng)用最多的系統(tǒng)。具有可溶性蛋白生產(chǎn)、二硫鍵形成、蛋白外運和多肽生產(chǎn)等專用載體和宿主菌。目前共有包括40多種載體、15種不同宿主菌和配套齊全的用于有效檢測和純化目標蛋白的相關(guān)產(chǎn)品。 基本結(jié)構(gòu)由T7啟動子、核糖體結(jié)合位點、信號肽序列、多克隆位點、T7轉(zhuǎn)錄終止信號、氨芐青霉素抗性基因核質(zhì)粒復(fù)制位點等有可以表達N端融合、C端融合和非融合蛋白的不同質(zhì)粒。也可以表達非分泌性蛋白2、pBAD表達系統(tǒng)（Invitrogen公司），可控制蛋白質(zhì)的生產(chǎn)水平低于其成為不溶性蛋白的域值。通過與硫氧還蛋白的融合來增加溶解度 3、Q

7、IAexpress Expression System（Qiagen公司 ）。13pJLA50X系列; pcDNAII; etcpET系列 (T7 promoter, Novagen公司)pQE系列 (T5 promoter, Qiagen公司)pMAL系列 (周質(zhì)表達, BioLabs公司)pGEX系列 (GST融合表達, Pharmacia公司)pBAD系列 (Arabinose誘導(dǎo)型)常用表達載體pTYB系列 (CBD融合, 可以自我切割, BioLabs)14BL21(DE3)/pLysS : 自身表達T7 RNA polymerase 適用pET系列等帶T7啟動子的載體M15/SG1

8、3009 : 自身表達T5 RNA polymerase 適用pQE系列等帶T5啟動子的載體BL21TrxB(DE3) : thioredoxin reductase 突變 Origami : thioredoxin reductase/glutathione reductase 雙突變 適合帶thioredoxin reductase的融合表達載體, 幫助形成更多的二硫鍵BR21CodonPlusRIL: 富含AT的真核生物基因的表達BR21CodonPlusRP: 富含GC的真核生物基因的表達特殊的表達用菌株15外源基因在原核細胞中的表達形式按表達蛋白的部位分： 分泌表達； 外周質(zhì)及膜上表

9、達 ； 胞內(nèi)表達。16外源基因在原核細胞中的表達形式 在原核細胞中表達外源基因時，可產(chǎn)生融合型、非融合型。 原則上應(yīng)能夠使外源基因表達效率高，蛋白質(zhì)產(chǎn)量高，不易被細菌分解，而且產(chǎn)物易被提取、純化。 17融合基因的表達 外源基因在大腸桿菌中表達的一種簡便方法是使其表達為融合蛋白，也就是說要表達的外源基因連接在一段原核基因的下游，蛋白質(zhì)的N末端由原核DNA序列或其他DNA序列編碼，C端由外源DNA的完整序列編碼，這樣的蛋白質(zhì)由1條短的原核多肽或具有其他功能的多肽和外源蛋白質(zhì)結(jié)合在一起，故稱為融合蛋白。18融合蛋白的特點轉(zhuǎn)錄和翻譯起始從正常的大腸桿菌序列開始，故通?？梢援a(chǎn)生高水平的融合蛋白；融合蛋白

10、往往比天然的外源蛋白更加穩(wěn)定；產(chǎn)生的融合蛋白較大，容易從蛋白質(zhì)凝膠電泳中區(qū)別出夾，而且融合蛋白帶可以從凝膠上切下，經(jīng)冷凍于燥，磨成粉末后即可作為抗原；有些融合蛋白帶有信號肽，可以分泌到細胞外。這有助于蛋白質(zhì)的分離和純化。19融合方式 6His Tag融合 半乳糖苷酶融合 trpE融合蛋白 谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶（GST）融合 硫氧還蛋白（Trx）融合 麥芽糖結(jié)合蛋白（MBP）融合 堿性磷酸酶（phoA）啟動子和信號序列 20Protein A GST（glutathione S-transferase） CBD (chitin-binding domain, BioLabs; cellulose-b

11、inding domain, Novagen) calmodulin-binding domain, Stratagene)MBP (maltose-binding protein)GFP (green fluorescence protein)Thioredoxin *幫助二硫鍵形成Dsb (periplasma enzyme DsbA, DsbC) * 二硫鍵的形成與SUMO (small ubiquitin-related modifier) KSI (ketosteroid isomerase) 基本上全部沉淀各種融合蛋白表達載體幫助可溶化幫助分泌到周質(zhì)可用親和層析純化21His-ta

12、g (6-8 Histidine)T7-tag (MASMTGGQQMG)HSV-tag (QPELAPEDPED)S-tag (KETAAKFERQHMDS)VSV-G-tag (TTDIEMNRLGK)HA-tag (YPYDVPDYA)Flag-tag (DYKDDDDK) Myc-tag (EQKLISEEDL)各種用于抗體識別的標記22如果所表達的蛋白質(zhì)有二硫鍵并需要正確的立體結(jié)構(gòu), 盡可能進行可溶性表達;如果所表達的蛋白質(zhì)沒有二硫鍵或只用來制備抗血清, 采用包含體表達比較好;如果希望表達的多肽的分子量小于10 kDa, 一定要進行融合表達23采用MBD融合采用GST融合采用CBD融

13、合采用thioredoxin融合采用Origami等宿主菌降低菌體培養(yǎng)的速度 溫度 (15-30), 降低轉(zhuǎn)速 讓表達產(chǎn)物可溶化24采用CBD融合 (pET36/37)采用Dsb融合 (pET39/40)采用帶pelB/ompT引導(dǎo)肽的載體 (pET12/20/22)采用帶MBD融合 (pMAL載體, Biolabs)采用帶SUMO融合 (pET SUMO, Invitrogen)讓蛋白質(zhì)分泌到間質(zhì)去25 融合表達的蛋白，在分離純化過程中往往需要去除表達時額外引入的融合片段。因此需要用不同方法將其裂解，通常有：1、化學(xué)裂解法：特異識別特定的氨基酸殘基或一組氨基酸殘基。但化學(xué)裂解法裂解位點的特異

14、性低，有時可能對目標蛋白產(chǎn)生不必要修飾如：甲酸、溴化氰等 2、酶解法：反應(yīng)條件溫和，具有高度的特異性。常用的酶有Xa因子、凝血酶、腸激酶、凝乳酶、膠原酶等。但酶解法成本高 ，反應(yīng)時間長，更重要的是蛋白酶本身不可避免地混入目標蛋白中，造成新的污染，提高純化的復(fù)雜性。 26DTT: intein的Cys 溴化氰: MetThrombin: LVPRGS Factor Xa: IEGREnterokinase: DDDDKPreScissionTM protease: LEVLFQGPGenenase I TM PGAAHYTEV protease: ENLYFQ G融合蛋白的專一性切割273、IM

15、PACT系統(tǒng)(intein mediated purification with an affinity chitin-binding Tag) 該系統(tǒng)是由枯草桿菌來源的幾丁質(zhì)結(jié)合域（5kD，chitin binding domain，用于親和純化）和酵母蛋白質(zhì)剪接元件 intein組成一個雙效的融合標簽。 intein在較低的溫度和還原條件下發(fā)生自身介導(dǎo)的N端裂解，釋放出與之相連的目的蛋白。因此融合蛋白無需蛋白酶裂解即可實現(xiàn)目的蛋白與fusion tag的精確切割。但含有較多二硫鍵的蛋白不適合這一系統(tǒng)。 28293031分泌型表達 為減少所需蛋白質(zhì)在宿主體內(nèi)被蛋白酶降解?；蛘呤沟鞍踪|(zhì)能夠在體

16、外正確折疊和便于提純，經(jīng)常需要將被表達的蛋白質(zhì)分泌到細胞外，因此要用分泌型載體。32分泌型載體的優(yōu)點一些在胞內(nèi)被蛋白酶降解的蛋白質(zhì)在細胞周質(zhì)中很穩(wěn)定；一些在胞內(nèi)無活性的蛋白質(zhì)在分泌后便具有活性，分泌可能使蛋白質(zhì)能夠正確折疊；產(chǎn)生的蛋白質(zhì)沒有氨基末端甲硫氨酸，因為切割位點在信號肽與編碼序列之間，甲硫氨酸會影響許多蛋白質(zhì)的活性。33蛋白質(zhì)能夠在大腸桿菌中進行分泌，至少要具備3個要素：有一段信號肽；在成熟蛋白質(zhì)內(nèi)有適當(dāng)?shù)呐c分泌相關(guān)的氨基酸序列；細胞內(nèi)有相應(yīng)的轉(zhuǎn)運機制。34信號肽長度一般為1530個氨基酸殘基真核生物和原核生物的信號肽在結(jié)構(gòu)上都有以下特征：信號肽一般都不長，在氨基末端有一段帶正電荷的氨

17、基酸序列，往往是精氨酸或賴氨酸殘基，其數(shù)目為13個；有一個高度疏水的核心區(qū)，含亮氨酸或異亮氨酸殘基，位置可以從帶正電荷的氨基酸延伸到含切割位點的區(qū)域；含有能被信號肽酶水解的切割位點，這個位點常常在丙氨酸之后，有的是在甘氨酸或絲氨酸之后35 分泌型載體也有缺點，例如目的蛋白質(zhì)的產(chǎn)量往往很低，以及信號肽不能被切除或切在錯誤位置上等。36非融合蛋白的表達 指在細菌內(nèi)表達的蛋白質(zhì)以真核蛋白質(zhì)mRNA的AUG為起始，在其氨基端不含任何細菌多肽序列。 優(yōu)點：表達產(chǎn)物的生物學(xué)功能接近于生物體內(nèi)天然蛋白質(zhì)。 缺點：容易被細菌蛋白酶破壞。37包含體（包涵體） 表達的蛋白質(zhì)經(jīng)常是不溶的，會在細菌內(nèi)與細菌雜蛋白、核

18、酸等成分形成不溶性聚合體即包含體（inclusion body），尤其當(dāng)表達目的蛋白量超過細菌體總蛋白量10%時，就很容易形成包涵體生成包涵體的原因可能有是蛋白質(zhì)合成速度太快，多肽鏈相互纏繞，影響了多肽鏈的正確折疊，導(dǎo)致疏水基團外露等。38 包含體的形成有利于防止蛋白酶對表達蛋白的降解，并且非常有利于分離表達產(chǎn)物。但包含體形成后，表達蛋白不具有生物活性，因此必須溶解包含體并對表達蛋白進行復(fù)性。39包含體的制備可通過常規(guī)方法如超聲波、勻漿等使菌體破碎后，離心就可得到。密度梯度離心后則可得到高純度的包含體包含體通常不溶于水，加入強蛋白質(zhì)變性劑后方可溶解根據(jù)包含體中蛋白質(zhì)種類的不同，通常用68mol

19、L鹽酸胍或910molL尿素溶解包含體。采用pH 2045的酸性溶液也可使包含體溶解。40形成包含體的表達蛋白恢復(fù)其活性的過程稱為包含體蛋白質(zhì)復(fù)性其基本原理是隨著變性劑濃度的降低，表達蛋白恢復(fù)其天然構(gòu)型常用的復(fù)性方法有逐步稀釋法或透析法等。41透析法: 簡單; 但費時, 費緩沖液, 蛋白質(zhì)濃度不能過高(容易產(chǎn)生沉淀) 快速稀釋法: 最常用的小規(guī)模復(fù)性方法; 但比較費時,費緩沖液, 蛋白質(zhì)的濃度不能高(容易產(chǎn)生沉淀) 超濾透析法: 比較省緩沖液, 處理量大; 但費時, 要控制好蛋白質(zhì)濃度凝膠過濾法: 快速, 可重復(fù)性高, 不會產(chǎn)生沉淀, 操作復(fù)雜一點 親和層析復(fù)性法, 水相二相法, etc包含體

20、來源蛋白質(zhì)的復(fù)性42（二）枯草芽孢桿菌表達系統(tǒng)Spizizen于1958年發(fā)現(xiàn)枯草桿菌168菌株為可轉(zhuǎn)化菌株以來，枯草桿菌的遺傳學(xué)工作不斷深入和發(fā)展 枯草桿菌的研究之所以領(lǐng)先于其他芽孢桿菌的種，主要是由于他的轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)方法較完善，以及大量的衍生菌株A.芽孢桿菌的分類除枯草桿菌外，已報導(dǎo)用作宿主表達克隆基因的有：嗜堿芽孢桿菌、淀粉芽孢桿菌、短芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、球形芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、蘇云金芽孢桿菌和耐堿的芽孢桿菌以及病原菌炭疽芽孢桿菌等12種 B.枯草芽孢桿菌168的基因組序列測定已完成 43芽孢桿菌表達系統(tǒng)的優(yōu)點-相對于大腸桿菌1、非致病性：除個別種（

21、炭疽芽孢桿菌和臘樣芽孢桿菌）外對人畜無害2、轉(zhuǎn)化外源DNA的感受態(tài)系統(tǒng)也同樣適用于轉(zhuǎn)化重組DNA3、質(zhì)粒和噬菌體都可以作為克隆的載體 4、細胞壁的組成簡單，只含有肽聚糖和磷璧質(zhì)，因此在分泌的蛋白質(zhì)產(chǎn)品中不會混雜有胞被內(nèi)毒素（熱源性脂多糖），而這一點是大腸桿菌無法比擬的 5、能夠大量分泌某些胞外蛋白，蛋白跨越細胞膜后，被加工和直接釋放到培養(yǎng)基中而不發(fā)生聚集，回收和純化蛋白較為簡單。例如：淀粉酶、蛋白酶及殺蟲晶體蛋白等與革蘭氏陰性（大腸桿菌）相比，陽性菌（芽孢桿菌）簡單的細胞壁結(jié)構(gòu)賦予了它高效地向胞外分泌目的蛋白的能力,這樣從而使得目的蛋白的純化相對比較簡單芽孢桿菌擁有一套高效的分泌信號肽及分子伴

22、侶系統(tǒng)。可完成目的蛋白的高效分泌表達，從而避免包涵體形成 6、良好的發(fā)酵基礎(chǔ)和生產(chǎn)技術(shù)，在相對簡單的培養(yǎng)基中能生長到很高的密度4445芽孢桿菌的缺點如下： 1、能夠產(chǎn)生大量的胞外蛋白酶，往往造成表達產(chǎn)物的大量降解。 2、能自發(fā)形成感受的的菌株極少，感受態(tài)持續(xù)時間短暫，分子克隆效率低 3、存在限制和修飾系統(tǒng)，重組質(zhì)粒不穩(wěn)定。 46芽孢桿菌常用的宿主已報導(dǎo)用作宿主表達克隆基因的有Brevibacillus brevis（短短芽孢桿菌）、嗜堿芽孢桿菌、淀粉芽孢桿菌、短芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、球形芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、蘇云金芽孢桿菌和耐堿的芽孢桿菌以及病原菌炭疽芽孢桿

23、菌等短短芽孢桿菌作為表達菌株的幾個優(yōu)點：1、幾乎不向胞外分泌蛋白酶（枯草芽孢桿菌至少分泌8種不同的蛋白酶），利于目的蛋白的穩(wěn)定性2、細胞壁相對于枯草桿菌來講更薄，有利于外源蛋白的分泌3、據(jù)研究其發(fā)酵液中存在著可以促進蛋白中二硫鍵形成的因子，可以促進外源蛋白的折疊47載體：目前，芽孢桿菌中常用的載體主要有自主復(fù)制質(zhì)粒、整合質(zhì)粒和噬菌體三種從芽孢桿菌中分離的自主復(fù)制質(zhì)粒，除極少數(shù)以外（例如pBC16），均為無抗性標志的隱秘質(zhì)粒帶有抗性標志的自主復(fù)制質(zhì)粒主要來自其它G+細菌，特別是來自金黃色葡萄球菌的質(zhì)粒。其中廣泛使用的有pUB110、pC194和pE194等。迄今已在上述質(zhì)粒的基礎(chǔ)上構(gòu)建了雙標記質(zhì)

24、粒、芽孢桿菌/大腸桿菌穿梭質(zhì)粒、表達質(zhì)粒、整合質(zhì)粒和探針質(zhì)粒等48絕大多數(shù)的載體在陽性菌中的拷貝數(shù)都非常低。采用整合質(zhì)粒將克隆基因整合到宿主染色體，是克服芽孢桿菌質(zhì)粒不穩(wěn)定性的一個有效的途徑整合的目的一般通過同源重組或者轉(zhuǎn)座子插入來實現(xiàn)。這種質(zhì)粒的基本結(jié)構(gòu)是在大腸桿菌質(zhì)粒的基礎(chǔ)上增加一個芽孢桿菌的抗性標志，以及待整合的目的基因。它在大腸桿菌中進行基因克隆或亞克隆操作。整合質(zhì)粒導(dǎo)入芽孢桿菌后，由于它沒有芽孢桿菌質(zhì)粒的復(fù)制起點而不能自主復(fù)制，只有插入到宿主體后，隨著細胞復(fù)制而復(fù)制。在含有整合質(zhì)粒中芽孢桿菌抗性標志的抗生素的培養(yǎng)基上，就可以很容易挑出這種整合體整合質(zhì)粒另一個重要的用途是用于目的基因的

25、敲除。不少噬菌體都可用作載體，如105噬菌體，SP噬菌體及其它噬菌體。其中 105噬菌體應(yīng)用較多，它是一個溫和噬菌體，基因組約為39.2Kb，從中發(fā)展了不少載體。目的基因一般在體外“包裝”之后，經(jīng)噬菌體介導(dǎo)（轉(zhuǎn)導(dǎo)）而進入宿主菌進行表達49其 他乳酸菌 (Lactic acid bacteria)沙門氏菌 (Salmonella typhimurium)蘇云金桿菌 (Bacillus thuringiensis)5051三、真核表達系統(tǒng)52（一）酵母表達系統(tǒng)優(yōu)點：1、基因背景了解清楚，上游操作簡單，生長迅速，非常適于大規(guī)模發(fā)酵。2、具有一定的加工及修飾能力：如二硫鍵的正確形成，前體蛋白的水解加工

26、。表達產(chǎn)物與天然蛋白相同或類似。3、可將異源蛋白基因與N-末端前導(dǎo)肽等信號肽融合，指導(dǎo)新生肽的分泌，在分泌中可對表達的蛋白進行糖基化修飾，但其修飾糖鏈與高等真核細胞并不相同。 4、可移去起始甲硫氨酸，避免了作為藥物使用可能引起的免疫反應(yīng)問題。 53缺點：產(chǎn)糖量過多因而損壞蛋白質(zhì)的生物活性、安全性等；糖基化修飾與高等真核細胞并不相同。 54載體：均為大腸桿菌和酵母菌的“穿梭”質(zhì)粒。有附加體型載體和整合體型載體兩種。常用啟動子：GAL1、AOX1、AUG1、TEF1 等。酵母表達系統(tǒng)載體有：1、整合型載體: 導(dǎo)入酵母宿主細胞后與酵母細胞染色體基因組DNA整合，穩(wěn)定性高，但基因拷貝數(shù)低。 2、附加體

27、型載體：在酵母宿主中拷貝數(shù)量大，但在傳代過程中易丟失，影響重組菌的穩(wěn)定性和表達量。 55常見宿主有：釀酒酵母、裂殖酵母、克魯維酵母、巴氏畢赤酵母等。釀酒酵母表達系統(tǒng)多為附加型載體，巴氏畢赤酵母，多形漢遜酵母表達系統(tǒng)為整合型載體?？唆斁S酵母表達系統(tǒng)則兼而有之釀酒酵母表達系統(tǒng)缺乏強有力的啟動子，分泌效率差，表達質(zhì)粒易于丟失目前，畢赤酵母表達系統(tǒng)是應(yīng)用最廣泛的酵母表達系統(tǒng)它以甲醇作為唯一的碳源。產(chǎn)量較高。翻譯后的加工更接近哺乳動物 。如日本綠十字公司利用該系統(tǒng)可以達到公斤級水平的人血清白蛋白的生產(chǎn)。56 商品化酵母表達系統(tǒng)有畢赤酵母（Pichia）系統(tǒng) （invitrogen）和Saccharomy

28、ces釀酒酵母表達系統(tǒng)（invitrogen）畢赤酵母系統(tǒng)重組蛋白表達量可高達12 g /L，表達量最高。57 （二）昆蟲細胞表達系統(tǒng) 昆蟲細胞表達系統(tǒng)是以桿狀病毒為載體，昆蟲細胞為宿主的表達系統(tǒng)。 1、表達效率高。重組蛋白的表達水平最高可達到細胞總蛋白的50。2、屬于真核表達系統(tǒng)。有糖基化作用、脂肪酸?；饔?、氨基末端乙酰化作用以及磷酸化，有利于表達產(chǎn)物形成天然的高級結(jié)構(gòu)，保持原有的生物活性與功能。3、桿狀病毒能容納較大的外源基因而不影響其本身的增殖。584、桿狀病毒屬于昆蟲病毒。具有高度特異的宿主范圍，對脊椎動物和植物均無致病性。病毒重組因失去多角體保護，在自然界的生存能力很弱，因此比較

29、安全。5、應(yīng)用晚期多角體蛋白基因啟動子表達外源基因可表達毒性蛋白。 6、桿狀病毒表達載體通用性廣?？杀磉_來自病毒、細菌、真菌、植物和動物幾乎所有的蛋白，并且能表達帶有內(nèi)含子的外源基因。 7、重組桿狀病毒除在體外昆蟲培養(yǎng)細胞表達外源基因外，還能感染昆蟲活體，在體內(nèi)高效表達外源蛋白。59缺點： 宿主細胞生長慢培養(yǎng)基昂貴含有免疫宿主蛋白、 桿狀病毒感染會導(dǎo)致宿主死亡、因此每一輪蛋白合成均需重新感染昆蟲細胞內(nèi)的糖基化方式與脊椎動物細胞內(nèi)的糖基化方式有一定的差異，其糖蛋白的糖鏈結(jié)構(gòu)多為簡單的不分支結(jié)構(gòu)。 60啟動子采用多角體蛋白啟動子。宿主細胞通常來源于雙翅目昆蟲，包括果蠅、蚊子。來源于草地夜蛾（Spo

30、doptera frugiperda）的Sf9細胞系是最常用的宿主細胞。商品化系統(tǒng)：BaculoDirect 桿狀病毒表達系統(tǒng)（invitrogen），典型的桿狀病毒表達系統(tǒng)是利用大腸桿菌中位點特異的轉(zhuǎn)座或昆蟲細胞中的同源重組來產(chǎn)生重組桿狀病毒。 DES-Drosophila expression system 結(jié)合了昆蟲細胞高表達水平和哺乳動物細胞的穩(wěn)定表達的優(yōu)點。 61 （三）哺乳動物細胞表達系統(tǒng) 哺乳動物細胞表達系統(tǒng)是生產(chǎn)天然蛋白的理想表達系統(tǒng)，是目前應(yīng)用最廣泛的動物細胞表達系統(tǒng)。其優(yōu)點和缺點都極其顯著。產(chǎn)物的抗原性、免疫原性和功能與天然蛋白質(zhì)最接近，糖基化等后加工最精確。一般會產(chǎn)生正確

31、加工的、有活性的蛋白。62 但該表達系統(tǒng)的表達水平較低、培養(yǎng)基昂貴、生長緩慢、含有過敏物質(zhì)等缺點在實際應(yīng)用過程中較難避免。哺乳動物細胞表達系統(tǒng)通常用來生產(chǎn)用常規(guī)方法無法獲得的真核細胞蛋白。如EPO，TNF受體，基因工程單抗等。 CHO（中國倉鼠卵巢）是目前重組糖蛋白生產(chǎn)的首選體系。 63載體：1、病毒性載體系統(tǒng)，包括逆轉(zhuǎn)錄病毒載體及其它DNA病毒載體。 優(yōu)點：能夠高效導(dǎo)入外源基因。 缺點：包裝時對其基因組的長度有嚴格的限制，插入外源基因一般較短。2、質(zhì)粒性載體系統(tǒng)。 優(yōu)點：適用于多種細胞；安全。 缺點：導(dǎo)入外源基因的效率不如逆轉(zhuǎn)錄病毒。 64商品化系統(tǒng)：ViraPower慢病毒表達系統(tǒng)，是第一

32、次實現(xiàn)在不分裂的哺乳動物細胞中進行穩(wěn)定的高水平基因表達。Adeno-X 表達系統(tǒng)最有效的腺病毒系統(tǒng)之一。BD Adeno-X Expression System (Clontech)可以在2周內(nèi)獲得高效價的腺病毒，其效率遠高于其他腺病毒系統(tǒng)。BD Adeno-X Tet-On & Adeno-X Tet-Off Expression Systems (Clontech) 可表達毒性蛋白質(zhì)。BD RevTet-On & RevTet-Off Gene Expression Systems (Clontech) 表達效率高。 65新霉素抗性選擇系統(tǒng) 新霉素是細菌抗生素，它可以干擾原核生物的核糖體，

33、使其蛋白質(zhì)合成不能正常進行，而真核細胞核糖體則不受新霉索的影響。新霉素的一種類似物G418(geneticin)對真核細胞和原核細胞均有毒性。66 細菌的新霉素抗性基因(neor)能在真核細胞表達。neor基因編碼一種磷酸轉(zhuǎn)移酶，這種酶能使G418失活。所以，當(dāng)細胞表達了這種neo抗性基因后就會在含有G418的選擇培養(yǎng)基中存活，這種選擇系統(tǒng)適用于所有的細胞類型。67外源基因?qū)氩溉閯游锛毎?目的基因序列與載體連接后，要導(dǎo)入細胞中才能繁殖擴增，再經(jīng)過篩選，才能獲得重組DNA分子克隆，不同的載體在不同的宿主細胞中繁殖，導(dǎo)入細胞的方法也不相同。 68轉(zhuǎn)染方法（一）質(zhì)粒為載體的物理化學(xué)轉(zhuǎn)染法（二）以病

34、毒為載體的生物學(xué)轉(zhuǎn)染法69磷酸鈣法 其利用的基本現(xiàn)象是：DNA如以磷酸鈣-DNA共沉淀物形式出現(xiàn)時，培養(yǎng)細胞攝取DNA的效率會顯著提高。用電穿孔法處理培養(yǎng)的哺乳類細胞也能提高細胞攝取DNA能力，但所用外加電場的強度、電脈沖的長度等條件與處理細菌者都很不相同。70脂質(zhì)體 近年來用人工脂質(zhì)膜包裹DNA，形成的脂質(zhì)體（Liposome）可以通過與細胞膜融合而將DNA導(dǎo)入細胞，方法簡單而有效，現(xiàn)有商售的脂質(zhì)體試劑，使用日益廣泛。 71顯微注射法 是在顯微鏡直視下，向細胞核內(nèi)直接注射外源基因，這種方法應(yīng)是有效的。但一次只能注射一個細胞，工作耗力費時。72電穿孔轉(zhuǎn)染法（electroporation） 用

35、高電壓脈沖短暫作用于細菌也能顯著提高轉(zhuǎn)化效率。 73 以病毒為載體的生物學(xué)轉(zhuǎn)染法 將目的基因插入病毒載體，在病毒調(diào)控元件作用下進行表達。作為運載工具的病毒有SV40，人腺病毒，牛乳頭瘤病毒，逆轉(zhuǎn)錄病毒等。74外源基因在真核細胞中的表達方式 常用的表達方式有兩大類：1、瞬時表達2、穩(wěn)定表達系統(tǒng)75瞬時表達系統(tǒng) 瞬時表達的效率取決于吸收DNA的細胞數(shù)、基因拷貝數(shù)和基因的表達水平，在瞬時表達系統(tǒng)中，吸收DNA的細胞數(shù)約為5%50%。因為沒有整合，隨著細胞的生長，細胞群體中外源基因的含量逐步減少，最后消失。因此瞬時表達系統(tǒng)只能使用數(shù)天。76 瞬時表達常用于下列方面：根據(jù)表達活性確證分離到的基因；研究誘

36、變對蛋白質(zhì)活性和功能的影響；分離cDNA文庫中的基因。這種系統(tǒng)的缺點是不能大量繁殖能產(chǎn)生特異蛋白質(zhì)的細胞，故不能獲得大量的蛋白質(zhì)(1mg)，也不能用于研究在特定條件下才能表達的基因。77穩(wěn)定表達系統(tǒng) 如果在轉(zhuǎn)染DNA后進行篩選。則可能得到外源基因整合到染色體中的穩(wěn)定表達的細胞。不同品系的細胞轉(zhuǎn)染和整合DNA的能力不同，而在篩選獲得穩(wěn)定表達的細胞過程中，整合的能力比轉(zhuǎn)染的能力更重要。7879（四）轉(zhuǎn)基因植物80與微生物和動物生物生物反應(yīng)器相比,植物生物反應(yīng)器有不可替代的優(yōu)越性1.生產(chǎn)成本較低,易于大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)。植物能進行光合作用,僅需要來自土壤的礦物質(zhì)和水分便可在適宜的條件下獲得大量人們所需的

37、轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物2.植物細胞具有全能性,易于獲得再生植株,遺傳操作相對簡單,培養(yǎng)周期較短3.轉(zhuǎn)基因植物通過自交得到的后代遺傳性狀穩(wěn)定,從而可以在植物體內(nèi)積累多基因4.產(chǎn)物貯藏在種子、果實和塊莖中便于貯運,其中那些能直接食用的植物疫苗不需特殊貯存條件815.無毒副作用,安全性好細菌作為生物反應(yīng)器時,不能對真核生物的蛋白進行有效的翻譯后加工,而且本身可能是人類病原物動物作為生物反應(yīng)器時,在細胞培養(yǎng)過程中可能感染上動物病毒而對人類健康造成潛在危害植物作為生物反應(yīng)器被認為是相對安全的,因為植物體只表達病原菌的部分免疫蛋白,不含致病微生物或潛在的致病微生物,對人蓄安全,大大提高了表達產(chǎn)物的生物安全性6.植物中

38、的蛋白加工途徑相對保守,表達產(chǎn)物能進行正確的糖基化、磷酸化、酰胺化及翻譯后加工過程,因此表達產(chǎn)物具有與高等動物細胞一樣的免疫原性和生物活性82植物轉(zhuǎn)基因主要方法農(nóng)桿菌導(dǎo)入法這種方法是將農(nóng)桿菌與植物細胞共同培養(yǎng) , 用農(nóng)桿菌整合的目的基因的質(zhì)粒去轉(zhuǎn)化植物細胞 , 然后通過組織培養(yǎng) , 獲得轉(zhuǎn)基因植株基因槍法這種方法用表面附著DNA分子 (含目的基因) 的金屬微粒 , 經(jīng)過加速裝置 , 轟擊植物細胞 , 將DNA直接射入植物帶壁的細胞 , 轉(zhuǎn)化率可達 8 %10 %。這種方法不受受體種類限制 ,快速簡單 , 但設(shè)備昂貴花粉管通道法將目的基因整合后 , 在植株開化時利用花粉管通道直接導(dǎo)入受體植株。這

39、是我國科學(xué)工作者發(fā)明的方法 , 主要用于棉花轉(zhuǎn)基因研究。8384轉(zhuǎn)基因植物在醫(yī)藥中的應(yīng)用疫苗藥用蛋白858687轉(zhuǎn)基因植物表達體系的問題及解決方案1、外源蛋白表達量低蛋白質(zhì)靶向定位定位到合適的亞細胞部位，如細胞質(zhì)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔、葉綠體、液泡等。外源基因整合到葉綠體基因組后表達量最大可達到葉片可溶性蛋白的46.1%對外源基因進行優(yōu)化使用植物偏好密碼子優(yōu)化前導(dǎo)肽序列，取出mRNA中不穩(wěn)定序列和無效抑制序列，并同時表達有助于正確折疊的酶或蛋白質(zhì)，如分子伴侶等合理選擇啟動子并加以改造使用增強子序列，利用組織特異性的啟動子，或者人工構(gòu)建復(fù)合式啟動子如與花椰菜花葉病毒35S啟動子相比，增強型雙35S啟動子可以

40、使外源基因轉(zhuǎn)錄效率高出10倍88使用核基質(zhì)附著區(qū)MAR序列利用染色質(zhì)高級結(jié)構(gòu)的特點，將MAR連接于外源基因兩側(cè)，可使外源基因稱為一獨立的轉(zhuǎn)錄單元，減少周邊序列的影響。即可避免外源基因表達的位置效應(yīng)，又可提高外源基因在轉(zhuǎn)化細胞中的穩(wěn)定性和表達水平使用植物病毒表達載體病毒載體在宿主細胞中能夠反復(fù)復(fù)制且繁殖速度快，可使外源基因在短時間內(nèi)大量積累并高效表達892、下游加工成本高對基因表達產(chǎn)物進行提純費用較高合理選擇受體系統(tǒng)，如將外源基因整合到直接是用的植物中或植物的可食器官即可避免或部分避免表達產(chǎn)物的加工如香蕉：易消化、口感好，且在熱帶和亞熱帶常年生長，是食用疫苗的理想宿主3、安全性問題植物種類的安全

41、性，如煙草的煙堿污染外源基因?qū)ι鷳B(tài)環(huán)境的影響90（五）轉(zhuǎn)基因動物技術(shù)及其新藥研發(fā)中的應(yīng)用91轉(zhuǎn)基因動物技術(shù)始于80年代初，所謂轉(zhuǎn)基因動物就是指以實驗方法將外源基因?qū)雱游锶旧w基因組內(nèi)穩(wěn)定整合并能遺傳給后代的一類動物。近十年來，轉(zhuǎn)基因動物研究發(fā)展十分迅速，已先后建立了許多整合有外源基因的轉(zhuǎn)基因小鼠和大鼠，轉(zhuǎn)基因魚、兔、豬、羊、牛等也已誕生。由于轉(zhuǎn)基因動物體系打破了自然繁殖中的種間隔離，使基因能在種系關(guān)系很遠的機體間流動，它將對整個生命科學(xué)產(chǎn)生全局性影響，因此轉(zhuǎn)基因動物技術(shù)在1991年第一次國際基因定位會議上被公認為遺傳學(xué)中繼連鎖分析、體細胞遺傳和基因克隆之后的第四代技術(shù)，被列為生物學(xué)發(fā)展史上1

42、26年中第14個轉(zhuǎn)折點。9293一、轉(zhuǎn)基因動物的技術(shù)研究 步驟： 構(gòu)建功能基因 轉(zhuǎn)移 生殖細胞 假孕母體發(fā)育 表型分析 轉(zhuǎn)基因動物94方法：原核DNA顯微注射法(Pronuclear DNA microinjection)多能性干細胞法（Pluripotent stem cells）病毒載體法（viral vectors）精子介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移法（Sperm-mediated gene transfer）核轉(zhuǎn)移法（nuclear transfer） 951.原核顯微注射法96原核顯微注射法優(yōu)缺點：優(yōu)點：1.整合效率高；2.外源基因長度可達數(shù)百Kb；3.直接獲得純系動物，實驗周期相對較短。缺點：1.

43、設(shè)備昂貴、操作復(fù)雜；2.隨機整合、拷貝數(shù)無法控制；3.常造成插入位點附近宿主DNA大片段缺失、重組等突變，出現(xiàn)動物嚴重生理缺陷。972多能性干細胞法 主要是胚胎干細胞（Embryonic Stem Cell，ESC），是從早期胚胎的內(nèi)細胞團經(jīng)體外培養(yǎng)建立起來的多潛能細胞系，具有胚胎細胞相似的形態(tài)特征和分化特征。在適當(dāng)?shù)臈l件下可參與胚胎構(gòu)成，從而產(chǎn)生嵌合體動物。 ESC法是在基因組相應(yīng)位點進行同源重組或置換，而將外源DNA定向整合到內(nèi)源基因組中表達。 9899胚胎干細胞法的優(yōu)缺點：優(yōu)點：在將胚胎干細胞植入胚胎前，可以在體外選擇一個特殊的基因型；用外源DNA轉(zhuǎn)染以后，胚胎干細胞可以被克隆，繼而可以

44、篩選含有整合外源DNA的細胞用于細胞融合，由此可以得到很多遺傳上相同的轉(zhuǎn)基因動物。100缺點： 許多嵌合體轉(zhuǎn)基因動物生殖細胞內(nèi)不含有轉(zhuǎn)基因，須進一步雜交才能獲得轉(zhuǎn)基因動物。1013病毒載體法 將目的基因以RNA分子的形式重組到逆轉(zhuǎn)錄病毒載體上，制成高濃度的病毒顆粒，人為感染著床前或著床后的胚胎，也可以直接將胚胎與能釋放逆轉(zhuǎn)錄病毒的單層培養(yǎng)細胞共孵育以達到感染的目的。然后在逆轉(zhuǎn)錄整合酶和逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組末端的特異性核酸序列的作用下，目的基因?qū)⒈环崔D(zhuǎn)錄并整合到宿主基因組中去。102病毒載體法優(yōu)缺點：優(yōu)點：1.目的基因呈單一位點單拷貝整合、整合率高 ；2.插入位點克隆分析較容易 ；缺點：1.不安全；

45、 2.轉(zhuǎn)入基因的承載能力有限，一般小于10Kb ；3.所得轉(zhuǎn)基因動物的嵌合性很高，建立轉(zhuǎn)基因系需要廣泛的雜交 ；4.逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組兩側(cè)的長末端重復(fù)序列（longterminal repeats, LTRs）會影響哺乳動物的啟動子或引起錯誤表達，其甲基化狀態(tài)常使轉(zhuǎn)基因的表達缺失 1034精子介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移法 在精子后頂體區(qū)域有一種DNA結(jié)合蛋白（DBPs），它可以介導(dǎo)外源DNA與精子表面結(jié)合。受精后外源DNA即可整合于染色體中。 簡單、方便，依靠生理受精過程，免去了原核的損傷。 主要有三種方式：胞質(zhì)內(nèi)精子注射途徑（ICSI）、電轉(zhuǎn)移或脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染途徑、睪丸體內(nèi)轉(zhuǎn)染途徑 1045核轉(zhuǎn)移法 1996

46、年，Schnieke用人類因子IX（human factor IX）轉(zhuǎn)染綿羊胎兒纖維母細胞，再將轉(zhuǎn)染細胞的細胞核通過核轉(zhuǎn)移得到HF IX轉(zhuǎn)基因綿羊。 將供體細胞核轉(zhuǎn)入到受精卵的胞質(zhì)或MII期卵母細胞中，供體細胞的核以及胞質(zhì)成分，包括線粒體等，就都會被轉(zhuǎn)移。后者可能會促使胚胎重構(gòu)、胎兒發(fā)育以及分娩新生個體。 105與DNA顯微注射法相比： 1.根據(jù)具體方案的要求可選擇雄性或雌性細胞株；2.序列的整合和表達在轉(zhuǎn)染后，細胞用于核供體之前就可以檢測；3.轉(zhuǎn)染的細胞可以凍存長期保存；4.在一個克隆動物體內(nèi)的所有細胞都含有目的基因，避免了遺傳差異性，并確保生殖細胞也轉(zhuǎn)移了目的基因；5.得到轉(zhuǎn)基因動物的效率

47、比顯微注射幾乎高一倍。1066. 轉(zhuǎn)基因動物的誘導(dǎo)表達系統(tǒng)外源基因轉(zhuǎn)入動物體內(nèi)后，其過量表達常常會對胚胎的發(fā)育產(chǎn)生毒性作用甚至致死作用，從而影響了表型的分析甚至無法獲得轉(zhuǎn)基因系。目前發(fā)展比較成熟的轉(zhuǎn)基因可誘導(dǎo)表達系統(tǒng)主要有兩種18：四環(huán)素誘導(dǎo)系統(tǒng)（tet系統(tǒng)）和Cre/loxP重組酶系統(tǒng)。107 這兩個系統(tǒng)均需要制備兩個系列的轉(zhuǎn)基因動物，一個系列表達具有選擇性組織特異性啟動子調(diào)控下的激動子依賴于四環(huán)素調(diào)控的反式作用子/反向反式作用子（transactivator/reverse transactivator，tTA/rtTA）或Cre重組酶，另一個系列表達經(jīng)過重建的轉(zhuǎn)基因，它是在tTA/rtTA依賴的啟動子（主要是tet O）或側(cè)翼的loxP序列調(diào)控下進行表達的。對這兩個系列進行雜交就可以得到可對外源基因表達進行時間和空間上調(diào)控的子代動物。 108tet系統(tǒng)： 1.采用tTA的tet-OFF系統(tǒng)，在缺乏四環(huán)素及其衍生物（如強力霉素doxycycli