實驗三 石蠟切片法

1、實驗三 石蠟切片法 1 一般光鏡技術 組織細胞化學技術 免疫細胞化學技術 放射自顯影技術 電鏡技術 組織培養(yǎng)技術組織學的研究方法2 涂片法 鋪片法 磨片法 石蠟切片法 火棉膠切片法 冰凍切片法 一般光鏡技術非切片法切片法3 本實驗主要掌握一般光鏡技術中的切片法石蠟切片技術。 實驗目的與基本要求：掌握石蠟切片的制片技術和基本原理。要求用HE染色方法染色，獲得清晰的組織切片。4石蠟切片的流程1、取材2、固定3、組織塊修整4、洗滌5、脫水6、透明7、浸蠟與包埋8、切片與貼片9、脫蠟、復水（水化）10、染色11、脫水、透明12、封固51.取材動物致死方法：常用方法有麻醉法、空氣栓塞法、斷頭法、擊頭法、

2、股動脈放血法等；無尾兩棲類常用探針破壞腦和脊髓的方法處死，鼠類可用兩手（戴手套）用力拉，使顱骨和頸椎分離而導致延髓損傷致死。動物保護 組織材料新鮮 動作迅速6取材注意事項：要熟悉取材部位；所取材料盡可能新鮮；組織塊力求小而?。汉穸纫话悴怀^5mm為宜，較理想的厚度為2mm左右； 勿使組織塊受擠壓，以免破壞組織；保持材料清潔，以免影響觀察。 72.固定固定：固定是指處死的動物體或新取的組織塊投入固定液使其結構得以凝固為不溶性物質(zhì)的過程。其目的在于保持組織內(nèi)細胞的形態(tài)、結構及其組成，防止細胞組織死后的自溶和腐敗，使之盡量保持生前的狀態(tài)和結構。 8 注射、灌注固定法 小塊組織固定法 常用的固定液有：

3、甲醛（福爾馬林）、酒精、醋酸、苦味酸、鋨酸、Bouins液等。 固定液的用量通常為材料塊的20倍左右；固定時間則根據(jù)材料塊的大小及松密程度以及固定液的穿透速度而定，可以從1小時至數(shù)天，通常為數(shù)小時至24小時。 常用的固定方法93.組織塊修整組織塊修整：經(jīng)過固定后的組織有一定的硬度，此時就可以做一些修整，但改變不要太大，只要將組織材料切取平整，修掉一些不規(guī)則的部位；過大、過厚的組織改小、改薄。104.洗滌洗滌：將殘余在組織內(nèi)的固定液清洗干凈，以免影響對組織內(nèi)部結構的觀察、分析、研究。 常用的洗滌方法 水洗法（含有鉻、鋨的固定液固定的組織塊） 酒精洗滌法（含有苦味酸、酒精固定液固定的組織塊）115

4、.脫水 脫水：將組織塊內(nèi)的水份被置換出的過程叫脫水；脫水目的是使水分完全除去的同時使組織塊變硬?，F(xiàn)采用的脫水劑一般是乙醇或丙酮來進行梯度脫水；脫水的時間，可根據(jù)組織的類型，大小而定。方法： 70% 80% 95%() 95%() 無水酒精（） 1-2h 1-2h 1-2h 1-2h 30min-1h 無水酒精（） 30min-1h 12脫水注意事項：原則是在脫水徹底的前提下，盡量縮短脫水的時間；脫水應逐步而不應跨越太大進行；如需要可在70%的酒精中過夜或長期保存；如系胚胎或柔軟組織脫水，應從更低濃度的酒精開始；每級脫水移入高濃度以前，應用吸水紙吸凈表面的殘液。136.透明（媒浸）透明（媒浸）：

5、無水酒精不能與石蠟相溶，還需用能與酒精和石蠟相溶的媒浸液，替換出組織內(nèi)的酒精。材料塊在這類媒浸液中浸漬，出現(xiàn)透明狀態(tài)，此液即稱透明劑，透明劑浸漬過程稱透明。常用的透明劑有二甲苯、苯；透明劑的浸漬時間則要根據(jù)組織材料塊大小和性質(zhì)而定。方法: 純酒精:二甲苯（1:1) 二甲苯() 二甲苯（） 15min-30min 15min-30min 15min-30min 147.浸蠟與包埋浸蠟：是將已透明的組織塊移入熔化的石蠟內(nèi)浸沒的過程。目的是用石蠟取代透明劑，使石蠟浸入組織而起支持作用。通常浸蠟應在高于石蠟熔點3左右的溫箱中進行，以利石蠟浸入組織內(nèi)。方法：浸蠟（）浸蠟（）浸蠟（） 30min-1h 1

6、-2h 1-2h 15包埋：將浸蠟后的組織塊包在石蠟之中，并使組織塊與石蠟一起凝固成均勻一致的蠟塊的過程叫包埋。方法：將紙盒盛滿已融化的石蠟，隨即將第三杯中已浸蠟的材料放入其中，并排出里面的氣泡待石蠟表面凝結后，將紙盒進入水中冷卻石蠟全部凝結后，拆去紙盒即成蠟塊。組織在蠟塊中可以長期保存。168.切片與貼片 切片： 1)修塊：切去組織標本周圍過多的石蠟，不能留的過少，否則容易造成組織破壞。一般情況下在組織周圍應留約 1-2mm的石蠟邊，把蠟塊修成上下兩對邊平行的方形或梯形，否則會造成石蠟切出的蠟帶不整齊或歪向一邊。 2)固著：將修好的蠟塊用蠟粘在大小適宜的小木塊上，木塊裝在切片機上，以待切片。

7、 3)切片：在旋轉式切片機上將蠟塊切成5-10um厚的薄片。切下的薄片會連成蠟帶。用毛筆輕托輕取蠟帶，放在蠟帶盒內(nèi)備用。17切片修塊1818貼片：（粘片、表片、展片）是將已切成的蠟帶分割成小段后粘貼于載玻片的過程。用粘片劑將展平的蠟片牢附于載玻片上，以免在以后操作中材料脫落。在載玻片上涂抹粘片劑，再滴蒸餾水，放上蠟帶，置于調(diào)好溫度的水浴鍋上鋪展。將載玻片放入45溫箱中干燥。199.脫蠟及復水脫蠟：用二甲苯將組織中的石蠟溶解掉，石蠟將會妨礙染料進入組織、細胞中而不易染色。復水：從第二杯二甲苯取出的切片經(jīng)100%95%80% 70%蒸餾水。在各液中停留15min。方法： 二甲苯（）二甲苯（）無水酒

8、精 95% 80% 10min 10min 5min 5min 5min 70% 蒸餾水 5min 5min2010.染色 最常用的染色法是蘇木精（hematoxylin)和伊紅（eosin）染色簡稱HE染色。配制后的蘇木精染液呈堿性，可使細胞核染成藍紫色；伊紅是酸性染料，可使多數(shù)細胞的細胞質(zhì)染成粉紅色。方法： 蘇木精自來水1%鹽酸酒精自來水 蒸餾水70%80%90%伊紅 15min 10-15min 數(shù)秒 沖洗15min 片刻 2min 2min 2min 5min 分色 藍化 2111.脫水、透明 脫水：染色以后，組織切片中有水分，則光不易通透，在顯 微鏡下觀察不清組織機構，所以必須經(jīng)過脫水。 透明：以利于光線能透過組織切片，便于觀察組織、細胞的 結構。 方法：95%()95%()無水酒精()無水酒精() 5min 5min 5min 5min 無水酒精:二甲苯（1:1）二甲苯（）二甲苯（） 5min 5min 5min2212.封固封固：將切片從二甲苯（）中取出，用紙或者布擦去材料周圍的二甲苯。在材料中央滴一滴中性樹