藻藍蛋白的提取純化與鑒定

1、藻藍蛋白的提取純化與鑒定(實驗教案)藻藍蛋白(phycocyanin , PC)是一種存在于藍藻細胞內的光合色素，能高效捕獲光能。其分子質量 在40 ku左右，由a、p兩個亞基組成，亞基分子質量都在20 ku左右。肽鏈上共價結合1個開鏈的四 毗咯環(huán)輔基，類似動物紅細胞的血紅素結構。天然存在的藻藍蛋白通常以六聚體(a p )的形式存在。與 之相近的別藻藍蛋白(Anthocyanin ,APC)為三聚體(a p )，在650 nm處有最大吸收峰。分離純化的水 溶藻藍蛋白在溶液中呈藍色，并發(fā)出紫色熒光，在波長620 nm具有特異吸收峰，可用吸光度A / A 表示其純度。因其水溶性、無毒、清亮且著色力

2、強等優(yōu)點，藻藍蛋白被廣泛用于食品著色劑和化妝品的添 加劑。藻藍蛋白帶有熒光，可用作熒光標記物。一、教學目的通過藻藍蛋白的提取純化與鑒定使學生學會生物大分子制備方案設計與實踐研究，體驗從 復雜細胞混合物體系中提取生物大分子的基本原理、過程和方法。整個實驗過程學生獨立完 成，雖然操作難度較大，所需要的實間較長(64-80學時)，但每一步單元操作的原理清晰， 技術成熟，實驗結果明顯，能給學生較多的動手機會。有利于培養(yǎng)學生的學習興趣。二、實驗方案1材料與方法1. 1實驗材料鈍頂螺旋藻粉產自中國科學院武漢植物所，其他無機鹽和酸堿試劑均為國產分析純試劑。1. 2分析方法1.2.1藻藍蛋白濃度的測定方法一：

3、【曲文娟等，鈍頂螺旋藻藻藍蛋白的脈沖超聲輔助提取技術，食品科學，2007年5期，135-138】用紫外分光光度計對粗提的藻藍蛋白溶液進行全波段掃描，可見藻藍蛋白的特征吸收在620nm,異藻 藍蛋白的特征吸收在650nm處。提取液中藻藍蛋白濃度(C)按公式(1)計算：(1)c =0474氣50(/ 皿口)5.34方法二：【劉楊等，水提分離鈍頂螺旋藻藻藍蛋白及其穩(wěn)定性研究，天津師范大學學報(自然科學版)， Vol.28 No.3.11-14(2008)】螺旋藻中以藻膽蛋白吸收光譜的差異作為其測定標準。藻藍蛋白(PC)在620 nm處有最大光吸收，其 含量測定參考王廣策等人的相關研究方法：c = 0

4、.1425A(1，)1.2.2藻藍蛋白的純度測定【王廣策，周百成，曾呈奎.鈍頂螺旋藻C-藻藍蛋白和多管藻R-藻紅蛋白的分離及其摩爾消光系數的測定J .海洋科學1996 , 20 (1) : 52255.】【劉楊等，水提分離鈍頂螺旋藻藻藍蛋白及其穩(wěn)定性研究，天津師范大學學報(自然科學版)，Vol.28 No.3.11-14(2008)】nm藻藍蛋白的純度為溶液在620和280 nm處吸光度的比值,而別藻藍蛋白(APC)最大光吸收在650其含量的測定根據D.Kaplan等采用的方法:cACPA - 0.208A650 5.09620式-中，c和c r分別代表藻藍蛋白和別藻藍蛋白的質量濃度(g/ L

5、) ,A和A分別代表 波長在620和650 nm處的吸光度?！綤aplan D , Calvert H E , Peters G A. The azolla-anabaena azollae relationship. XH: Nit rogenase activity and phycobiliproteins of the endophyte as a function of leaf age and cell typeJ . Plant Physiol , 1986 , 80 (4) : 8842890.】1.2.3藻藍蛋白提取得率的計算【曲文娟等，鈍頂螺旋藻藻藍蛋白的脈沖超聲輔助提取技

6、術，食品科學，2007年5期，135-138】藻藍蛋白提取得率(T)為提取液中藻藍蛋白的重量與原料重量的比值。按公式(2)計算:T =空(I。一頑4、) x 1005.34式中：n樣品稀釋倍數;V提取液總體積，mL;原料質量，mg。1.2.4總蛋白質測定方法一：米用考馬斯亮藍法【李冰等，鈍頂螺旋藻藻藍蛋白提取純化新工藝，海洋科學，2007年，第31卷，第8期，48-52】 取潔凈干燥的試管分成兩組按表1進行操作。標準蛋白質溶液質量濃度為500 mg/ L。表1標準曲線制備（單位ul）試劑與操作1234567-樣8-樣標準蛋白質050100150200250分析樣品250500蒸餾水500450

7、4003503002502500將表各管加3 mL考馬斯亮藍G -250，立即搖勻，置室溫放置15 min ,置于595 nm波長處比色。 以1-6號管標準蛋白質質量濃度（g/ L）為橫坐標，1-6號管A nm值為縱坐標作圖，即得標準曲線。未知 濃度的1 ： 100倍稀釋后按照7-樣和8-樣操作測定，根據A595值推算出濃度大小。1. 3藻藍蛋白的提取分離1. 3. 1螺旋藻細胞的破碎和藻藍蛋白粗提液的制備螺旋藻細胞懸浮液：準確稱取1.02.0 g螺旋藻粉，加入200 mL的pH = 7. Q 0. 01 mol/ L的 磷酸緩沖液，4 C分別浸泡24h備用。細胞破碎：（選擇凍融法或超聲波法）

8、方法一（凍融法）：取上述螺旋藻懸浮液在-20C和30C反復凍融（3次）使藻體細胞破碎，在顯微鏡下 觀察計數細胞破碎率在90 %以上即可。方法二（超聲波法）：取上述螺旋藻懸浮液進行超聲波破碎，破碎條件：功率500W，能量80%， 室溫，開3秒停2秒，破碎時間2X分鐘（5分鐘），在顯微鏡下觀察計數細胞破碎率在90 %以 上即可。離心分離：將破碎的螺旋藻細胞懸濁液于8000 r/ min離心15 min ,收集上清液可得到含藻蛋白的 粗提液。在568、620和650 nm處測粗提液的吸光度，計算藻藍蛋白的含量。1. 3. 2沉淀分離藻藍蛋白1.3.2.1鹽析法沉淀藻藍蛋白（1）藻藍蛋白鹽析曲線的制作

9、（需要藻藍蛋白粗提液4050 ml，選做）取6支干凈試管編號16，分別加入粗提液5 ml；分別向14號試管中加入飽和硫酸銨2 ml、3 ml、4 ml、5 ml，然后再分別加入蒸餾水3 ml、2 ml、 1 ml、0 ml；向5號、6號試管中分別先加入固體硫酸銨0.66g和1.37g，再加飽和硫酸銨5 ml，充分搖 晃溶解完全后，硫酸銨飽和度分別為20%、30%、40%、50%、60%、70%，每管各取5mlX2混勻的溶液裝入 7ml X2離心管中，對應編號1-16-6，室溫（或0C）靜置4h以上，對稱放入離心機中，10 000 r/min， 離心10min，棄去上清液，收集沉淀。向收集的沉淀

10、加入5 ml 0.1 mol/L （pH7.0）磷酸緩沖溶液溶解沉淀物；測定各管中總蛋白質的濃度、藻藍蛋白濃度和純度。以硫酸銨飽和度為橫坐標，總蛋白質濃度和藻藍蛋白的含量為縱坐標作圖，得到蛋白質鹽析曲線和 藻藍蛋白鹽析曲線。（2）藻藍蛋白鹽析沉淀分離在裝有固定體積藻藍蛋白粗提液的燒杯中加入一定量的（nh4）2SO4溶液，邊加邊攪拌，以防溶液局部 過濃使蛋白質發(fā)生變性，最終（NH4）2S04溶液的質量濃度分別為50%,室溫（或0C）靜置4h以上，使藻藍 蛋白鹽析沉淀，再于冷凍（-40離心機中以10 000 r/ min離心20 min ,將離心得到的沉淀用1/ 4上 清液體積的0.1 mol/L

11、（pH=7. 0）磷酸緩沖液溶解，并傾倒于透析袋中，再置于去離子水中透析24 h每隔 4 h更換一次去離子水）；透析結束后，再于冷凍（-40離心機中，以10 000 r/ min離心20 min ; 收集上清液，在280、620和650 nm下測吸光度，計算藻藍蛋白的含量。1. 3. 2.2等電點法沉淀藻藍蛋白（選做）在裝有固定體積藻蛋白粗提液的燒杯中加入0.1 mol/ L稀HS0溶液，邊加邊攪拌，以防溶液局部過 濃使蛋白質發(fā)生變性，將藻蛋白粗提液pH調節(jié)為4.0，即藻藍蛋白的等電點附近，靜置過夜，于冷凍（- 40離心機中，以10 000 r/ min離心20 min ;將離心得到的沉淀用1

12、/ 4上清液體積的0.1 mol/L（pH=7. 0）磷酸緩沖液充分溶解，再于冷凍（-4C）高速離心機中以10 000 r/ min離心20 min ;取上清液，在280、 620和650 nm下測吸光度，計算藻藍蛋白的含量。1. 3. 4 Sephadex G-200 色譜純化選用？ 15X600800mm Sephadex G-200色譜柱，加樣量為35mL （約含蛋白60100mg）用20mmol/L （pH為7.0 ）的磷酸鹽緩沖液進行洗脫，洗脫速度可控制為0.5mL/min即10min/管，可用A280的紫外 線進行檢測。如果測得的數值很高，說明蛋白含量過高，需要稀釋后測量，測量方法

13、如下：每管取0.5mL稀釋10 倍后用紫外線測量的結果。以A280測量值為縱坐標，收集管號為橫坐標繪制洗脫曲線，收集藻藍蛋白洗脫峰，取適當濃縮后進 行蛋白質純度的鑒定。剩余部分測量體積，置于凍干管中冷凍干燥（純品藻藍蛋白）?！救?mL藻藍蛋白收集液留作藻藍蛋白含量測定和純度分析】1. 3. 5藻藍蛋白的收率和分離因數分別計算藻藍蛋白的收率（Y）、濃縮率（m）和分離因數（8Y = PC / Nm = pc m 一 pc r0p = PC/ PC0_ ACP /ACP + PE /PE 0t0式（4） - （6）中，N （ g/ L）為藻液比，0和t分別代表冷凍-融化后藻蛋白粗提液和經過鹽析法沉淀

14、或等電點法沉淀最終得到的藻藍蛋白上清液。1.4藻藍蛋白的穩(wěn)定性試驗1.4.1溫度穩(wěn)定性試驗將1. 3. 2中富集分離得到的藻藍蛋白上清液分別置于20、30、40和50。的水浴中，開始計 時并每隔0. 5 h測量上清液在568、620和650 nm處的吸光度，再采用1. 2中的分析方法測量藻藍 蛋白的濃度，以考察藻藍蛋白對溫度的穩(wěn)定性。1.4.2酸堿穩(wěn)定性試驗將1. 3. 2中富集分離得到的藻藍蛋白上清液用0. 1mol/L稀H2SO4溶液調節(jié)pH為3. 0、5. 0、 8. 0和9. 0，置于20C的水浴中，開始計時并每隔0. 5 h測量上清液在568、620和650 nm處的吸 光度，再采用1. 2中的分析方法測量藻藍蛋白的濃度，以考察藻藍蛋白對酸堿的穩(wěn)定性。1.5 PC純度分析分離程序A 61./ A 280細胞破碎粗提(NH) SO鹽析-24等電點沉淀SephadexG-200 分子篩表2 PC的各級純化結果1.5.1測定各級分離提純程序1.5.1聚丙烯