葡萄酒的氣相色譜分析

1、葡萄酒的氣相色譜分析第一部分分析方法的設置在葡萄成熟期和葡萄汁發(fā)酵過程中，存在著許多生物和微生物現(xiàn)象。這些現(xiàn)象的爭相作 用就轉化出多種化學物質。另外，這些不同的物質又可以起純化學反應，或被微生物作用再 產生出新的化學成分。這一系列持續(xù)不斷的變化過程，使得葡萄酒的成分極為復雜。因此提 出葡萄酒的分析方法，應能夠無變化地分離這些物質，而且對于定量具有明顯感官特性的極 微量成分，應該具有極高的靈敏性。近年來，人們選用氣相色譜法分析研究葡萄酒，做了大 量工作，成績十分顯著，可以分析400多種揮發(fā)性的芳香物質。本文是筆者試圖對在實際 分析工作中應該注意的主要問題的總結，同時介紹一些比較成熟的分析方法。一

2、、實驗技術上的注意事項對儀器的兩點改進直接注射酒樣于氣相色譜儀中，是一種最簡單的分析方法，通常給出的結果也是最精確 的；在可能的情況下，應盡量使用這種方法。但一些不揮發(fā)的物質會停留在注射器中，產生 熱解作用而干擾分析結果；另外，一些衍生物是不穩(wěn)定的，如某些酸的三甲基硅烷脂，它們 的分解可被注射器的金屬內壁催化。這兩件事應當注意。為克服這種現(xiàn)象，須對儀器稍加改 進?？刹捎迷谧⑸淦髦胁迦胍粋€石英玻璃管，使其具有最大的化學惰性，并很容易卸下來清 洗（在分析未發(fā)酵的葡萄汁或含有很多糖的葡萄酒時，每三次注射后清洗一次）。這是一種 極簡單而又實用的方法。在研究三甲基硅烷衍生物的時候，出現(xiàn)硅鋪滿了檢測器的內

3、壁使其 失去靈敏性的現(xiàn)象；為了避免這一點，須改進檢測器?？稍谖挥跈z測器內部的小帽上焊接一 個直徑4毫米的不銹鋼煙管，下部裝一個喇叭形的玻璃小帽，硅煙被煙管引向外面，達到 火焰頂部；或者在檢測器出口處加一煙囪小帽可獲得同樣效果。對1/8寸的經典柱，氫氣流 量減小為25毫升/分，空氣流量增大到450毫升/分，在這種情況下，檢測器雖不是最靈敏 的，但硅煙能很快被排出，硅的沉積物減少90%以上，一般10次2微升注射后清洗電極就 夠了。色譜元件使用的色譜柱應該與分析的物質相適應。一般用經典的不銹鋼柱，在分析低溫穩(wěn)定產品 時用銅柱，在分析一些與金屬接觸會分解的產品時用石英柱。擔體粒度一般用0.18到0.2

4、5 毫米，或0.10到0.18毫米（即用23號或24號和25號標準篩濾器過篩）的。隨著分析種 類的不同，擔體或者被加熱活化，或者相反除去活性。例如分析醇和脂時，擔體被加熱到 850r,保持4小時，可以得到乙酸乙脂、甲醇、乙醇等峰的好的分辨率；相反，在分析游 離酸，或三甲基硅烷衍生物時，必須使擔體盡可能老化。擔體chromososorbw被六甲基二 硅氨烷處理，可以減少峰的拖尾。盡管有許多文獻敘述了各種固定相的可用性，但對于給定的分析，為了得到最好的測定 結果，經常還是要做試驗。我們用Carbwax400和Hallcomid M1801的混合成分用于分析 蒸餾酒中的揮發(fā)物質。在進行游離揮發(fā)酸的分

5、析時，應當在常用的固定相中加入1%的磷酸。分析條件每次分析都要校準柱中的氣體流量、柱溫和樣品的注射體積。在實際應用中，對一個普 通的1/8 口寸柱，最佳流量是20到25毫升/分。爐溫的選擇是使一次分析用不太長的時間（15到45分鐘）便可得到使各個峰很好的分 離的色譜圖。在分析被溶劑萃取的物質成分或分析多羥基組份的三甲基硅烷衍生物時，可能 不得不采用一個重現(xiàn)性結果不夠理想的溫度程序。樣品注射體積對1/8 口寸柱來說通常是2微升，最多不超過5微升。但對1/4 口寸的制備柱可 以是50或60微升。注射器的溫度要比柱子使用的最高溫度高50r，檢測器的溫度應該高 于柱溫幾十度。注射樣品濃度一般在10毫克

6、/升以上。由于儀器引起的背景噪聲；火焰的變 化；被載氣帶入的固定液的損失所造成的基線改變等，這些變化都會改變峰面積，使得小于 10毫克/升濃度的物質很難測出。對于濃度過低的物質需要進行濃縮，一般采用惰性氣體提 取法、有機溶劑萃取法和用礦物鹽和飽和醇相中的水使有機成分濃縮等方法。一些多羥基化物由于分子之間存在氫鍵而不揮發(fā)，為了用氣相色譜來研究這些物質，就 需除去氫鍵。醇功能團上的氫可以被乙?；蛉谆柰槿〈虮凰嶂?，生成的新化合物 是熱穩(wěn)定的，盡管它們的分子量比原先大，但還是能很好地揮發(fā)。離子交換樹脂的應用對化學成分過于復雜的酒，最好用離子交換樹脂進行族分離來分別分析，避免過多的色 譜圖。用

7、57毫升陰離子樹脂BioRed Dowex2x8或AG2x8處理5毫升酒樣，可以固 定酒里的酸，然后被6N的甲酸溶液洗出，能夠獲得較好的色譜分離。用10毫升 Amberlite IRA400 OH型樹脂處理3毫升酒樣，可以固定糖和酸，使多元醇在流出液和水洗 液中全部得到回收，這對單獨研究多元醇是很方便的。MERCKII陰離子樹脂可以不經預先活化處理，只要在水中充分溶脹后，保存在30%的乙酸溶液中即可使用，但給出的結果不如其他樹脂好。二、定性分析在好的色譜測定條件下，每個物質的保留時間是不變的，所以鑒定一個物質 的保留時間就可以識別它。然而這種鑒定往往不是一目了然的，尤其是對某些未 知峰，除了用

8、已知文獻資料對照查找外，往往還需采用不同的技術來確證。離子交換Dowex2或Mercklll型樹脂可固定酒中的酸，然后被甲酸洗脫。這些柱同樣可 以檢出會在流出液和水洗液中的中性物質。Amberlite IRA400的OH 一除去糖。皂化用KOH溶液皂化一個酒可以除去脂，隨后的萃取液中將不存在這些脂。使一 個酒保持PH12.3,在40連續(xù)通氮氣24小時，它的色譜圖與對照樣品比較，相 當于脂的峰已經消失。水解酸水解一個酒可以鑒定海藻糖。用3N鹽溶液回流2小時，將酒水解，它的 三甲基硅烷脂的色譜圖表明，海藻糖全部消失，轉化為葡萄糖。還原用氫硼化鈉還原醛糖變?yōu)槿┨谴肌．斁浦写嬖谀咎菚r，木糖醇的峰明顯增

9、加。 若酒中存在相應于其它醛糖的多元醇時，不可能用這種方法。生成各種衍生物利用特性反應生成衍生物可精確地鑒定物質，而且可以生成不同類型的衍生 物使得同系物很好地分離。山梨糖醇、甘腐糖醇和己六醇的三甲基硅烷衍生物是 分離不好的，但乙酰基衍生物分離就較好。當然也可以選用不同的柱子來分離?；瘜W處理化學處理如萃取可以鑒定一些物質。比如在Saccharomyces cidri發(fā)酵液中 加入一滴硫酸，用氮氣處理2小時后，萃取物色譜圖中的縮醛峰幾乎全部消失了； 同樣，用乙醚萃取酒中的揮發(fā)酸，然后用2M的NaHCO3溶液清洗使之消失。用通 氮氣法可進行許多單一脂的濃縮以及最高分子量為C10的乙脂的濃縮。這些脂

10、可 以被濃縮500倍，而醇只能濃縮10到20倍。用己烷萃取也可得到高濃度的高分 子量的脂。用乙醚萃取脂肪酸效果也很好。注射純物質在同樣的條件下注射純物質，對比它們的保留時間，來鑒定色譜圖中的未知 物，是常用的方法。為了消除溫度和其他客觀因素的影響，最好是同時注射純物 質和樣品，即在樣品中加入一點純物質，使得相一致的峰增高1到2厘米。這些 純物質必須是單一的峰，不能有任何分離。注射同系物在沒有純物質用于鑒定未知物時，有時可以注射相同系列的同系物。比如， 所有的線性脂肪酸可以用于鑒定未知脂肪酸。我們知道這些物質的保留時間對數(shù) 量與分子的碳原子數(shù)成線性關系，它可以測定在這個系列中，未知物是否可能出

11、現(xiàn)。光譜法鑒定對一些用以上敘述的方法難以鑒定的未知物，需進行收集物質用于紅外分光 光度鑒定，或色質譜聯(lián)合使用可以鑒定完全未知的新物質。三、定量分析內標準的選擇定量醇我們不用丁醇一1做內標，因為在葡萄酒中總是存在著少量的丁醇一 1，有時在蒸餾酒中它的量還是較大的。戊醇一1在定量高級醇時，它的保留時 間太長，同樣不能使用。直接注射酒樣定量甲醇、乙酸乙脂和高級醇時，我們用 4一甲基戊醇一2做內標。定量乳酸乙脂、乙酸乙脂、2, 3一丁醇和丙醇，選用3 一羥基乙酸乙脂做內標。定量丙三醇和2, 3一丁二醇用5甲基-3-己醇做內標。 庚酸可作為定量有機酸的內標準。2甲基丙基丁醇或己基己脂可被選用定量脂 的內

12、標。定量葡萄酒中的防腐劑可用十一酸做內標。對混合分層的濃縮物定量時 用4甲基戊醇一1做內標。？一苯基乙酸乙脂可作為單一定量?一苯基乙醇的內 標，因為它們的濃度系數(shù)非常接近。定量多羥基化物時選用香草酸做內標，也可 用戊二酸做內標。定量糖和多元醇選用季戊四醇做內標。參考溶液的配制定量分析需要用純物質配置與酒樣相同的已知化學成分的參考溶液，用與酒 樣相同的方法處理這個溶液，隨后做標準曲線來證明方法的可靠性。配制的溶液 含有10%的乙醇，調pH到3左右。重現(xiàn)性的測定一種定量方法能夠使用，首先需要知道它的重現(xiàn)性，即經過對同樣方法處理 的同樣產品的10個樣品分析結果看其再現(xiàn)性是否良好。也要測定其平均偏差。

13、 我們通常習慣測定這10個分析結果的平均偏差，基本上可以確定這種操作的定 量精確性。在直接注射酒樣的色譜定量中，其精密度是3%，但在酒通過離子交 換樹脂并在真空下濃縮的衍生物，平均偏差可能達到15%。標準曲線的測定按照葡萄酒中的成分，精確地配制各種不同濃度的溶液來測定檢測器的應答 和濃度之間的關系。一般做5次測定就夠了。當一個物質在色譜圖中出現(xiàn)幾個峰 時，需計算它們的總面積。如還原糖的?和?兩種形式都要計算在內。在我們進行 的所有定量中，標準曲線都是經過原點的直線。測定加入的已知量物質葡萄酒的成分是非常復雜的，人們常常擔心其中的一些物質與另外的物質相 互作用而干擾定量分析。常常用同樣的方法測定

14、，而得到的結果都有些差異，如 測定配制的參考溶液，結果很好，而測定酒樣就差一些。為了消除疑慮，我們可 以先單獨地測定酒樣，然后加一定量的各種已知物于該酒樣中，再來定量，加入 酒中的物質的濃度順序應當與酒中原來物質的濃度次序一樣。加入的量應當被準 確地測定出來。結果的表達按下面公式計算一個物質的濃度：c=CXh/HXI/Ic 一樣品中該物質的濃度；C 一對照溶液中該物質的濃度；h 一樣品中該物質的峰面積或峰高；H 一對照溶液中該物質的峰面積或峰高；i一樣品中內標準的峰面積或峰高；I 一對照溶液中內標準的峰面積或峰高。色譜法定量與化學法定量的比較由于葡萄酒中的許多成分可以用化學法定量，所以我們可以

15、比較色譜法和化 學法定量的結果，便知其優(yōu)劣。對于酸、醇和脂其結果是完全可以比較的。對糖 而言，如果在酒中的相對含量是很大的，其結果也是完全一樣的，但對于酒中的 還原糖，用不同的化學分析法和色譜法的結果比較，變化很大。因為葡萄酒中有 些還原物質如半乳糖酸和一些醛糖酸同樣消耗菲林溶液，處理方法不同，結果并 不能完全表示還原糖。同樣在化學法和色譜法之間，定量多元醇的結果也是有差 別的。第二部分酒中主要成分的定量分析用氣相色譜法定量酒的化學成分，一般來說更正確一些，因為它可以測定各 個物質的個體濃度，而化學法一般只是定量一個總體。在對葡萄酒進行深入的研 究過程中，我們不僅要了解各種成分的總體特性，而且

16、必須了解對酒質起重要作 用的各主要成分的個體特性和相互關系以及隨著環(huán)境條件的改變這些成分的演 變，這樣我們就能有目的地改變環(huán)境條件，使有益成分增加，無益成分減少，按 照消費的需要生產出各種各樣的酒。在氣相色譜法定量中，對有足夠含量的揮發(fā)性物質，盡量用直接注射法測定; 對含量微小的揮發(fā)性物質必須事先濃縮，比如用通惰性氣體冷凝捕集濃縮，或溶 液分層分離濃縮，或用有機溶劑萃取濃縮等；對不揮發(fā)性物質需予先生成揮發(fā)性 的衍生物進行測定。下面介紹一些目前比較成熟的分析方法，也是葡萄酒研究中 最常用的方法。（一）直接注射酒樣定量分析在葡萄酒的揮發(fā)性物質中，丙三醇、2, 3一丁二醇、乙酸乙酯、乳酸乙酯、 乙酸

17、、丙酸、甲醇和一些高級醇有足夠的含量，可以直接注射酒樣進行定量分析。1.丙三醇和2，3丁二醇的定量丙三醇和2, 3一丁二醇是酒精發(fā)酵的產物，它們存在于一切葡萄酒中。丙 三醇在葡萄酒中的含量是除乙醇外最高的有機物，通常在420克/升之間。它們 雖然可以用分析其他多元醇的方法去定量，但在實際應用中用直接注射酒樣來定 量更為方便。操作方法：于20毫升酒樣中加入2毫升1，4丁二醇內標準溶液（20克1， 4一丁二醇溶于1升10%的酒精水溶液中），在電磁攪拌下充分混合均勻。注射2 微升該混合液于Chromosorb101柱來分析丙三醇，于Tenax GC柱來分析2，3 丁二醇。如果在1，4一丁二醇處有峰，

18、也可用1，6一乙二醇做內標準（40克/ 升的10%酒精水溶液）。2.乙酸乙酯、甲醇、正丙醇、2甲基丙醇一1、2一甲基丁醇一1和3一甲 基丁醇一1的定量在葡萄酒中乙酸乙酯常占揮發(fā)酯的80%以上，它也是酒精發(fā)酵中的產物，對 酒的氣味有明顯影響。它的含量過高會使酒帶有刺激性的酸味。甲醇來源于葡萄 果漿的水解，它的致死劑量約為100毫升，對人體極其有害，必須嚴格控制其含 量。雜醇油也是酒精發(fā)酵時氨基酸被酵母代謝后的產物，它們的含量太高時對白 葡萄酒的味覺性質有損害。定量這些物質對評價酒的質量有一定參考價值。操作方法：于50毫升酒樣中加入5毫升4甲基戊醇一2標準溶液（1克/ 升的10%酒精水溶液），電磁

19、攪拌均勻，以2微升注入C+H柱 （Carbowax400 4%+Hallcomid M1801 1%）測定。參考溶液用1升10%的乙醇溶液中含：100毫克甲醇和2甲基丙醇一1，50 毫克乙酸乙酯，25毫克丙醇一1，12.5毫克丁醇一1，58毫克2甲基丁醇一1， 192毫克3甲基丁醇一1。3. 2苯基乙醇的定量這個高級醇用直接注射法定量是很困難的，還很少有人采用這種方法。我們研究用2米 長的F.F.A.P柱，在140C下以12醇一1為內標（500毫克/升的50%乙醇溶液）直接注射 定量，最大平均偏差5.8%。此法對甜酒也可應用，因它的峰與來自糖分解的峰互不干涉， 但需經常清洗注射器插頭。2一苯基

20、乙醇具有愉快的香味，而它的感知極限較低（約為50 毫克/升），增加它的含量是有益的。在酒中它的含量常在10毫克/升以下。4.乳酸乙酯、乙酸、丙酸和2, 3丁二醇的定量乙酸在葡萄酒中的含量可達到350毫克/升，它是酒精發(fā)酵時被酶氧化乙醇生成的，另外 細菌氧化糖或乙醇也可生成乙酸，在酒中其他的脂肪酸含量都比乙醇小得多。丙酸的含量大 約從2.9毫克/升到5.6毫克/升的范圍內波動。2, 3丁二醇有左旋和內消旋兩種異構體， 結果計算需加在一起。操作方法：于20毫升酒樣中加入2毫升3羥基乙酸乙酯內標溶液（5克/升的20%乙醇 水溶液），攪拌均勻，以2微升注入D.E.G.CH3PO4柱中。對照溶液有兩種配

21、制：第一種含有200毫克/升乙酸和20毫克/升丙酸，第二種是50毫 克/升的乳酸乙酯和600毫克/升的2, 3丁二醇（70%的左旋型和30%的內消旋型混合，它們是被制備色譜收集的）。（二）萃取法定量酯、揮發(fā)酸和防腐劑對于在葡萄酒中含量極微而又具有明顯感官特性的物質，不能用直接注射法測定，需對 酒樣做前處理。有機溶劑萃取法就是先用有機溶劑萃取濃縮葡萄酒中的一些芳香物質，然后 用氣相色譜定量。用毛細管柱定量酯類化合物一些高分子量的酯常具有花香或水果香味，構成葡萄酒的一定感官特性，定量分析這些 酯對葡萄酒工藝的研究和對酒質的評價都是有意義的。在葡萄酒中，絕大部分的酯是由酶酯 化生成的，只極少部分是化

22、學酯化生成的。操作方法：50毫升酒樣加入20毫升辛醇標準溶液（30毫克辛醇于1升20%的乙醇水溶 液），用1 ： 1體積的乙醚乙烷溶劑萃取4次，取2微升萃取液注入W.C.O.T毛細管空心 柱（固定相為F.F.A.P）。溫度程序為：起始溫度50C保持1分鐘，然后以3C/分的速率 升溫至190 C保持10分鐘。參考溶液（1升20%的乙醇水溶液中含有：乙酸異戊酯2.5毫克，乙酸乙酯1.5毫克，乙 醇2.3毫克，異戊醇12.0毫克，乙酸己酯1.0毫克，辛酸乙酯2.0毫克，癸酸乙酯1.5毫克， 琥珀酸乙酯4.0毫克，乙酸2-苯基乙酯1.0毫克，2苯基乙醇12.0毫克，十二酸乙酯2.0 毫克。）揮發(fā)酸的定

23、量葡萄酒中的揮發(fā)酸是發(fā)酵二級產物，其中乙酸和乳酸的含量最多，其他脂肪酸含量都很 小，但它們的感官作用是不可忽視的。操作方法：取50毫克酒樣加1毫升庚酸內標溶液（15%的乙醇溶液），中和至pH7.5, 在50C下減壓蒸干，以10%的乙醇洗殘渣于分液漏斗中，調到pH2,用5毫升CH2CL2萃 取，反復三次得15毫升萃取液。注射2微升該萃取液于D.E.G.SH3CO4柱。對照溶液用1升20%乙醇水溶液（含300毫克的乙酸，5毫克的丙酸，1毫克異丁酸，1毫 克異戊酸，6.71毫克己酸，7.71毫克辛酸，5.54毫克癸酸，4.7毫克十二酸）。防腐劑己二烯酸的測定己二烯酸又稱山梨酸，它不是葡萄酒中的天然成分，但作為一種防腐劑被允許應用。在 葡萄酒中，山梨酸的含量限制在200毫克/升以下，在果酒中不允許存在。山梨酸的定量可 通過直接注射酒樣于D.E.G.S或D.E.G.AH2PO4，或者F.F.A.PH3PO4柱來進行。但由 于酒中其他成分的拖帶使它的小峰不是總能檢測出來的。我們采用乙醚萃取山梨酸，效果很 好，最大相對誤差在6%以下。操作方法：取20毫升酒樣，被1毫升1/3H2SO4酸化，加入2毫升十