菌種保存方法

1、種保存方法未知微生物具有容易變異的特性，因此，在保藏過程中，必須使微生物的代謝處于最不活躍或相 對靜止的狀態(tài)，才能在一定的時間內(nèi)使其不發(fā)生變異而又保持生活能力。低溫、干燥和隔絕空氣是使微生物代謝能力降低的重要因素，所以，菌種保藏方法雖多， 但都是根據(jù)這三個因素而設(shè)計(jì)的。保藏方法大致可分為以下幾種：1 .傳代培養(yǎng)保藏法又有斜面培養(yǎng)、穿刺培養(yǎng)、皰肉培養(yǎng)基培養(yǎng)等（后者作保藏厭氧細(xì)菌用），培養(yǎng)后于4-6 r 冰箱內(nèi)保存。液體石蠟覆蓋保藏法是傳代培養(yǎng)的變相方法，能夠適當(dāng)延長保藏時間，它是在斜面培養(yǎng)物和穿刺培養(yǎng)物上面 覆蓋滅菌的液體石蠟，一方面可防止因培養(yǎng)基水分蒸發(fā)而引起菌種死亡，另一方面可阻止氧 氣進(jìn)入

2、，以減弱代謝作用。載體保藏法是將微生物吸附在適當(dāng)?shù)妮d體，如土壤、沙子、硅膠、濾紙上，而后進(jìn)行干燥的保藏法， 例如沙土保藏法和濾紙保藏法應(yīng)用相當(dāng)廣泛。寄主保藏法用于目前尚不能在人工培養(yǎng)基上生長的微生物，如病毒、立克次氏體、螺旋體等，它們 必須在生活的動物、昆蟲、雞胚內(nèi)感染并傳代，此法相當(dāng)于一般微生物的傳代培養(yǎng)保藏法。 病毒等微生物亦可用其他方法如液氮保藏法與冷凍干燥保藏法進(jìn)行保藏。5 .冷凍保藏法可分低溫冰箱（-20-30C，-5 -80C）、干冰酒精快速凍結(jié)（約-70C）和液氮（-196C） 等保藏法。6.冷凍干燥保藏法先使微生物在極低溫度（-70C左右）下快速冷凍，然后在減壓下利用升華現(xiàn)象除

3、去水 分（真空干燥）。有些方法如濾紙保藏法、液氮保藏法和冷凍干燥保藏法等均需使用保護(hù)劑來制備細(xì)胞懸 液，以防止因冷凍或水分不斷升華對細(xì)胞的損害。保護(hù)性溶質(zhì)可通過氫和離子鍵對水和細(xì)胞 所產(chǎn)生的親和力來穩(wěn)定細(xì)胞成分的構(gòu)型。保護(hù)劑有牛乳、血清、糖類、甘油、二甲亞砜等。三、器材細(xì)菌、酵母菌，放線菌和霉菌:肉膏蛋白胨斜面培養(yǎng)基，滅菌脫脂牛乳，滅菌水，化學(xué)純的液體石蠟，甘油，五氧化二 磷，河沙，瘦黃土或紅土，冰塊、食鹽，干冰，95%酒精，10%鹽酸，無水氯化鈣；滅菌吸管，滅菌滴管，滅菌培養(yǎng)皿，管形安甑管，淚滴形安甑管（長頸球形底），40 目與100目篩子，油紙，濾紙條（0. 5x1. 2cm），干燥器，真

4、空泵，真空壓力表，噴燈， L形五通管，冰箱，低溫冰箱（-30C），液氮冷凍保藏器。四、操作步驟、各保藏法的應(yīng)用范圍及優(yōu)缺點(diǎn)下列各法可根據(jù)實(shí)驗(yàn)室具體條件與需要選做。斜面低溫保藏法將菌種接種在適宜的固體斜面培養(yǎng)基上，待菌充分生長后，棉塞部分用油紙包扎好，移 至28C的冰箱中保藏。保藏時間依微生物的種類而有不同，霉菌、放線菌及有芽孢的細(xì)菌保存24個月，移 種一次。酵母菌兩個月，細(xì)菌最好每月移種一次。此法為實(shí)驗(yàn)室和工廠菌種室常用的保藏法，優(yōu)點(diǎn)是操作簡單，使用方便，不需特殊設(shè)備， 能隨時檢查所保藏的菌株是否死亡、變異與污染雜菌等。缺點(diǎn)是容易變異，因?yàn)榕囵B(yǎng)基的物 理、化學(xué)特性不是嚴(yán)格恒定的，屢次傳代會使微

5、生物的代謝改變，而影響微生物的性狀：污 染雜菌的機(jī)會亦較多。液體石蠟保藏法（1）將液體石蠟分裝于三角燒瓶內(nèi)，塞上棉塞，并用牛皮紙包扎，1. 05kg/cm2，121. 3C 滅菌30分鐘，然后放在40C溫箱中，使水汽蒸發(fā)掉，備用。（2）將需要保藏的菌種，在最適宜的斜面培養(yǎng)基中培養(yǎng)，使得到健壯的菌體或孢子。（3）用滅菌吸管吸取滅菌的液體石蠟，注入己長好菌的斜面上，其用量以高出斜面頂 端1cm為準(zhǔn)（圖W-12），使菌種與空氣隔絕。將試管直立，置低溫或室溫下保存(有的微生物在室溫下比冰箱中保存的時間還 要長)。此法實(shí)用而效果好。霉菌、放線菌、芽孢細(xì)菌可保藏2年以上不死，酵母菌可保藏12 年，一般無芽

6、孢細(xì)菌也可保藏1年左右，甚至用一般方法很難保藏的腦膜炎球菌，在37 r 溫箱內(nèi)，亦可保藏3個月之久。此法的優(yōu)點(diǎn)是制作簡單，不需特殊設(shè)備，且不需經(jīng)常移種。 缺點(diǎn)是保存時必須直立放置，所占位置較大，同時也不便攜帶。從液體石蠟下面取培養(yǎng)物移 種后，接種環(huán)在火焰上燒灼時，培養(yǎng)物容易與殘留的液體石蠟一起飛濺，應(yīng)特別注意。濾紙保藏法將濾紙剪成0. 5x1. 2cm的小條，裝入0. 6x8cm的安甑管中，每管12張， 塞以棉塞，1. 05kg/cm2，121. 3C滅菌30分鐘。將需要保存的菌種，在適宜的斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng)，使充分生長。取滅菌脫脂牛乳12ml滴加在滅菌培養(yǎng)皿或試管內(nèi)，取數(shù)環(huán)菌苔在牛乳內(nèi)混勻，

7、制成濃懸液。用滅菌鑷子自安甑管取濾紙條浸入菌懸液內(nèi)，使其吸飽，再放回至安甑管中，塞 上棉塞。將安甑管放入內(nèi)有五氧化二磷作吸水劑的干燥器中，用真空泵抽氣至干。將棉花塞入管內(nèi)，用火焰按圖W-13熔封，保存于低溫下。需要使用菌種，復(fù)活培養(yǎng)時，可將安甑管口在火焰上燒熱，滴一滴冷水在燒熱的 部位，使玻璃破裂，再用鑷子敲掉口端的玻璃，待安甑管開啟后，取出濾紙，放入液體培養(yǎng) 基內(nèi)，置溫箱中培養(yǎng)。細(xì)菌、酵母菌、絲狀真菌均可用此法保藏，前兩者可保藏2年左右，有些絲狀真菌甚至 可保藏1417年之久。此法較液氮、冷凍干燥法簡便，不需要特殊設(shè)備。沙土保藏法取河沙加入10%稀鹽酸，加熱煮沸30分鐘，以去除其中的有機(jī)質(zhì)。

8、倒去酸水，用自來水沖洗至中性。烘干，用40目篩子過篩，以去掉粗顆粒，備用。另取非耕作層的不含腐植質(zhì)的瘦黃土或紅土，加自來水浸泡洗滌數(shù)次，直至中性。烘干，碾碎，通過100目篩子過篩，以去除粗顆粒。按一份黃土、三份沙的比例(或根據(jù)需要而用其他比例，甚至可全部用沙或全部 用土)摻合均勻，裝入10 x100mm的小試管或安甑管中，每管裝1g左右，塞上棉塞，進(jìn)行 滅菌，烘干。抽樣進(jìn)行無菌檢查，每10支沙土管抽一支，將沙土倒入肉湯培養(yǎng)基中，37C培養(yǎng) 48小時，若仍有雜菌，則需全部重新滅菌，再作無菌試驗(yàn)，直至證明無菌，方可備用。選擇培養(yǎng)成熟的(一般指孢子層生長豐滿的，營養(yǎng)細(xì)胞用此法效果不好)優(yōu)良菌 種，以

9、無菌水洗下，制成孢子懸液。于每支沙土管中加入約0. 5ml (一般以剛剛使沙土潤濕為宜)孢子懸液，以接種 針拌勻。放入真空干燥器內(nèi)，用真空泵抽干水分，抽干時間越短越好，務(wù)使在12小時內(nèi) 抽干。每10支抽取一支，用接種環(huán)取出少數(shù)沙粒，接種于斜面培養(yǎng)基上，進(jìn)行培養(yǎng)， 觀察生長情況和有無雜菌生長，如出現(xiàn)雜菌或菌落數(shù)很少或根本不長，則說明制作的沙土管 有問題，尚須進(jìn)一步抽樣檢查。若經(jīng)檢查沒有問題，用火焰熔封管口，放冰箱或室內(nèi)干燥處保存。每半年檢查一 次活力和雜菌情況。需要使用菌種，復(fù)活培養(yǎng)時，取沙土少許移入液體培養(yǎng)基內(nèi)，置溫箱中培養(yǎng)。此法多用于能產(chǎn)生孢子的微生物如霉菌、放線菌，因此在抗生素工業(yè)生產(chǎn)中應(yīng)

10、用最廣， 效果亦好，可保存2年左右，但應(yīng)用于營養(yǎng)細(xì)胞效果不佳。液氮冷凍保藏法準(zhǔn)備安甑管用于液氮保藏的安甑管，要求能耐受溫度突然變化而不致破裂，因此， 需要采用硼硅酸鹽玻璃制造的安甑管，安甑管的大小通常使用75x10mm的，或能容1. 2mm 液體的。加保護(hù)劑與滅菌保存細(xì)菌、酵母菌或霉菌孢子等容易分散的細(xì)胞時，則將空安甑 管塞上棉塞，1. 05kg/cm2, 121. 3C滅菌15分鐘：若作保存霉菌菌絲體用則需在安甑管內(nèi) 預(yù)先加入保護(hù)劑如10%的甘油蒸餾水溶液或10%二甲亞砜蒸餾水溶液，加入量以能浸沒以 后加入的菌落圓塊為限，而后再用1. 05kg/cm2，121. 3C滅菌15分鐘。接入菌種將

11、菌種用10%的甘油蒸餾水溶液制成菌懸液，裝入已滅菌的安甑管；霉 菌菌絲體則可用滅菌打孔器，從平板內(nèi)切取菌落圓塊，放入含有保護(hù)劑的安甑管內(nèi)，然后用 火焰熔封。浸入水中檢查有無漏洞。凍結(jié)再將已封口的安甑管以每分鐘下降1C的慢速凍結(jié)至-30C。若細(xì)胞急劇冷凍， 則在細(xì)胞內(nèi)會形成冰的結(jié)晶，因而降低存活率。保藏經(jīng)凍結(jié)至-30C的安甑管立即放入液氮冷凍保藏器(圖W-14)的小圓筒內(nèi)， 然后再將小圓筒放入液氮保藏器內(nèi)。液氮保藏器內(nèi)的氣相為-150C，液態(tài)氮內(nèi)為-196C?；謴?fù)培養(yǎng)保藏的菌種需要用時，將安甑管取出，立即放入38-40C的水浴中進(jìn)行 急劇解凍，直到全部融化為止。再打開安甑管，將內(nèi)容物移入適宜的培

12、養(yǎng)基上培養(yǎng)。此法除適宜于一般微生物的保藏外，對一些用冷凍干燥法都難以保存的微生物如支原體、 衣原體、氫細(xì)菌、難以形成孢子的霉菌、噬菌體及動物細(xì)胞均可長期保藏，而且性狀不變異。 缺點(diǎn)是需要特殊設(shè)備。冷凍干燥保藏法準(zhǔn)備安甑管用于冷凍干燥菌種保藏的安甑管宜采用中性玻璃制造，形狀可用長頸 球形底的，亦稱淚滴型安甑管(圖四15)，大小要求外徑67. 5mm，長105mm，球部直 徑911mm，壁厚0. 61. 2mm。也可用沒有球部的管狀安甑管。塞好棉塞，1. 05kg/cm2， 121. 3C滅菌30分鐘，備用。準(zhǔn)備菌種，用冷凍干燥法保藏的菌種，其保藏期可達(dá)數(shù)年至十?dāng)?shù)年，為了在許多 年后不出差錯，故所

13、用菌種要特別注意其純度，即不能有雜菌污染，然后在最適培養(yǎng)基中用 最適溫度培養(yǎng)，使培養(yǎng)出良好的培養(yǎng)物。細(xì)菌和酵母的菌齡要求超過對數(shù)生長期，若用對數(shù) 生長期的菌種進(jìn)行保藏，其存活率反而降低。一般，細(xì)菌要求2448小時的培養(yǎng)物；酵母 需培養(yǎng)3天；形成孢子的微生物則宜保存孢子；放線菌與絲狀真菌則培養(yǎng)710天。制備菌懸液與分裝以細(xì)菌斜面為例，用脫脂牛乳2ml左右加入斜面試管中，制成 濃菌液，每支安甑管分裝0. 2ml。冷凍冷凍干燥器有成套的裝置出售，價值昂貴，此處介紹的是簡易方法與裝置， 可達(dá)到同樣的目的。將分裝好的安甑管放低溫冰箱中冷凍，無低溫冰箱可用冷凍劑如干冰(固體CO2)酒 精液或干冰丙酮液，溫度可達(dá)-70C。將安甑管插入冷凍劑，只需冷凍45分鐘，即可使懸 液結(jié)冰。真空干燥為在真空干燥時使樣品保持凍結(jié)狀態(tài)，需準(zhǔn)備冷凍槽，槽內(nèi)放碎冰塊與 食鹽，混合均勻，可冷至-15C。裝置儀器如圖W-16，安甑管放入冷凍槽中的干燥瓶內(nèi)。抽氣一般若在30分鐘內(nèi)能達(dá)到93. 3Pa (0. 7mmHg)真空度時，則干燥物不致熔化， 以后再繼續(xù)抽氣，幾小時內(nèi)，肉眼可觀察到被干燥物已趨干燥，一般抽到真空度26. 7Pa (0. 2mmHg)，保持壓力68小時即可。封口抽真空干燥后，取出安甑