基因工程菌穩(wěn)定性分析(48張)課件

1、基因工程菌穩(wěn)定性分析 基因工程菌穩(wěn)定性分析 Slide 1第一節(jié) 基因工程菌的概述第二節(jié) 質(zhì)粒載體不穩(wěn)定現(xiàn)象及類型第三節(jié) 提高質(zhì)粒穩(wěn)定性的方法第四節(jié) 影響質(zhì)粒載體穩(wěn)定性的主要因素第五節(jié) 對(duì)NHase重組質(zhì)粒穩(wěn)定性分析第一節(jié) 基因工程菌的概述一、 基因工程菌的定義 基因工程菌( Gene Engineering Bacteria) 是利用基因工程技術(shù)，將外源目的基因?qū)胨拗骷?xì)胞使其表達(dá)所需蛋白的重組菌。二、基因工程菌構(gòu)建的基本路線 目的基因獲取-目的基因擴(kuò)增-基因重組-重組載體導(dǎo)入受體菌-篩選導(dǎo)入成功的受體菌第一節(jié) 基因工程菌的概述三、質(zhì)粒的穩(wěn)定性問(wèn)題 基因工程技術(shù)是生物技術(shù)的核心和關(guān)鍵，通過(guò)載

2、體向受體細(xì)胞或細(xì)菌轉(zhuǎn)入目的基因，從而使其表達(dá)一系列與人類健康有關(guān)的重要物質(zhì)，如抗生素、氨基酸、疫苗等，在醫(yī)藥、環(huán)境治理等行業(yè)有廣闊應(yīng)用前景。但是，質(zhì)粒的穩(wěn)定性問(wèn)題是基因工程技術(shù)工業(yè)化的瓶頸。 第二節(jié) 質(zhì)粒載體不穩(wěn)定現(xiàn)象及類型一、質(zhì)粒載體不穩(wěn)定的現(xiàn)象： 克隆有外源基因的質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)移到大腸桿菌受體細(xì)胞之后，會(huì)產(chǎn)生一系列的生理效應(yīng)，影響到自身的穩(wěn)定性； 可能引起形態(tài)學(xué)上的變化：絲狀現(xiàn)象和脆性增加； 產(chǎn)生無(wú)質(zhì)粒的突變體或拷貝數(shù)低的突變體； 結(jié)構(gòu)重排導(dǎo)致無(wú)法正常表達(dá)的突變體。 第二節(jié) 質(zhì)粒載體不穩(wěn)定現(xiàn)象及類型二、質(zhì)粒載體不穩(wěn)定性的類型結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定 指結(jié)構(gòu)(序列)不穩(wěn)定性, 即重組質(zhì)粒上某一區(qū)域的DNA 序

3、列發(fā)生插入、缺失、重排和修飾等現(xiàn)象, 導(dǎo)致其表觀生物學(xué)功能的喪失;分離不穩(wěn)定 指細(xì)胞分裂的過(guò)程中，有一個(gè)子細(xì)胞沒(méi)有獲得質(zhì)粒DNA拷貝，并最終增殖為無(wú)質(zhì)粒的優(yōu)勢(shì)群體。第二節(jié) 質(zhì)粒載體不穩(wěn)定現(xiàn)象及類型1. 結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定 原因：DNA的丟失，插入和重排。人工構(gòu)建的多個(gè)串聯(lián)啟動(dòng)子的質(zhì)粒載體容易發(fā)生丟失作用。寄主染色體及質(zhì)粒載體的IS因子或轉(zhuǎn)位因子，同樣也會(huì)引起結(jié)構(gòu)的不穩(wěn)定性。 共同特征：同向重復(fù)序列之間的同源重組（short direct repeat). 例如：用含有酪氨酸操縱子的多拷貝質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)換大腸桿菌tryR菌株時(shí)，由于IS1因子的插入效應(yīng)，結(jié)果產(chǎn)生出具有插入或者缺失的修飾型的質(zhì)粒載體。第二節(jié)

4、質(zhì)粒載體不穩(wěn)定現(xiàn)象及類型2. 分離不穩(wěn)定 原因：細(xì)胞分裂過(guò)程中的質(zhì)粒的不平均分配。 由于缺陷性分配（defective partitioning）所造成的質(zhì)粒的丟失現(xiàn)象叫做質(zhì)粒分離的不穩(wěn)定性。 質(zhì)粒穩(wěn)定遺傳的兩個(gè)必要條件：一、平均每個(gè)時(shí)代每個(gè)質(zhì)粒至少發(fā)生一次復(fù)制；二、細(xì)胞分裂時(shí)，復(fù)制產(chǎn)生的質(zhì)?？截惐仨毞峙涞絻蓚€(gè)子細(xì)胞中去。第二節(jié) 質(zhì)粒載體不穩(wěn)定現(xiàn)象及類型三、質(zhì)?？截惙峙涞阶蛹?xì)胞的途徑 質(zhì)?？截惙峙涞阶蛹?xì)胞的途徑可分為主動(dòng)分配和隨機(jī)分配兩種不同的方式。1 主動(dòng)分配的方式有兩種:平均分配-每個(gè)子細(xì)胞剛好獲得一半數(shù)目的質(zhì)?？截惻鋵?duì)位點(diǎn)分配-只有一對(duì)質(zhì)粒呈主動(dòng)分配，其他的隨機(jī) 分配 第二節(jié) 質(zhì)粒載體不

5、穩(wěn)定現(xiàn)象及類型 由于主動(dòng)分配存在著有效的質(zhì)粒拷貝數(shù)控制系統(tǒng)，從而保證了質(zhì)粒的高度穩(wěn)定。第二節(jié) 質(zhì)粒載體不穩(wěn)定現(xiàn)象及類型2 隨機(jī)分配 在細(xì)胞分裂過(guò)程中質(zhì)?？截悢?shù)在兩個(gè)子細(xì)胞中隨機(jī)分配。第三節(jié) 影響質(zhì)粒載體穩(wěn)定性的主要因素影響質(zhì)粒載體穩(wěn)定性的主要因素 新陳代謝符合對(duì)質(zhì)粒載體穩(wěn)定性的效應(yīng) 拷貝數(shù)差異對(duì)質(zhì)粒載體穩(wěn)定性的影響 寄主重組體系對(duì)質(zhì)粒載體穩(wěn)定性的效應(yīng)第三節(jié) 影響質(zhì)粒載體穩(wěn)定性的主要因素1. 新陳代謝符合對(duì)質(zhì)粒載體穩(wěn)定性的效應(yīng) 質(zhì)粒載體增加給宿主細(xì)胞DNA復(fù)制效應(yīng)曲線。即宿主細(xì)胞生長(zhǎng)速度與質(zhì)粒載體的分子量的大小成正比，克隆的外源DNA段越大，寄主細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢的時(shí)間就越長(zhǎng)。第三節(jié) 影響質(zhì)粒載體穩(wěn)定

6、性的主要因素2. 拷貝數(shù)差異對(duì)質(zhì)粒載體穩(wěn)定性的影響差異：同樣的大腸桿菌培養(yǎng)物中，每個(gè)細(xì)胞所擁有的質(zhì)粒載體拷貝數(shù)是不盡相同的，這種不同的細(xì)胞個(gè)體之間的質(zhì)粒載體拷貝數(shù)差異程度，簡(jiǎn)稱差度。無(wú)質(zhì)粒載體細(xì)胞的速度是由分裂細(xì)胞中的質(zhì)粒載體拷貝平均值數(shù)決定的。差度是影響質(zhì)粒載體丟失的速率，也是造成質(zhì)粒載體不穩(wěn)定的原因之一。第三節(jié) 影響質(zhì)粒載體穩(wěn)定性的主要因素 具有低差度分布特性的質(zhì)粒載體相當(dāng)?shù)姆€(wěn)定性，具有高差度分布特性的質(zhì)粒載體穩(wěn)定性較差。位于后者的這種分布的低拷貝數(shù)的一段產(chǎn)生無(wú)質(zhì)粒載體細(xì)胞的頻率相當(dāng)高。第三節(jié) 影響質(zhì)粒載體穩(wěn)定性的主要因素 3. 寄主重組體系對(duì)質(zhì)粒載體穩(wěn)定性的效應(yīng)質(zhì)粒寡聚體，其穩(wěn)定性比單體

7、差，同樣是造成質(zhì)粒不穩(wěn)定性的重要原因之一。寡聚化作用普遍存在于含有大分子量插入片段的克隆載體。實(shí)驗(yàn)證明，pBR322派生載體中，寡聚化程度與插入片段大小存在相關(guān)性。決定大腸桿菌培養(yǎng)物中含質(zhì)粒寡聚體細(xì)胞的比例有兩種主要的因素：一、質(zhì)粒DNA分子間的重組頻率；二、含質(zhì)粒寡聚體細(xì)胞生長(zhǎng)速率。第三節(jié) 影響質(zhì)粒載體穩(wěn)定性的主要因素 影響質(zhì)粒重組的突變同樣也會(huì)影響質(zhì)粒的穩(wěn)定性。實(shí)驗(yàn)觀察表明，在重組缺陷(rec-)的大腸桿菌寄主細(xì)胞中，基因工程常用載體pBR322和pUC當(dāng)以單體形式存在時(shí)最穩(wěn)定。隨著質(zhì)粒寡聚體比例的逐漸上升，其穩(wěn)定性就相應(yīng)的下降。第三節(jié) 影響質(zhì)粒載體穩(wěn)定性的主要因素菌體生長(zhǎng)數(shù)率對(duì)質(zhì)粒拷貝數(shù)

8、和質(zhì)粒穩(wěn)定性有一影響。高生長(zhǎng)數(shù)率時(shí)質(zhì)?？截悢?shù)下降，但穩(wěn)定性增加。生長(zhǎng)數(shù)率/h0.20.4質(zhì)?？截悢?shù)10.5950400-半乳糖苷酶工程菌的連續(xù)養(yǎng)第三節(jié) 影響質(zhì)粒載體穩(wěn)定性的主要因素 一般情況下,質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定性可以通過(guò)宿主菌株的謹(jǐn)慎和恰當(dāng)?shù)倪x用來(lái)消除。因此在質(zhì)粒 不穩(wěn)定性的研究過(guò)程中, 人們關(guān)注最多的,通常是質(zhì)粒的分離不穩(wěn)定性。第四節(jié) 提高質(zhì)粒穩(wěn)定性的方法 高密度培養(yǎng) 基因工程菌 選擇培養(yǎng)基 周期操作 固定化基因工程菌第四節(jié) 提高質(zhì)粒穩(wěn)定性的方法1. 高密度培養(yǎng)對(duì)基因工程菌穩(wěn)定性的影響 為了提高質(zhì)粒穩(wěn)定性，工程菌培養(yǎng)采用兩階段培養(yǎng)法：先使菌體生長(zhǎng)至一定密度，再誘導(dǎo)外源基因的表達(dá)。第四節(jié) 提高

9、質(zhì)粒穩(wěn)定性的方法 由于第一階段先使菌體生長(zhǎng)至一定密度，外源基因未表達(dá)，減小了重組菌與質(zhì)粒丟失菌的生長(zhǎng)速率的差別，增加了質(zhì)粒穩(wěn)定性。 在培養(yǎng)基中加入抗菌素抑制質(zhì)粒丟失菌的生長(zhǎng)，提高質(zhì)粒穩(wěn)定性。 調(diào)控環(huán)境參數(shù)如溫度、pH、培養(yǎng)基組分和溶解氧濃度。第四節(jié) 提高質(zhì)粒穩(wěn)定性的方法有些含質(zhì)粒菌對(duì)發(fā)酵環(huán)境的改變比不含質(zhì)粒菌反應(yīng)慢，間歇改變培養(yǎng)條件以改變兩種菌比生長(zhǎng)速率，可改善質(zhì)粒穩(wěn)定性。通過(guò)間歇供氧和改變稀釋數(shù)率，都可以提高質(zhì)粒穩(wěn)定性。第四節(jié) 提高質(zhì)粒穩(wěn)定性的方法2. 基因工程菌的構(gòu)建對(duì)質(zhì)粒穩(wěn)定性的影響 一般, 質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定性可以通過(guò)宿主菌株的謹(jǐn)慎和恰當(dāng)?shù)倪x用來(lái)消除。宿主菌株通常有蘇云金芽胞桿菌、根瘤菌

10、、酒精酵母和大腸桿菌等。 例如，大腸桿菌獲得外源基因的高效表達(dá)：可以選用T7、PRPL、Ptac 等強(qiáng)啟動(dòng)子, 通過(guò)對(duì)翻譯增強(qiáng)序列和轉(zhuǎn)錄終止序列的改進(jìn)和優(yōu)化; 可以按照大腸桿菌系統(tǒng)偏愛的密碼子和mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行目的基因的設(shè)計(jì)和合成 。第四節(jié) 提高質(zhì)粒穩(wěn)定性的方法3. 選擇培養(yǎng)基對(duì)質(zhì)粒穩(wěn)定性的影響 常用選擇性培養(yǎng)基對(duì)基因工程菌進(jìn)行培養(yǎng),這樣可提高帶質(zhì)粒菌的競(jìng)爭(zhēng)力。一般是在質(zhì)粒上引入抗生素基因, 再向培養(yǎng)基中加入抗生素, 這對(duì)提高質(zhì)粒分離穩(wěn)定性非常有效。第四節(jié) 提高質(zhì)粒穩(wěn)定性的方法4. 周期操作對(duì)基因工程菌質(zhì)粒穩(wěn)定性的影響 一是在這種瞬變的環(huán)境中, 重組細(xì)胞快速地適應(yīng)了該環(huán)境, 從而降低了無(wú)質(zhì)

11、粒細(xì)胞的相對(duì)生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì); 二則可能是在這種瞬變的環(huán)境下, 細(xì)胞被誘導(dǎo)以保持較高的質(zhì)?？截悢?shù), 而質(zhì)?？截悢?shù)的增加降低了由于隨機(jī)分配而導(dǎo)致質(zhì)粒損失的概率。第四節(jié) 提高質(zhì)粒穩(wěn)定性的方法5. 固定化基因工程菌對(duì)質(zhì)粒穩(wěn)定性的影響 質(zhì)粒的不穩(wěn)定性對(duì)基因工程菌的培養(yǎng)和產(chǎn)物的生產(chǎn)有著極大的影響, 將基因工程菌固定化后培養(yǎng)可提高基因工程菌的穩(wěn)定性、生物量和克隆基因產(chǎn)物的產(chǎn)量。第五節(jié) 對(duì)NHase重組質(zhì)粒穩(wěn)定性分析 對(duì)成功構(gòu)建的腈水合酶 (Nitrile Hydratase, NHase) 高表達(dá)的重組大腸桿菌E.coli BL21( DE3 )/pETNHM(Kanr)的重組質(zhì)粒 pETNHM在重組菌株中的質(zhì)粒

12、穩(wěn)定性進(jìn)行了研究分析。第五節(jié) 對(duì)NHase重組質(zhì)粒穩(wěn)定性分析1. 質(zhì)粒pETNHM的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性 質(zhì)粒pETNHM 是將 -亞基起始密碼子突變的諾卡氏菌腈水合酶基因插入商品化的pET28a(+) (Novagen公司)質(zhì)粒載體而得到的，插入位點(diǎn)為NcoI和BamH I 。第五節(jié) 對(duì)NHase重組質(zhì)粒穩(wěn)定性分析第五節(jié) 對(duì)NHase重組質(zhì)粒穩(wěn)定性分析 在LB培養(yǎng)基中對(duì)重組E.coli BL21(DE3) /pETNHM 每隔6h進(jìn)行反復(fù)的傳代培養(yǎng),約60代后收獲細(xì)胞提取質(zhì)粒,并對(duì)初始構(gòu)建的質(zhì)粒和傳代培養(yǎng)后的質(zhì)粒分別以EcoT 22I單酶切及Nco I和BamH I雙酶切，然后瓊脂糖凝膠電泳。第五節(jié)

13、對(duì)NHase重組質(zhì)粒穩(wěn)定性分析 由圖可見,連續(xù)傳代60代后收獲的質(zhì)粒樣品采用 EcoT22 I單酶切及Nco I和BamH I 雙酶切后,分別獲得了與初始質(zhì)粒完全相同的預(yù)期長(zhǎng)度基因片段(EcoT22 I單酶切:4.1kb、2.2kb和0.3kb,其中0.3kb的片斷因?yàn)樘《诃傊悄z電泳中檢測(cè)不到; Nco I和BamH I雙酶切:5.3kb 和1.3kb) 。第五節(jié) 對(duì)NHase重組質(zhì)粒穩(wěn)定性分析 進(jìn)一步將連續(xù)復(fù)制 60代后的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入宿主 E. coli BL21(DE3),并對(duì)重組菌進(jìn)行腈水合酶的誘導(dǎo)表達(dá),結(jié)果表明腈水合酶能夠正常表達(dá)。證明質(zhì)粒pETNHM確實(shí)具有良好的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性,即使

14、經(jīng)過(guò)長(zhǎng)時(shí)間連續(xù)復(fù)制,也沒(méi)有產(chǎn)生DNA序列的明顯自發(fā)突變。第五節(jié) 對(duì)NHase重組質(zhì)粒穩(wěn)定性分析 質(zhì)粒的分離不穩(wěn)定性是質(zhì)粒不穩(wěn)定性的主要因素, 歷來(lái)受到學(xué)者們的高度重視。大量研究表明, 宿主的新陳代謝負(fù)荷、質(zhì)粒的寡聚化效應(yīng)及在缺陷性分配過(guò)程中造成的拷貝數(shù)差度等, 均是產(chǎn)生無(wú)質(zhì)粒細(xì)胞的重要因素, 而不利的環(huán)境條件及無(wú)質(zhì)粒細(xì)胞的生長(zhǎng)競(jìng)爭(zhēng)等則是進(jìn)一步擴(kuò)大質(zhì)粒分離不穩(wěn)定性的重要原因。第五節(jié) 對(duì)NHase重組質(zhì)粒穩(wěn)定性分析2.質(zhì)粒 pETNHM的分離不穩(wěn)定性及抗生素選擇壓力的影響 抗生素的選擇壓力是保證質(zhì)粒分離穩(wěn)定性的重要因素。分別在LB和LBK培養(yǎng)基中對(duì)重組菌BL21 ( DE3 ) /p ETNHM進(jìn)

15、行反復(fù)的傳代培養(yǎng), 以考察重組菌株的分離不穩(wěn)定性及宿主細(xì)胞連續(xù)分裂時(shí)Kan的添加對(duì)質(zhì)粒穩(wěn)定性的影響。為了保證所有的細(xì)胞均具有分裂能力, 確定傳代時(shí)間為6h,即當(dāng)細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后期時(shí)進(jìn)行傳代。第五節(jié) 對(duì)NHase重組質(zhì)粒穩(wěn)定性分析第五節(jié) 對(duì)NHase重組質(zhì)粒穩(wěn)定性分析 在沒(méi)有抗生素選擇壓力的L培養(yǎng)基中, 當(dāng)重組菌細(xì)胞連續(xù)分裂約48次左右時(shí), 質(zhì)粒就開始丟失,含質(zhì)粒細(xì)胞(P+)的百分率逐漸下降; 當(dāng)世代數(shù)增大到約66代時(shí),質(zhì)粒丟失率接近90%,說(shuō)明質(zhì)粒pETNHM具有分離不穩(wěn)定性, 宿主細(xì)胞的連續(xù)高速分裂將導(dǎo)致質(zhì)粒的丟失。 而在LBK培養(yǎng)基中,由于抗生素Kan選擇壓力的存在,含質(zhì)粒細(xì)胞P+菌的百

16、分率在傳代過(guò)程中一直保持恒定。第五節(jié) 對(duì)NHase重組質(zhì)粒穩(wěn)定性分析3.質(zhì)粒特性對(duì)pETNHM分離不穩(wěn)定的影響 在重組菌細(xì)胞中, 質(zhì)粒載體的拷貝數(shù)是影響質(zhì)粒分離不穩(wěn)定性的重要因素。對(duì)于松弛型質(zhì)粒載體, 一般情況下, 伴隨著細(xì)胞的分裂, 質(zhì)粒以隨機(jī)方式分配到子細(xì)胞中,質(zhì)?？截悢?shù)越高, 出現(xiàn)無(wú)質(zhì)粒載體細(xì)胞的概率就越低, 質(zhì)粒也就越穩(wěn)定。而質(zhì)粒載體的寡聚化效應(yīng)會(huì)導(dǎo)致質(zhì)粒載體的拷貝數(shù)大大降低, 從而通常會(huì)加重質(zhì)粒的分離不穩(wěn)定性。第五節(jié) 對(duì)NHase重組質(zhì)粒穩(wěn)定性分析 分別收獲在LB培養(yǎng)基中連續(xù)傳代培養(yǎng)30代、60代及 經(jīng) 過(guò) 誘 導(dǎo) 大 量 表 達(dá) 腈 水 合 酶的BL21(DE3 ) /pETNHM

17、細(xì)胞，利用試劑盒提取質(zhì)粒，進(jìn)行0.7%的瓊脂糖凝膠電泳，并以原質(zhì)粒為對(duì)照，電泳。第五節(jié) 對(duì)NHase重組質(zhì)粒穩(wěn)定性分析 重組質(zhì)粒 pETNHM除了在4.8kb處(理論長(zhǎng)度 6.6kb,由于環(huán)狀質(zhì)粒形成超螺旋,所以出現(xiàn)在4.8kb位置)出現(xiàn)條帶以外,還在10kb左右出現(xiàn)了強(qiáng)條帶?；厥占兓?0kb左右的質(zhì)粒 DNA, 分別采用Nco I和BamH I對(duì)其進(jìn)行單酶切, 酶切后電泳。第五節(jié) 對(duì)NHase重組質(zhì)粒穩(wěn)定性分析 酶切后僅得到一條長(zhǎng)度均為6.6kb的線性質(zhì)粒條帶, 是重組質(zhì)粒pETNHM長(zhǎng)度的理論值, 說(shuō)明酶切前的樣品為pETNHM的二聚體。就是說(shuō),重組質(zhì)粒pETNHM在宿主L21(DE3)中

18、, 主要以單體和二聚體2種形式同時(shí)存在, 且由Total Lab軟件的定量分析可知,這2種形式的質(zhì)粒比為12。由于質(zhì)粒的寡聚化效應(yīng)會(huì)降低重組質(zhì)粒的拷貝數(shù),故而大量形 成的重組質(zhì)粒pETNHM的二聚體不利于質(zhì)粒的分離穩(wěn)定性。第五節(jié) 對(duì)NHase重組質(zhì)粒穩(wěn)定性分析4.連續(xù)傳代及誘導(dǎo)產(chǎn)酶對(duì)質(zhì)粒pETNHM的拷貝數(shù)的影響質(zhì)粒 pETNHM屬于松弛型,應(yīng)該具有較高的拷貝數(shù)。分別取2.4ml在LB培養(yǎng)基中傳10代、30代以及經(jīng)過(guò)誘導(dǎo)產(chǎn)酶的BL21(DE3)/pETNHM菌液(細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果分別為2.16109個(gè)/ml 、1.92109個(gè) / ml及1.87109個(gè)/ml),小心提取質(zhì)粒,分別獲得1 00l質(zhì)

19、粒樣品。各加樣3l進(jìn)行0.7%瓊脂糖凝膠電泳, 同時(shí)加入3l(150ng)DNA Marker作參照 。采用Total Lab軟件計(jì)算可知, 3 條泳道中質(zhì)粒的質(zhì)量分別為77.6,46.2和21.8ng。則3種菌液收獲的質(zhì)粒的理論產(chǎn)量分別為 0.92g /ml、0.55g/ml和0.26g/ml第五節(jié) 對(duì)NHase重組質(zhì)粒穩(wěn)定性分析 因pETNHM單體的分子大小為6600bp,每單位堿基對(duì)的平均質(zhì)量為1.05910-15g,因此pETNHM單體的分子質(zhì)量為:6.98910-12g(即4.21103kDa )。計(jì)算表明, 3種菌液中重組質(zhì)粒pETNHM的拷貝數(shù)(以單體計(jì))分別為61、41和20。

20、第五節(jié) 對(duì)NHase重組質(zhì)粒穩(wěn)定性分析結(jié)果分析： 在不同的傳代培養(yǎng)和誘導(dǎo)表達(dá)條件下, 重組質(zhì)粒pETNHM在宿主細(xì)胞中的拷貝數(shù)差異很大。首先, 長(zhǎng)時(shí)間的傳代培養(yǎng)會(huì)使質(zhì)粒的復(fù)制能力有所降低,從而使拷貝數(shù)減少。其次, 菌體經(jīng)誘導(dǎo)產(chǎn)酶后, 由于蛋白表達(dá)過(guò)程需要占用較多的能量、營(yíng)養(yǎng)和前體物質(zhì), 所以也會(huì)導(dǎo)致質(zhì)?？截悢?shù)的下降, 從而影響質(zhì)粒的分離穩(wěn)定性。此外, 由于以二聚體形式存在的重組質(zhì)粒在宿主細(xì)胞中約占總量的2/3 , 而二聚體質(zhì)粒的拷貝數(shù)僅為單體質(zhì)?？截悢?shù)的1/2,因此,質(zhì)粒的二聚化現(xiàn)象也必然會(huì)影響到質(zhì)粒載體的分離穩(wěn)定性。第五節(jié) 對(duì)NHase重組質(zhì)粒穩(wěn)定性分析 質(zhì)粒引入對(duì)宿主細(xì)胞生長(zhǎng)的影響 理論上

21、講,質(zhì)粒pETNHM在E.coliBL21(DE3) 中的引入, 將對(duì)宿主細(xì)胞的生長(zhǎng)造成一定的生理負(fù)擔(dān), 從而影響質(zhì) 粒的分離穩(wěn)定性。將重組菌E.coli BL 21(DE3)/p ETNHM和宿主菌 E.coli BL 21(DE3)在LB培養(yǎng)基中進(jìn)行平行培養(yǎng), 測(cè)定OD600值隨時(shí)間的變化曲線, 并計(jì)算其比生長(zhǎng)速率。第五節(jié) 對(duì)NHase重組質(zhì)粒穩(wěn)定性分析第五節(jié) 對(duì)NHase重組質(zhì)粒穩(wěn)定性分析 由圖可見, 重組菌和宿主菌的最大比生長(zhǎng)速率分別為0.732h-1和0.689h-1, 重組菌略高于宿主菌。也就是說(shuō),重組菌BL21(DE3)/pETNHM并沒(méi)有由于攜帶質(zhì)粒而表現(xiàn)出嚴(yán)重的生理負(fù)擔(dān)。重組

22、菌和宿主菌的這一生長(zhǎng)特性將有利于避免質(zhì)粒丟失后的空宿主細(xì)胞發(fā)展成為優(yōu)勢(shì)菌群,從而有利于保持質(zhì)粒的分離穩(wěn)定性。第五節(jié) 對(duì)NHase重組質(zhì)粒穩(wěn)定性分析 綜上所述, 在高產(chǎn)腈水合酶的重組大腸桿菌 E.coli BL21(DE3) /pETNHM中, 重組質(zhì)粒pETNHM具有結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性和分離不穩(wěn)定性。其中, 質(zhì)粒載體的二聚化效應(yīng)、重組細(xì)胞的連續(xù)分裂以及腈水合酶的誘導(dǎo)表達(dá)等因素都將加重質(zhì)粒的分離不穩(wěn)定性。 反之, 重組細(xì)胞相對(duì)于宿主細(xì)胞的較高比生長(zhǎng)速率有利于保持有質(zhì)粒細(xì)胞的生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì), 而抗生素的正向選擇壓力則將保證重組質(zhì)粒在重組細(xì)胞內(nèi)的穩(wěn)定遺傳。激勵(lì)學(xué)生學(xué)習(xí)的名言格言220、每一個(gè)成功者都有一個(gè)開始。勇于開始，才能找到成功的路。221、世界會(huì)向那些有目標(biāo)和遠(yuǎn)見的人讓路（馮兩努香港著名推銷商）222、絆腳石乃是進(jìn)身之階。223、銷售世界上第一號(hào)的產(chǎn)品不是汽車，而是自己。在你成功地把自己推銷給別人之前，你必須百分之百的把自己推銷給自己。224、即使爬到最高的山上，一次也只能腳踏