醫(yī)學(xué)微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)

1、.：.；醫(yī)學(xué)微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指點(diǎn)皖南醫(yī)學(xué)院微生物學(xué)和免疫學(xué)教研室2006年5月微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的目的與要求醫(yī)學(xué)微生物學(xué)的實(shí)驗(yàn)課是本課程學(xué)習(xí)中的重要環(huán)節(jié)。醫(yī)學(xué)微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)課的目的：在于使學(xué)生加深和穩(wěn)定對(duì)講課內(nèi)容的了解和領(lǐng)會(huì)，并在系統(tǒng)學(xué)習(xí)實(shí)際的根底上，使學(xué)生學(xué)習(xí)并掌握微生物學(xué)的根本操作技術(shù)，培育獨(dú)立思索的才干，為今后的臨床實(shí)際及科學(xué)研討任務(wù)打下良好的根底。為了提高實(shí)驗(yàn)課的效果，應(yīng)做到以下幾點(diǎn)：一、每次實(shí)驗(yàn)前作好預(yù)習(xí)，明確實(shí)驗(yàn)?zāi)康?，?nèi)容，操作中留意點(diǎn)及其實(shí)際根據(jù)，防止或減少錯(cuò)誤發(fā)生。二、在實(shí)驗(yàn)過程中，應(yīng)持嚴(yán)肅仔細(xì)的科學(xué)態(tài)度，并要留意合理地分配和利用時(shí)間。三、在微生物學(xué)的整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中，應(yīng)嚴(yán)厲加強(qiáng)“無菌觀念的

2、培育和訓(xùn)練。四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果須真實(shí)記錄，進(jìn)展分析，得出結(jié)論。照實(shí)驗(yàn)結(jié)果與實(shí)際不符，應(yīng)討論緣由，訓(xùn)練科學(xué)思想的才干。實(shí)驗(yàn)完成后，要寫出實(shí)驗(yàn)報(bào)告。微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室規(guī)那么微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的對(duì)象大多是病原微生物，因此必需嚴(yán)厲貫徹“無菌觀念，防止實(shí)驗(yàn)中本身感染和環(huán)境污染是微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室的最重要原那么。一、盡量不帶個(gè)人生活、學(xué)慣用品入實(shí)驗(yàn)室，必要的器具帶入后，應(yīng)放在遠(yuǎn)離操作的位置。二、進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室后穿上任務(wù)衣，離室時(shí)脫下反疊帶走。在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)應(yīng)堅(jiān)持安靜、整潔、有次序，不得高聲談笑，隨意走動(dòng)或裝配儀器、搬弄標(biāo)本。三、實(shí)驗(yàn)室內(nèi)嚴(yán)禁吸煙、進(jìn)食、飲水，嚴(yán)禁用嘴吸移液及潤(rùn)濕標(biāo)簽，盡量不要用手觸摸頭面部及身體其他暴露部位。四、如遇

3、不慎而突破菌種管或使有菌資料污染皮膚、衣物、桌面等情況，應(yīng)立刻報(bào)告指點(diǎn)教師，切勿隱瞞或自行處置。五、被污染過且需求回收的吸管、滴管、試管、玻片等物運(yùn)用完后立刻投入已預(yù)備的消毒液中，不得放在桌面上或水槽內(nèi)。六、維護(hù)公物，節(jié)約試劑資料，不得將實(shí)驗(yàn)室任何物品私自帶走。如遇儀器、用品損壞，應(yīng)報(bào)告指點(diǎn)教師并按規(guī)定予以賠償。七、實(shí)驗(yàn)終了，整理桌面，值日生清掃室內(nèi)衛(wèi)生，最后分開的同窗應(yīng)留意關(guān)好水電、門窗，洗手后離室。實(shí)驗(yàn)一 自然界與人體的微生物檢查實(shí)驗(yàn)?zāi)康模毫私馕⑸镌诳諝?、物體外表及正常機(jī)體外表的分布，加強(qiáng)消毒及無菌操作的觀念。實(shí)驗(yàn)資料：普通瓊脂平板、無菌棉棒、無菌生理鹽水、蠟筆、酒精燈。實(shí)驗(yàn)內(nèi)容：一、空

4、氣中微生物的檢查：取無菌普通瓊脂平板一只，翻開后暴露在空氣中，30分鐘后蓋好，置37溫箱孵育24小時(shí)，察看各種菌落的特征。二、皮膚、粘膜及其它物品外表微生物的檢查：取普通瓊脂平板一只，用蠟筆在皿底玻璃上劃分四區(qū)，將標(biāo)簽紙貼于正中，分別注明皮膚、粘膜、硬幣或鋼筆等字樣。然后反轉(zhuǎn)，翻開平板：1、 用手指在注明“皮膚處瓊脂上悄然擦拭。2、 把沾取了無菌生理鹽水的濕棉棒在管壁上擠干水，擦拭咽部或鼻腔粘膜，然后悄然抹在“粘膜處瓊脂上。3、分別取硬幣或鋼筆等物在相應(yīng)區(qū)域內(nèi)抹擦。蓋好平板，置37溫箱內(nèi)孵育24小時(shí)后，察看菌落的生長(zhǎng)情況。實(shí)驗(yàn)報(bào)告： 察看與記錄結(jié)果。實(shí)驗(yàn)二 油鏡的運(yùn)用實(shí)驗(yàn)?zāi)康模菏炝?xí)顯微鏡的運(yùn)用

5、方法。實(shí)驗(yàn)資料：標(biāo)本片、顯微鏡、香柏油、擦鏡紙、二甲苯。實(shí)驗(yàn)原理：運(yùn)用油鏡時(shí)，需在玻片上滴加香柏油。這是由于油鏡的放大倍數(shù)較高，而透鏡很小，光線經(jīng)過不同密度的介質(zhì)物體玻片空氣透鏡時(shí)，部分光線會(huì)發(fā)生折射而散失，進(jìn)入鏡筒的光線少，視野較暗，物體察看不清。如在透鏡與玻片之間滴加和玻璃折射率n=1.52相仿的香柏油n=1.515，那么使進(jìn)入油鏡的光線增多，視野亮度加強(qiáng)，物象明晰。 D C B A 油 空 氣 玻璃 空氣 A B C D圖1 油鏡的原理表示圖實(shí)驗(yàn)方法：1、用油鏡時(shí)，勿將鏡臂彎曲傾斜，以免油滴或菌液流淌外溢，影響察看呵斥污染。2、用低倍鏡對(duì)光，自然光線用平面鏡光源不宜采用直射日光，因直射日

6、光的強(qiáng)度太大容易刺激眼睛，人工光源用凹面鏡，同時(shí)調(diào)理集光器和光圈以獲得最適亮度。染色標(biāo)本油鏡檢查時(shí)，應(yīng)將光圈完全翻開，集光器上升至載物臺(tái)相平，使光亮度很強(qiáng)。3、標(biāo)本片放在載物臺(tái)上，用標(biāo)本推進(jìn)器或壓片夾固定。4、低倍鏡找出標(biāo)本的范圍，然后在待檢部位上加一滴香柏油，轉(zhuǎn)動(dòng)鏡頭轉(zhuǎn)換器，將油鏡頭置于任務(wù)位置，從側(cè)面察看并緩慢轉(zhuǎn)動(dòng)粗調(diào)理器，使油鏡頭浸沒在油滴內(nèi)，當(dāng)油鏡頭幾乎接觸玻片時(shí)停頓轉(zhuǎn)動(dòng)，然后眼睛移至目鏡，緩慢向上挪動(dòng)粗調(diào)理器只應(yīng)上升，不能下降，以免壓碎標(biāo)本和損壞鏡頭，待看到模糊物象時(shí)，再用細(xì)調(diào)理器轉(zhuǎn)動(dòng)至物象完全明晰為止。5、察看終了，取下標(biāo)本片，立刻用擦鏡紙順一個(gè)方向旋轉(zhuǎn)擦拭鏡頭上的油。假設(shè)油已干，

7、應(yīng)先用二甲苯滴在擦鏡紙上擦凈鏡頭，再用另一干凈擦鏡紙拭去鏡頭上沾有的二甲苯。6、顯微鏡擦凈后，降低物鏡并將其轉(zhuǎn)成八字形，集光器下降，反光鏡推平，光圈關(guān)上，歸還顯微鏡室。實(shí)驗(yàn)三 細(xì)菌的根本形狀和特殊構(gòu)造實(shí)驗(yàn)?zāi)康模赫莆占?xì)菌的根本形狀和特殊構(gòu)造。資料及方法：一、細(xì)菌的根本形狀示教1、球菌：葡萄球菌，革蘭氏染色陽性。2、桿菌：大腸桿菌，革蘭氏染色陰性。3、弧菌：霍亂弧菌，革蘭氏染色陰性。二、細(xì)菌的特殊構(gòu)造示教1、莢膜：肺炎球菌，成雙陳列，菌體周圍不著色的透明圈即是莢膜所在處。經(jīng)莢膜染色后，菌體與背景呈現(xiàn)紫色，莢膜為無色。2、鞭毛：傷寒桿菌，菌體周圍有周鞭毛。經(jīng)鞭毛染色后，菌體和周鞭毛均呈紫色。3、芽胞

8、：破傷風(fēng)桿菌，菌體細(xì)長(zhǎng)，頂端可見一正圓形芽胞。經(jīng)芽胞染色后，菌體為藍(lán)色，芽胞為紅色。實(shí)驗(yàn)報(bào)告：1、繪圖闡明各種形狀細(xì)菌的大小、形狀、陳列方式，并注明染色性及放大倍數(shù)。2、繪圖闡明細(xì)菌的特殊構(gòu)造，并注明染色性及放大倍數(shù)。實(shí)驗(yàn)四 根底培育基的制備培育基是根據(jù)微生物生長(zhǎng)繁衍時(shí)對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的需求而配制的營(yíng)養(yǎng)制品，含有營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)及適宜的酸堿度，經(jīng)滅菌后運(yùn)用。常用的培育基按用途分為：根底培育基、營(yíng)養(yǎng)培育基、鑒別培育基、選擇培育基及厭氧培育基。按物理性狀分為固體、半固體和液體三種。實(shí)驗(yàn)?zāi)康模毫私獬Ｓ玫囊后w、固體、半固體培育基的成分、制備方法和用途。實(shí)驗(yàn)資料：牛肉、蛋白胨、氯化鈉、瓊脂、0.1mol/lNaOH溶

9、液、酚紅指示劑、蒸餾水等。實(shí)驗(yàn)方法：一、肉湯培育基將鮮牛肉除去筋膜和脂肪，切成小塊后用絞肉機(jī)絞碎，以每500g碎牛肉加1000ml蒸餾水的比例混合后，置4冰箱過夜。次日取出浸泡物倒入容器內(nèi)煮沸半小時(shí)，使肉渣凝固，也可煮沸一小時(shí)不經(jīng)冰箱過夜。用紗布和脫脂棉過濾，除去肉渣，即成肉浸汁。參與1%蛋白胨及0.5%氯化鈉，加熱溶解并用蒸餾水補(bǔ)足蒸發(fā)失去的水分。待冷至50左右時(shí)，調(diào)該溶液的pH至7.47.6。校正pH的方法為：取三支與規(guī)范比色管pH7.6一樣的空比色管，其中一管內(nèi)盛放蒸餾水5ml；另外兩管各參與欲測(cè)的肉湯培育基5ml，其中一管內(nèi)加0.02%酚紅指示劑0.25ml滴定管，搖勻。按圖2所示陳列

10、，舉起比色架，對(duì)光察看。假設(shè)滴定管顏色較淡或?yàn)辄S色，即表示培育基偏酸性，需滴加0.1mol/L NaOH矯正；假設(shè)呈深紅色，即表示偏堿性，應(yīng)滴加0.1mol/L HCl矯正；使之與規(guī)范比色管色澤一樣為止。通常未矯正前的肉湯均呈酸性。記下用去的NaOH或HCl溶液量，由此計(jì)算出矯正全量培育基時(shí)所需NaOH或HCl溶液量。圖2 pH比色架酸堿度矯正后，加熱煮沸10分鐘，用濾紙過濾，補(bǔ)足水分，再調(diào)一次pH值。分裝肉湯于三角燒瓶或試管，瓶口、管口加棉塞并用紙包扎。置高壓滅菌器內(nèi)103.43Kpa20分鐘滅菌備用。可用市售的牛肉膏替代牛肉，用量為0.3%，其他成分一樣如蛋白胨、氯化鈉等加熱溶解，調(diào)理pH

11、至7.6左右，煮沸10分鐘，補(bǔ)充失水、過濾、分裝，滅菌后備用。二、固體培育基1、在上述制備的肉湯中參與2-3%的瓊脂。瓊脂為海藻中提取的一種多糖類物質(zhì)，本身無營(yíng)養(yǎng)作用，不能被細(xì)菌利用。因其加熱到100后可溶化，冷卻至40左右又可凝固，故可作為賦形劑。加熱溶化，脫脂棉過濾，補(bǔ)足失水，分裝三角燒瓶和試管。2、置高壓滅菌器內(nèi)103.43Kpa滅菌20分鐘，取出后趁熱將試管傾斜一定角度放置，待瓊脂凝固即成瓊脂斜面培育基圖3。三角燒瓶?jī)?nèi)培育基冷至50-60時(shí)在超凈臺(tái)或無菌室內(nèi)將其傾注于滅菌平皿內(nèi)15-20ml，凝固后即成瓊脂平板。圖3 瓊脂斜面培育基另外，實(shí)踐任務(wù)中現(xiàn)多運(yùn)用合成營(yíng)養(yǎng)瓊脂枯燥粉末制劑。其方

12、法為：稱取41克營(yíng)養(yǎng)瓊脂枯燥粉末參與1000ml冷蒸餾水中混合放置10分鐘，隔石棉鐵絲網(wǎng)微火煮沸使其完全溶解，分裝于中試管中約57ml或三角燒瓶，103.43kPa121滅菌15分鐘，即可備用。三、半固體培育基1、操作方法同固體培育基，但瓊脂參與量較少，僅0.3-0.5%。2、分裝試管，滅菌后使試管直立，冷凝后即成半固體培育基。實(shí)驗(yàn)五 細(xì)菌的分別與培育實(shí)驗(yàn)?zāi)康模赫莆赵诟鞣N培育基上的接種方法并察看生長(zhǎng)景象。實(shí)驗(yàn)資料：菌種、普通瓊脂平板、肉湯培育基、半固體培育基、斜面培育基、接種環(huán)、接種針、酒精燈。實(shí)驗(yàn)內(nèi)容：一、平板劃線接種法分別培育法原理：經(jīng)過在平板上劃線，將混雜的細(xì)菌在瓊脂平板外表充分的分散開

13、，使單個(gè)細(xì)菌能固定在一點(diǎn)上生長(zhǎng)繁衍，構(gòu)成單個(gè)菌落，以到達(dá)分別純種的目的。假設(shè)需從平板上獲取純種，那么挑取一個(gè)單個(gè)菌落作純培育。用途： 分別出純種細(xì)菌，以利作純培育。操作方法三區(qū)劃線法：1、右手拿接種環(huán)，燒灼冷卻后，取菌液一環(huán)。2、左手抓握瓊脂平板讓皿蓋留于桌上，在酒精燈火焰左前上方，使平板面向火焰，以免空中雜菌落入，右手將已沾菌的接種環(huán)在瓊脂外表密集而不重疊的來回劃線，面積約占整個(gè)平板的1/5-1/6，此為第一區(qū)。劃線時(shí)接種環(huán)與瓊脂呈30-40度角悄然接觸，利用腕力滑動(dòng)，切忌劃破瓊脂。3、接種環(huán)上多余的細(xì)菌可燒灼每劃完一個(gè)區(qū)域能否需求燒灼滅菌視標(biāo)本中含菌量多少而定，待冷后，在劃線末端反復(fù)2-3

14、根線后，再劃下一區(qū)域約占1/4面積，此為第二區(qū)。4、第二區(qū)劃完后可不燒灼接種環(huán)，用同樣方法劃第三區(qū)，劃滿整個(gè)平皿。5、劃線終了，將平板扣入皿蓋并作好標(biāo)志，置37溫箱孵育18-24小時(shí)察看瓊脂外表菌落分布情況，留意能否分別出單個(gè)菌落，并記錄菌落特征如大小、外形、透明度、色素等。圖4-1 平板分區(qū)劃線法圖4-2 培育后菌落分布情況二、液體培育基接種法用途：凡肉湯、蛋白胨水，各種單糖發(fā)酵均用此法接種?？梢圆炜醇?xì)菌不同的生長(zhǎng)性狀、生化特性以供鑒別之用。操作方法：右手執(zhí)筆式握住接種環(huán)，滅菌冷卻后取單個(gè)菌落。左手拇指、食指、中指托住液體培育基之下端，右手小指和無名指或手掌拔取試管塞，將管口移至火焰上旋轉(zhuǎn)燒

15、灼。將沾菌的接種環(huán)移入培育基管中，在液體偏少側(cè)接近液面的管壁上悄然研磨，沾取少許液體與之調(diào)和，使菌液混合于培育基中圖5。管口經(jīng)過火焰，塞好試管塞，將接種環(huán)滅菌后放下，經(jīng)37溫箱孵育18-24小時(shí)，取出察看生長(zhǎng)情況。三、半固體穿刺接種法用途：察看細(xì)菌動(dòng)力，保管菌種。方法：1、以無菌操作用接種針挑取單個(gè)菌落，立刻垂直插入培育基中心至接近管底處循原路退回。2、管口經(jīng)過火焰，塞上棉塞，接種針滅菌后放下。試管置37溫箱孵育18-24小時(shí)，取出后對(duì)光察看穿刺線上細(xì)菌生長(zhǎng)情況：細(xì)菌有無向周圍分散生長(zhǎng)，穿刺線能否明晰等。 圖5 液體左及半固體右培育基接種法四、斜面培育基接種法用途：常用于擴(kuò)展純種細(xì)菌及實(shí)驗(yàn)室保

16、管菌種。操作方法：以無菌操作法用接種環(huán)挑取單個(gè)菌落，自斜面底向上劃不斷線，然后再?gòu)牡紫蛏锨娜粊砘刈黩暄褎澗€。管口經(jīng)過火焰，塞上棉塞，接種環(huán)燒灼后方可放下。置37溫箱孵育18-24小時(shí)，取出察看斜面上菌苔生長(zhǎng)情況。 圖6 斜面培育基接種法實(shí)驗(yàn)報(bào)告：詳細(xì)記錄細(xì)菌在各種培育基中生長(zhǎng)后的表現(xiàn)。實(shí)驗(yàn)六 病原性球菌的檢查一實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?了解病原性球菌的檢查程序。2掌握細(xì)菌涂抹標(biāo)本制備和革蘭氏染色法。3掌握病原性球菌的形狀和分別培育法。實(shí)驗(yàn)資料：病原性球菌的形狀、膿汁標(biāo)本、革蘭氏染色液、普通平板、血平板、玻片、接種環(huán)、酒精燈、光學(xué)顯微鏡、香柏油、吸水紙、擦鏡紙、標(biāo)志筆。實(shí)驗(yàn)內(nèi)容：一、病原性球菌的檢查程序病原性

17、球菌常引起化膿性疾病，分別用標(biāo)本多采用膿、痰液，但也可從分泌物、血液及穿刺液中取材。1、標(biāo)本采集1膿液：用無菌棉拭挑取患部深處膿液或分泌物，放入無菌試管內(nèi)。2痰液：用消毒過的容器搜集病人痰液，以無菌棉拭挑取濃稠痰塊，放入無菌試管。3咽部分泌物：囑病人張開口，用壓舌板輕壓舌根部，以無菌棉拭從鼻咽部位擦拭取材，然后將其放入無菌試管。4血液：高熱、敗血癥患者作血液檢樣時(shí)，最好在發(fā)熱時(shí)，抗菌藥物治療前采取，這時(shí)培育陽性率最高。取血35毫升，立刻以無菌手續(xù)注入3050毫升使血與培育基之比約等于110的葡萄糖酚紅肉湯增菌培育基中。5腦脊液：對(duì)疑患流腦的患者作腰椎穿刺取腦脊液CSF，腦脊液取出后應(yīng)盛于無菌容

18、器內(nèi)，立刻送檢。6尿道、陰道分泌物：對(duì)淋病可疑患者，男性可從尿道取材，取材時(shí)應(yīng)進(jìn)入尿道12cm，如剛排尿，應(yīng)等待1小時(shí)左右。女性那么可從宮頸口取分泌物，當(dāng)插入宮頸口后應(yīng)稍等片刻，再旋轉(zhuǎn)12分鐘拿出，取材應(yīng)立刻送檢，不可放置冰箱。2、分別與鑒定待檢標(biāo)本可直接作涂片染色檢查鑒定，必要時(shí)可作分別培育及生化反響，致病性鑒定。常見致病性球菌的檢查程序如下。 直接涂片、革蘭氏染色、鏡檢形狀、陳列、染色性 察看菌落性狀、溶血性、色素膿、痰、分泌物 涂片、染色、鏡檢穿刺液、腦脊液 生化反響 血瓊脂平板 挑取可疑菌落 純分別 致病性測(cè)定 藥敏實(shí)驗(yàn)血液、尿、膽汁肉湯增菌培育3717天 培育液混濁或溶血時(shí)，涂片、染

19、色、鏡檢 二、涂片染色鏡檢 一涂抹標(biāo)本制備方法：1、涂片：取干凈的載玻片一張，用蠟筆標(biāo)志，接種環(huán)滅菌后，以接種環(huán)取濃汁標(biāo)本1-2環(huán)，置于玻片的中央，涂成直徑約1cm的均勻薄膜涂片。如用固體培育物，須先加生理鹽水，再將細(xì)菌少許與生理鹽水混勻。2、枯燥：涂片最好在室溫下自然枯燥，必要時(shí)可將涂片膜面向上，小心延續(xù)地在弱火高處略烘，以助水分蒸發(fā)，但切勿緊靠火焰，以免涂膜烤枯，染色后難以檢測(cè)。3、固定：涂片枯燥后，手持玻片一端涂膜面向上在酒精燈上快速地來回經(jīng)過三次，共約23秒鐘，留意溫度不可太高，以玻片涂膜的反面觸及皮膚覺燙而尚能忍受為度。固定的目的一是殺死細(xì)菌；二是使菌體與玻片粘附較牢，在染色時(shí)不致被

20、染液和水沖掉；三是使菌體蛋白變性易著色見圖142二革蘭氏染色法革半氏染色法Gramstain是丹麥細(xì)菌學(xué)家革蘭Christain Gram于1884年發(fā)明的，至今已逾百年，但仍在廣泛運(yùn)用，是細(xì)菌學(xué)中最為經(jīng)典的染色法。其根本過程是標(biāo)本經(jīng)固定后，先用結(jié)晶紫初染，再用革蘭氏碘液媒染，然后用95%酒精脫色，最后用石炭酸復(fù)紅稀釋液復(fù)染。此法可將細(xì)菌染成兩大類：不被酒精脫色仍保管紫色的為革蘭氏陽性菌，被酒精脫色后復(fù)染成紅色的為革蘭氏陰性菌。1、原理：革蘭氏染色法的原理尚不完全清楚，主要有三種學(xué)說：等電學(xué)說：革蘭氏陽性菌等電點(diǎn)Ph23比革蘭氏陰性菌Ph45低，普通染色時(shí)染液的酸堿度在Ph7.0左右，電離后陽

21、性菌帶的負(fù)電荷比陰性菌多，因此與帶正電荷的結(jié)晶紫染料結(jié)合結(jié)實(shí)，不易脫色。通透性學(xué)說：革蘭氏陽性菌細(xì)胞壁構(gòu)造比較致密，肽聚糖層厚，脂質(zhì)含量少，乙醇不易透入，反而可使細(xì)胞壁脫水而構(gòu)成一道屏障，阻止染料向細(xì)胞外滲。革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞壁疏松，肽聚糖層很薄，而外膜、脂蛋白、脂多糖均含有大量脂質(zhì)，易被乙醇溶解，致使細(xì)胞壁通透性增高，細(xì)胞內(nèi)的結(jié)晶紫-碘復(fù)合物容易被乙醇溶解而脫出?；瘜W(xué)學(xué)說：革蘭氏陽性菌細(xì)胞內(nèi)含有某種特殊化學(xué)成分，普通以為是核糖核酸鎂鹽與多糖的復(fù)合物，它和染料-媒染劑復(fù)合物相互結(jié)合，使已著色的細(xì)菌不易脫色。2、革蘭氏染色液的配制：結(jié)晶紫染液：結(jié)晶紫14.0g，溶于95%酒精100ml中，制成結(jié)

22、晶紫酒精飽和液。取出此飽和液20ml與1%草酸銨水溶液80ml混勻。碘液：先將碘化鉀2.0溶于約2ml蒸餾水中，再加碘片1.0g，略加振搖，待碘片完全溶解后，再加蒸餾水至總量為300ml。稀釋石炭酸復(fù)紅染液：取堿性復(fù)紅10.0g或堿性復(fù)紅新4.0g溶于95%酒精100ml中，配成堿性復(fù)紅酒精飽和液；取此飽和液10ml與5%石炭酸水溶液90ml混勻，配成石炭酸復(fù)紅原液；取此原液10ml參與蒸餾水90ml中混勻，即成稀釋石炭酸復(fù)紅染液。3方法：初染：在已固定的細(xì)菌涂片上滴加結(jié)晶紫染液數(shù)滴室溫作用一分鐘后，用細(xì)流水悄然沖洗。媒染：滴加媒染劑碘液數(shù)滴，室溫作用一分鐘，用細(xì)流水沖洗。脫色：滴加95%酒精

23、數(shù)滴，悄然搖動(dòng)玻片幾秒鐘，使均勻脫色，然后斜持玻片，使脫掉的染料隨酒精流去，再滴加酒精，直到流下的酒精無色或稍淡紫色為止約需30s，立刻用細(xì)流水將酒精沖掉。復(fù)染：滴加稀釋石炭酸復(fù)紅液復(fù)染約30秒鐘后用細(xì)流水沖洗。鏡檢：標(biāo)本染色后，涼干，滴香柏油，用油鏡察看，革蘭氏陽性菌染成紫色，革蘭氏陰性菌染成紅色。三、平板劃線接種法分別培育法見細(xì)菌分別與培育。實(shí)驗(yàn)報(bào)告：記錄革蘭氏染色結(jié)果；記錄三區(qū)劃線結(jié)果。實(shí)驗(yàn)七 病原性球菌檢查二實(shí)驗(yàn)?zāi)康?掌握病原性球菌培育物性狀。2掌握血漿凝固酶實(shí)驗(yàn)原理方法。3掌握密集接種法，熟習(xí)藥物如抗生素抑菌殺菌原理并了解紙片法、試管法的實(shí)驗(yàn)方法及運(yùn)用。實(shí)驗(yàn)資料1、菌種：金黃色葡萄球

24、菌、痢疾桿菌68小時(shí)肉湯培育物。2、培育基：普通瓊脂平板、肉湯培育基。3、藥品：青霉素溶液50u/ml、抗生素濾紙片。4、器具：恒溫箱、接種環(huán)、酒精燈、試管、無菌棉拭、無菌小鑷子、無菌吸管、玻片、血漿。實(shí)驗(yàn)內(nèi)容一、病原性球菌的培育物察看肉眼察看葡萄球菌、鏈球菌、肺炎球菌在血瓊脂平板上的生長(zhǎng)情況及腦膜炎球菌在巧克力色瓊脂平板上的生長(zhǎng)情況，比較菌落的形狀特征。1葡萄球菌：在血瓊脂平板上培育1824小時(shí)，構(gòu)成圓表凸起，外表光滑、潮濕、邊緣整齊，菌落不透明。金黃色葡萄球菌金黃色，可產(chǎn)生透明溶血環(huán)；表皮葡萄球菌白色、無溶血環(huán)，腐生葡萄球菌白色或檸檬色，無溶血環(huán)。2鏈球菌：在血瓊脂平板上培育1824小時(shí)，

25、構(gòu)成灰白色、圓形凸起、半透明或不透明的細(xì)小菌落。甲型溶血性鏈球菌不完全溶血，在菌落周圍構(gòu)成草綠色溶血環(huán)，乙型溶血性鏈球菌完全溶血、構(gòu)成透明溶血環(huán)，丙型鏈球菌不發(fā)生構(gòu)成圓形、光滑隆起透明似露珠的菌落。在血瓊脂平板上不發(fā)生溶血溶血、無溶血環(huán)。3肺炎球菌：血瓊脂平板上培育1824小時(shí)，構(gòu)成細(xì)小、灰白色、扁平、半透明的菌落，周圍有草綠色溶血環(huán)，其與甲型溶血性鏈球菌類似，培育23天后，因菌體發(fā)生自溶，菌落中央下陷呈“臍狀。4腦膜炎球菌：在巧克力色瓊脂平板上加5%CO237培育24小時(shí)，構(gòu)成圓形光滑隆起透明似露珠的菌落，無溶血環(huán)。 二、血漿凝固酶實(shí)驗(yàn)1、原理致病性葡萄球菌能產(chǎn)生血漿凝固酶，使人或動(dòng)物血漿發(fā)

26、生凝固，因此，測(cè)定血漿凝固酶的有無是鑒定葡萄球菌致病性的重要根據(jù)。2、方法及結(jié)果玻片法：取干凈玻片一塊，用記號(hào)筆將玻片劃成兩格，其中一格加2接種環(huán)的生理鹽水，另一格加1：2人血漿或免血漿1接種環(huán)。用接種環(huán)取上次培育物葡萄球菌之菌落少許在生理鹽水內(nèi)研磨成細(xì)菌懸液，然后取此懸液1環(huán)與血漿混勻。5分鐘以內(nèi)察看結(jié)果，假設(shè)有凝塊出現(xiàn)，即為陽性；假設(shè)無凝塊出現(xiàn)，那么為陰性。試管法：按表24-1參與1：4血漿及葡萄球菌肉湯培育液。將各管置37水浴中，每隔30分鐘察看一次結(jié)果。在3小時(shí)內(nèi)，假設(shè)第一管及第二管出現(xiàn)凝固，而第三管不出現(xiàn)凝固那么為陽性。表24-1 血漿凝固酶實(shí)驗(yàn)試管法試管血漿1：4待檢葡萄球菌肉湯培

27、育物金黃色葡萄球菌肉湯培育物肉湯結(jié)果10.5ml0.5ml20.5ml0.5ml30.5ml0.5ml三、藥物敏感性實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)原理 治療細(xì)菌感染的藥物如磺胺類、異煙肼、抗生素等殺菌具有抑菌和殺菌作用，其作用機(jī)制主要是干擾細(xì)菌的代謝，妨礙和影響細(xì)菌細(xì)胞壁的合成、膜的通透性及核酸和蛋白質(zhì)的生物合成，不同的細(xì)菌種類或菌株，對(duì)同一藥物的敏感性不同，因此測(cè)定病原菌對(duì)抗菌類藥物的敏感性，對(duì)于合理用藥和提高臨床療效具有重要意義。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)過兩種方法測(cè)定細(xì)菌對(duì)抗生素的敏感程序。 內(nèi)容與方法一、紙片法1、密集接種法接種細(xì)菌：用無菌接種環(huán)挑取已培育好的金黃色葡萄球菌培育物少許，先在平板瓊脂外表中央劃一條線，垂直該線作

28、平行密集劃線，劃滿平板。再將平板轉(zhuǎn)動(dòng)90度，作平行密集劃線，劃滿平板。2、用無菌注射針頭挑取抗生素青霉素、鏈霉素、紅霉素、慶大霉素、卡那霉素等濾紙片，貼在平板瓊脂外表。濾紙片之間間隔 應(yīng)根本相等，普通每個(gè)平板貼四到五個(gè)濾紙片為宜。留意每次取濾紙片之前，針頭須燒灼滅菌冷卻。3、將平板置37溫箱培育24小時(shí)后取出察看濾紙片周圍的抑菌圈見圖201，用尺子丈量其直徑并對(duì)照細(xì)菌對(duì)抗生素敏感度判別表做出結(jié)果判別。二、試管法1、金黃色葡萄球菌菌液制備取金黃色葡萄球菌68小時(shí)肉湯培育物0.1ml加于2ml肉湯培育基中，置37溫箱培育68小時(shí)后備用。2、方法1取10支無菌小試管標(biāo)號(hào)后，除第一管外其它每管參與肉湯

29、培育基1ml。2在第一、二管中各參與青霉素50u/ml溶液1ml，混勻。3從第二管中汲取1ml參與第三管中，混勻，然后依此法加樣稀釋至第九管，再?gòu)牡诰殴苤谐槿?ml棄去。第十管不加青霉素作為對(duì)看管。4于每管中參與金黃色葡萄球菌菌液各0.1ml，混勻。5置37溫箱培育24小時(shí)后察看結(jié)果，以培育基混濁程度來判別細(xì)菌對(duì)青霉素的敏感程度，最高稀釋度的抗菌藥物仍能抑制細(xì)菌生長(zhǎng)者為最低抑菌濃度MIC可用單位/ml表示之。 常用藥敏實(shí)驗(yàn)紙片判別規(guī)范與其相應(yīng)的MIC近似值抗菌藥物 紙 片 抑菌圈直徑毫米 最低抑菌濃度微克/毫升 含藥量 耐藥 中度敏感 敏感 耐藥 敏感 青霉素葡萄球菌 10單位 20 21-2

30、8 29 0.20.1 其它細(xì)菌 10單位 1112-2122321.5鏈 霉 素 10微克 1112-1415 156氯 霉 素 30微克 1213-17182512.5 紅 霉 素 15微克 1314-171882慶 大 霉 素 10微克 1213-141584卡 那 霉 素 30微克 1314-1718256四 環(huán) 素 30微克 1415-1819124多 粘 菌 素 300單位 89-111250單位磺 胺 300微克 1213-1617350 100 甲氧苯青霉素 5微克 910-1314-3萘 啶 酸 30微克 1314-1819 3212實(shí)驗(yàn)報(bào)告：記錄血漿凝固酶實(shí)驗(yàn)結(jié)果；記錄藥敏

31、實(shí)驗(yàn)結(jié)果。 結(jié)合系列實(shí)驗(yàn)結(jié)果，對(duì)病原性球菌鑒定作出結(jié)論。實(shí)驗(yàn)八 腸道桿菌的鑒定一 腸道桿菌是一群寄居于人或動(dòng)物的腸道內(nèi)的細(xì)菌，多數(shù)為非致病菌或條件致病菌，少數(shù)為致病菌。其生物學(xué)性狀類似，但生化反響、抗原構(gòu)造有差別，據(jù)此可將它們分類、鑒定。實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?熟習(xí)腸道桿菌未知標(biāo)本分別和鑒定方法；2掌握肥達(dá)式反響的原理及結(jié)果分析，熟習(xí)其操作過程；3了解大腸桿菌、痢疾桿菌及傷寒桿菌革蘭氏染色形狀示教片4了解腸道桿菌常見的一些生化反響及其在鑒定上意義、實(shí)驗(yàn)資料：1. 大腸桿菌或痢疾桿菌或傷寒桿菌革蘭氏染色形狀示教片大腸桿菌、痢疾桿菌或傷寒桿菌在SS培育基上的培育物示教；大腸桿菌、痢疾桿菌、傷寒桿菌、副傷寒甲或

32、乙等在雙糖鐵培育基上的 培育物示教；大腸桿菌與痢疾桿菌或傷寒桿菌的混合菌液模擬糞便標(biāo)本；痢疾桿菌及傷寒桿菌診斷血清，生理鹽水，玻片；診斷用肥達(dá)式菌液、肥達(dá)式平板、小試管、吸管、無菌滴管、傷寒患者血清經(jīng)5630分鐘滅活、水浴箱等；7. 單糖發(fā)酵管、蛋白胨水培育基、醋酸鉛培育基、葡萄球菌和綠膿桿菌在普通瓊脂平板上的培育物。實(shí)驗(yàn)內(nèi)容： 1肥達(dá)氏反響原理：人體感染傷寒桿菌或副傷寒桿菌后，能產(chǎn)生與這些細(xì)菌起特異性反響的抗體，這種抗體及其量可以用知的抗原來測(cè)得。本實(shí)驗(yàn)用知的傷寒桿菌H、0抗原和甲型、乙型副傷寒桿菌的H抗原與可疑病人血清做定量凝集實(shí)驗(yàn)，可測(cè)定患者血清中相應(yīng)抗體的含量及其增減情況，以協(xié)助傷寒或

33、副傷寒病的診斷。方法：取一有205*4孔的有機(jī)反響板2塊，延續(xù)標(biāo)號(hào)，每行分別標(biāo)號(hào)110。取中試管1支，參與3.9ml生理鹽水，再換一支吸管，汲取患者血清0.1ml經(jīng)5630分鐘滅活放入中試管內(nèi)，吸打混勻；此時(shí)血清稀釋度為1：40。汲取1：40的血清2ml，在每列的第一孔中各參與0.5ml。在中試管余下2ml血清中，再參與2ml生理鹽水，混勻血清稀釋度為1：80。然后汲取此1：80的血清2ml，在每列第2管中各參與0.5ml。按上述倍比稀釋，并依次參與各管，直至每行第9管見表7-1。1 2 3 4 5 6 7 8 9 10HOPAPB140 180 1160 1320 1640 11280 12

34、560 15120 110240 - 表7-1 肥達(dá)氏反響的加樣表示圖另取吸管1支，汲取生理鹽水向每行第10管中各參與0.5ml對(duì)看管按10、9、81列的順序，分別對(duì)第1行各孔參與0抗原1滴；第2行各孔參與H抗原1滴；同樣對(duì)第3行各孔加甲型副傷寒PAH抗原1滴；第4行各孔加乙型副傷寒PBH抗原1滴。由于抗原菌液的參與量少，可忽略不計(jì)。 將各孔混勻，置37水浴箱中2小時(shí)，取出置室溫過夜，次日察看，判別并分析結(jié)果。結(jié)果察看見圖7-1：根據(jù)凝集反響的強(qiáng)弱，分別以“+、+、+、+記錄：+：液體清澈透明，菌體全部被凝成塊，沉于管底。+：液體較透明，大部分菌體被凝集而沉于管底。+：液體稍透明，管底有少量凝

35、集沉淀物。+：液體較混濁，可見極少量凝集物。-：液體混濁，細(xì)菌因重力下降于管底呈邊緣光滑圓點(diǎn)與對(duì)看管類似。管底景象記錄方式圖7-1 肥達(dá)氏反響的結(jié)果斷定血清效價(jià)或滴度：能與一定量的抗原發(fā)生肉眼可見的明顯凝集即“+凝集的血清最高稀釋倍數(shù)，稱為血清的效價(jià)。血清的效價(jià)代表著血清中抗體的含量，其效價(jià)愈高，所含抗體的量愈多。如血清最低稀釋倍數(shù)140仍無凝集，那么視為陰性或效價(jià)低于140；如血清的最高稀釋倍數(shù)11280仍完全凝集，那么示血清效價(jià)高于11280。結(jié)果分析：首先應(yīng)思索當(dāng)?shù)卣Ｈ诵r(jià)正常效價(jià)。普通以單份血清凝集效價(jià)：0效價(jià)應(yīng)達(dá)1：80以上、H效價(jià)應(yīng)在1：160以上，PA和PB應(yīng)達(dá)1：40以上方有

36、診斷價(jià)值；假設(shè)病程中第2次血清效價(jià)比第1次高4倍以上亦有診斷價(jià)值。由于H凝集素在血內(nèi)堅(jiān)持時(shí)間較久，0凝集素較短暫，所以曾接種過傷寒、副傷寒菌苗者，0凝集效價(jià)在診斷上較重要。真正的傷寒病人，0凝集素常較H凝集素出現(xiàn)早、但維持時(shí)間較短；H凝集素出現(xiàn)較晚、但效價(jià)較高且繼續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)?；叵敕错懀哼^去曾接種過傷寒、副傷寒菌苗或患過傷寒、副傷寒病，近期又發(fā)生感染如流感、肝炎、結(jié)核病等，可非特異地產(chǎn)生較高的H凝集素和較低的0凝集素，此景象稱為回想反響。假設(shè)0效價(jià)高而H不高對(duì)正常效價(jià)而言，那么能夠是感染早期或與傷寒桿菌0抗原有交叉反響的其他沙門菌感染。確診為傷寒的患者中，約有10%的患者該實(shí)驗(yàn)一直陰性或效價(jià)不高

37、，故陰性結(jié)果不能排除傷寒的診斷。采血時(shí)間不同，肥達(dá)式反響的陽性率也不同。發(fā)病第1周約為50%；第2周80%；第4周90%以上?；謴?fù)期效價(jià)最高，以后逐漸下降，直至轉(zhuǎn)陰。普通以雙份血清急性期和恢復(fù)期對(duì)比，效價(jià)有明顯上升者作為新近感染的指征。察看大腸桿菌或痢疾桿菌/傷寒桿菌革蘭氏染色形狀示教片腸道致病菌的分別鑒定一1引見腸道致病菌的分別鑒定程序圖7-22分別培育與鑒定詳細(xì)方法取材：挑取黏液膿血樣糞便置清潔容器內(nèi)立刻送檢。假設(shè)不能及時(shí)送檢，運(yùn)用甘油緩沖鹽水保管。假設(shè)無法獲取糞便時(shí)，用肛拭子檢查用無菌棉拭子經(jīng)生理鹽水潮濕后，插入肛門45cm處悄然沿肛壁擦拭一圈后取出，放入含少量甘油緩沖鹽水的無菌試管中送

38、檢。糞便標(biāo)本或肛拭子可直接在SS瓊脂平板上劃線分別培育常用三區(qū)劃線法，詳見實(shí)驗(yàn)五 細(xì)菌的分別與培育。對(duì)血、骨髓、尿等標(biāo)本可先做增菌培育，然后取增菌培育物在上述平板上劃線分別，經(jīng)37培育1824小時(shí)。 2SS平板分別培育方法同前三區(qū)劃線時(shí)留意：無菌操作; 劃線角度準(zhǔn)確，輕而快; 分區(qū)合理； 接種環(huán)適時(shí)處置；培育基正確放置，作好標(biāo)志.。血清學(xué)鑒定取可疑 菌落G染色鏡檢SS瓊脂平板培育基其他生化鑒定雙糖鐵培育基半固體培育基糞便標(biāo)本血清學(xué)鑒定取可疑 菌落G染色鏡檢SS瓊脂平板培育基增菌培育血、骨髓、尿其他生化鑒定雙糖鐵培育基半固體培育基糞便標(biāo)本圖7-2 腸道致病菌的分別鑒定程序附. 有關(guān)培育基及試劑的

39、配制：1肉湯培育基：新穎肉浸液1000ml、蛋白胨10mg、氯化鈉5g，上述各成分混合后調(diào)PH7.27.4，分裝于100ml疫瓶中，每瓶50ml，高壓滅菌后備用。該培育基適宜于各類細(xì)菌的增菌培育。2SS瓊脂平板：牛肉膏5g、蛋白胨5g、乳糖10g、膽鹽8.5g、枸櫞酸鈉8.5g、硫代硫酸鈉8.5g、瓊脂20g、枸櫞酸鐵1g、0.1%煌綠溶液0.33ml、1%中性紅溶液2.5ml、蒸餾水1000ml。除了煌綠、中性紅以外，將其它各成分混合于蒸餾水中，加熱溶化，調(diào)PH至7.0，再參與煌綠和中性紅，分裝于三角燒瓶中，以68.95kPa高壓滅菌10分鐘，待冷至50左右，傾注于無菌平板中，冷后備用。適宜

40、于糞便標(biāo)本中腸道致病菌的分別。實(shí)驗(yàn)報(bào)告：1. 察看示教片并繪圖。2記錄腸道桿菌的分別鑒定程序。 3. 記錄肥達(dá)氏反響的結(jié)果，并判別效價(jià)和作出分析。實(shí)驗(yàn)九 腸道桿菌的鑒定二實(shí)驗(yàn)內(nèi)容： 1. 察看上次實(shí)驗(yàn)結(jié)果在SS平板上的23區(qū)可看見散在的沿劃線分布的大小不同、兩種顏色的菌落。一種是較大的紅色菌落，另一種是較小的半透明的淡黃色或無色的菌落。較大的紅色菌落是腸道致病菌，較小的半透明的淡黃色或無色菌落是腸道致病菌。詳見表8-1。表8-1 大腸桿菌、痢疾桿菌和傷寒桿菌的生物學(xué)特征特性菌名形狀、陳列及染色性在SS平板上的菌落表現(xiàn)生化反響動(dòng)力吲哚乳糖葡萄糖H2S大腸桿菌桿狀，散在陳列，G菌落較大，不透明，呈

41、紅色+痢疾桿菌同上菌落小，半透明，無色或淡黃色+/傷寒桿菌同上菌落較小，半透明，無色或淡黃色+/+注：產(chǎn)酸產(chǎn)氣，“+產(chǎn)酸或陽性，“陰性 2雙糖鐵培育基的接種從SS培育基上挑取較小的無色或淡黃色菌落，可先做革蘭氏染色鏡檢，然后再接種于雙糖鐵培育基中為察看比較，同組四人應(yīng)取大小或顏色不同的兩個(gè)菌落分別接種于兩支雙糖鐵，并作好標(biāo)志。方法：即實(shí)驗(yàn)五引見的半固體接種法和斜面接種法的結(jié)合用接種針以無菌操作技術(shù)挑取標(biāo)本，立刻垂直插入培育基中心至接近管底處，再循原路退出到斜面上； 接種針自斜面最低處向上劃不斷線要求經(jīng)過試管培育基的中心點(diǎn)，然后再?gòu)男泵娴吞幭蛏锨娜粊砘刈黩暄褎澗€；接種終了，蓋好試管塞。貼上標(biāo)簽紙

42、。37培育1824小時(shí)，取出察看結(jié)果并分析參照表8-1附：雙糖鐵培育基：蛋白胨20g，牛肉膏3g，酵母膏3g，乳糖10g，葡萄糖1g，氯化鈉5g，檸檬酸鐵銨0.5g，硫代硫酸鈉0.5g，瓊脂1215g，4g/L酚紅水溶液6ml，蒸餾水1000ml。除糖類和酚紅外，其他各成分均加熱溶解，矯正pH至7.47.6，再參與糖類和酚紅水溶液，混勻，過濾分裝，每管3ml，68.95kPa滅菌15min，取出后制成斜面，斜面和底層各占1/2。3半固體培育基的接種另從SS培育基上挑取較小的無色或淡黃色菌落，可先做革蘭氏染色鏡檢,然后再接種于半固體培育基中為察看比較，同組四人應(yīng)取大小或顏色不同的兩個(gè)菌落分別接種

43、于兩支半固體培育基，并作好標(biāo)志。方法：詳見實(shí)驗(yàn)五細(xì)菌的分別和培育中的半固體接種法。 實(shí)驗(yàn)報(bào)告： 記錄上次SS培育基中出現(xiàn)的結(jié)果繪圖；實(shí)驗(yàn)十 腸道桿菌的鑒定三實(shí)驗(yàn)內(nèi)容： 1. 察看雙糖鐵培育基上細(xì)菌的生化反響情況腸道致病菌： 斜面紅色， 底層黃色 ，假設(shè)構(gòu)成硫化氫，培育基變黑。 腸道非致病菌： 斜面黃色， 底層黃色，能夠有氣泡。原理：培育基的指示劑為酚紅，酸性時(shí)呈黃色，堿性時(shí)呈紅色。發(fā)酵乳糖的細(xì)菌使斜面和底層均呈黃色，可有氣泡產(chǎn)生；假設(shè)只發(fā)酵葡萄糖，那么因葡萄糖含量少，生成少量的酸可因接觸空氣而氧化揮發(fā)，并因細(xì)菌生長(zhǎng)繁衍利用含氮物質(zhì)生成堿性化合物，使斜面呈紅色，底層由于缺氧，細(xì)菌發(fā)酵葡萄糖生成酸

44、類物質(zhì)不氧化而堅(jiān)持黃色；如細(xì)菌分解蛋白質(zhì)中的胱氨酸產(chǎn)生硫化氫，那么與硫酸亞鐵作用生成黑色的硫化亞鐵沉淀，使培育基變黑。2.察看半固體培育基上的細(xì)菌生長(zhǎng)景象假設(shè)細(xì)菌沿穿刺線生長(zhǎng)，穿刺線周圍的培育基明晰，那么細(xì)菌沒有動(dòng)力即無鞭毛；假設(shè)細(xì)菌沿穿刺線向周圍分散生長(zhǎng)，穿刺線周圍的培育基呈云霧狀混濁，闡明細(xì)菌有動(dòng)力即有鞭毛。結(jié)合革蘭氏染色結(jié)果、SS平板的培育結(jié)果、雙糖鐵培育結(jié)果、半固體培育結(jié)果作出初步診斷。3. 血清學(xué)鑒定玻片凝集實(shí)驗(yàn)鑒定菌種目的 察看細(xì)菌在玻片上與其相應(yīng)抗體結(jié)合所出現(xiàn)的細(xì)菌凝集景象，了解抗原抗體反響的特異性。原理 將知細(xì)菌抗體與待測(cè)細(xì)菌混合，假設(shè)抗原與抗體相對(duì)應(yīng)，那么引起細(xì)菌凝集，反之那

45、么不凝集，據(jù)其凝集景象可判別細(xì)菌種類。資料 1、 1：20痢疾桿菌免疫血清，1：20傷寒桿菌免疫血清。 2、 待檢菌培育物。 3、 生理鹽水、玻片、記號(hào)筆、接種環(huán)、酒精燈、消毒缸等。方法 1、 取干凈玻片1張，用記號(hào)筆劃分三等份，如以下圖所示：2、 用接種環(huán)分別取生理鹽水、1：20傷寒桿菌免疫血清、1：20痢疾桿菌免疫血清各3-4環(huán)按圖示位置放在玻片上，留意在換取另一種血清時(shí)要燒灼接種環(huán)，以免混淆血清產(chǎn)生錯(cuò)誤結(jié)果。3、 用接種環(huán)挑取少量待檢菌參與玻片的生理鹽水中，充分混勻，再挑取少量待檢菌加人1:20傷寒免疫血清中混勻，同法挑取待檢菌參與1：20痢疾桿菌免疫血清中，混勻。留意無菌操作。4、 輕

46、搖動(dòng)玻片，12分鐘后察看NS 傷寒桿菌免疫血清 痢疾桿菌免疫血清+ + +待檢菌 待檢菌 待檢菌結(jié)果察看陽性：液體變清，并有乳白色凝集塊出現(xiàn)。陰性：液體依然混濁，無凝集塊出現(xiàn)。 -+陰性陽性記錄結(jié)果之后，將玻片放入含消毒液的指定容器內(nèi)，切勿恣意放置或沖洗。留意 取細(xì)菌培育物時(shí)不宜過多，與免疫血清混合時(shí)，必需將細(xì)菌涂散、涂均勻，但不宜將面積涂得過大，以免很快干涸而影響結(jié)果察看。4. 細(xì)菌代謝產(chǎn)物的察看察看細(xì)菌在培育基中的生長(zhǎng)情況，參照前表腸道桿菌生物學(xué)性狀分析并作出初步鑒定，按照此結(jié)果，再用其他生化反響來作最后鑒定。1單糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)：原理：各種細(xì)菌含有不同的糖醇分解酶，分解糖醇的才干不同，代謝產(chǎn)物

47、也不同，有的產(chǎn)酸、有的尚有氣體構(gòu)成。因此可協(xié)助鑒別細(xì)菌，尤其是腸道細(xì)菌；單糖發(fā)酵管的制備：將1.6%的溴甲酚紫水溶液1ml參與PH7.6的蛋白胨水1000ml中搖勻。每200ml為一份，分裝到已標(biāo)好葡、乳、麥、甘、蔗等字樣的五個(gè)錐形瓶中。在五瓶液體中分別參與五種糖，糖的最終濃度為1%。將五種糖培育基分別裝入已備有小倒管的試管中，每管約34ml。經(jīng)68.95kPa高壓滅菌15分鐘后備用。方法與結(jié)果：用滅菌接種環(huán)分別取大腸桿菌和傷寒桿菌少許，分別接種于五種糖發(fā)酵管，經(jīng)37培育1824小時(shí)，察看結(jié)果；.糖不分解，指示劑仍為紫色，記錄方式；.糖分解產(chǎn)酸不產(chǎn)氣指示劑變黃，小倒管中無氣泡，記錄方式+；.

48、糖分解產(chǎn)酸且產(chǎn)氣指示劑變黃，小倒管中有氣泡，記錄方式 + 氣泡 黃色單糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)2靛基質(zhì)吲哚實(shí)驗(yàn)：原理：各種細(xì)菌分解氨基酸的才干不同，借此可鑒別菌種。有些細(xì)菌如大腸桿菌、變形桿菌等具有色氨酸分解酶，可分解蛋白胨中的色氨酸生成無色的吲哚即靛基質(zhì)，當(dāng)參與靛基質(zhì)試劑對(duì)二甲基氨基苯甲醛，構(gòu)成玫瑰色吲哚，可用肉眼察看。蛋白胨水培育基的制備：將蛋白胨1g、NaCl0.5g參與蒸餾水100ml，調(diào)pH值為7.6，分裝試管，每管約34ml。經(jīng)68.95kPa高壓滅菌15分鐘后備用。 方法與結(jié)果：用滅菌接種環(huán)分別取大腸桿菌、傷寒桿菌少許接種于蛋白胨水培育基中，經(jīng)37培育2448小時(shí)。取出培育物后，參與23滴乙醚

49、，混勻靜置使無色吲哚和乙醚一并上升至液體外表，再沿管壁參與23滴靛基質(zhì)試劑于培育物外表，在兩者接觸面上呈玫瑰紅色為陽性，黃色為陰性。3硫化氫實(shí)驗(yàn)： 原理：有些細(xì)菌如變形桿菌、副乙型傷寒桿菌等能分解含硫氨基酸胱氨酸等生成硫化氫，如培育基中含有鉛鹽如醋酸鉛或者鐵鹽如硫酸亞鐵，硫化氫可與之結(jié)合生成黑褐色的沉淀物。 醋酸鉛培育基的制備：將醋酸鉛0.5g、硫代硫酸鈉0.25g等參與到500ml2%的肉湯瓊脂中，調(diào)PH值為7.47.6, 分裝試管，每管約34ml。經(jīng)68.95kPa高壓滅菌15分鐘后備用。方法與結(jié)果：用滅菌接種針分別取大腸桿菌、變形桿菌少許穿刺接種于醋酸鉛培育基中, 經(jīng)37培育24小時(shí)。沿

50、穿刺線部位呈現(xiàn)黑色為陽性，無黑色出現(xiàn)為陰性。4色素的產(chǎn)生：原理：有些細(xì)菌在代謝過程中，可合成不同顏色的色素，有利于細(xì)菌的鑒定。色素分為兩類：脂溶性色素：僅菌落本身著色，培育基不染上顏色。水溶性色素：色素本身可溶解，浸透到周圍的的培育基中。細(xì)菌的色素，在室溫、有氧、含血清、牛乳等培育基中產(chǎn)生豐富。 方法：察看兩種細(xì)菌的色素，其顏色、特性等。實(shí)驗(yàn)報(bào)告：1記錄上次雙糖鐵培育基、半固體培育基接種的結(jié)果繪圖并分析；2記錄玻片凝集實(shí)驗(yàn)的結(jié)果繪圖并分析；3結(jié)合腸道致病菌的系列檢查結(jié)果作出最后鑒定。4. 記錄細(xì)菌代謝產(chǎn)物的察看結(jié)果繪圖并簡(jiǎn)要分析： 單糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)、硫化氫實(shí)驗(yàn)、吲哚實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)十一 厭氧性細(xì)菌厭氧性

51、細(xì)菌是一大類專性厭氧，必需在無氧的環(huán)境下才干生長(zhǎng)的細(xì)菌。一類是革蘭氏染色陽性有芽胞的厭氧芽胞梭菌；另一類是無芽胞的革蘭氏染色陽性及革蘭氏染色陰性的球菌與桿菌。前者致病菌主要有破傷風(fēng)桿菌、產(chǎn)氣莢膜桿菌、肉毒桿菌等；后者臨床上以革蘭氏陰性桿菌多見，尤其是脆弱類桿菌。實(shí)驗(yàn)?zāi)康模赫莆掌苽L(fēng)桿菌、產(chǎn)氣莢膜桿菌的形狀特點(diǎn)。熟習(xí)重要的厭氧菌的培育特性。了解常用的厭氧培育方法。實(shí)驗(yàn)資料：1破傷風(fēng)桿菌、產(chǎn)氣莢膜桿菌的庖肉培育物。2產(chǎn)氣莢膜桿菌的牛乳培育基培育物。3高層培育基中的破傷風(fēng)桿菌、產(chǎn)氣莢膜桿菌的培育物。破傷風(fēng)桿菌芽胞染色、產(chǎn)氣莢膜桿菌莢膜染色示教片。實(shí)驗(yàn)內(nèi)容：破傷風(fēng)桿菌、產(chǎn)氣莢膜桿菌的形狀特征 1破傷風(fēng)

52、桿菌細(xì)長(zhǎng)桿菌，長(zhǎng)48微米，寬0。30。5微米。有周鞭毛，可運(yùn)動(dòng)。無莢膜，芽胞球形，位于菌體頂端，直徑大于菌體，呈鼓槌或火柴棒狀，為本菌鑒定特征之一。早期芽胞和菌體染色一致，以后芽胞不易著色呈空泡狀。用芽胞染色法菌體染成藍(lán)色，芽胞染成紅色。繁衍體為革蘭氏染色陽性，但37攝氏度48小時(shí)后易變陰性。2產(chǎn)氣莢膜桿菌 兩端鈍圓，長(zhǎng)48微米，寬11.5微米的粗大桿菌。散在或短鏈狀陳列。莢膜染色法可見肥厚莢膜；芽胞呈卵圓形，與菌體等寬，位于中央或次極端。無鞭毛，不運(yùn)動(dòng)，在人體后動(dòng)物體內(nèi)可以構(gòu)成莢膜，自然界中以芽胞方式存在。繁衍體革蘭氏染色陽性。2. 破傷風(fēng)桿菌、產(chǎn)氣莢膜桿菌的庖肉培育物。1破傷風(fēng)桿菌：在庖肉

53、培育基中生長(zhǎng)緩慢，厭氧培育27天后，培育基變混濁，產(chǎn)酸，肉渣部分消化微變黑，有少量氣體。生成的甲基硫醇、H2S等使培育物變臭。2產(chǎn)氣莢膜桿菌：在庖肉培育基中生長(zhǎng)后，肉湯渾濁，肉渣不被消化，變成粉紅色，產(chǎn)生大量氣體，使液面固體石蠟推向上方。3. 產(chǎn)氣莢膜桿菌在牛乳培育基中的生長(zhǎng)景象產(chǎn)氣莢膜桿菌在牛乳培育基中的生長(zhǎng)時(shí)，能分解糖產(chǎn)酸、產(chǎn)氣。產(chǎn)生的酸能把酪蛋白凝固，產(chǎn)生的大量氣體使凝固的酪蛋白呈蜂窩狀，大量氣體構(gòu)成的高壓使酪蛋白和隔絕氧氣的凡士林石蠟沖向試管口，氣勢(shì)洶涌，稱為“洶涌發(fā)酵景象，為本菌的特點(diǎn)之一。3破傷風(fēng)桿菌、產(chǎn)氣莢膜桿菌、肉毒桿菌在高層瓊脂培育基中的生長(zhǎng)景象分別把破傷風(fēng)桿菌、產(chǎn)氣莢膜桿菌

54、參與內(nèi)融化60攝氏度了瓊脂的試管中，冷凝、培育后察看結(jié)果：1破傷風(fēng)桿菌：在高層瓊脂中生長(zhǎng)后，產(chǎn)生少量氣體，瓊脂中下層有少量氣泡。2產(chǎn)氣莢膜桿菌：在高層瓊脂中生長(zhǎng)后，產(chǎn)生大量氣體，沖散凝固的瓊脂，將瓊脂推向試管口。4. 常用厭氧培育方法的引見厭氧培育的方法很多，主要利用氣體交換、復(fù)原劑、催化劑等方法使培育基堅(jiān)持無氧的環(huán)境和復(fù)原的形狀。1庖肉培育基培育法原理：庖肉培育基內(nèi)含肉渣、不飽和脂肪酸、谷胱甘肽等物質(zhì)，外表由凡士林隔絕空氣。其中，不飽和脂肪酸在氧化時(shí)可以耗費(fèi)試管內(nèi)的氧氣，谷胱甘肽作為一種復(fù)原劑可以使培育基中的氧化復(fù)原電勢(shì)降低，有利于厭氧菌的生長(zhǎng)。方法：取置備好的庖肉培育基在火焰上微加熱，使凡

55、士林熔化，在無菌條件下將厭氧菌接種，終了后再微加熱，最后將培育基直立于試管架上，使凡士林密封后，在37溫箱中培育。2焦性沒食子酸法原理：焦性沒食子酸與堿性溶液能迅速大量的吸收氧氣，生成棕色的焦性沒食子，它可以在任何密閉容器中快速呵斥無氧的環(huán)境。100毫升容器中：1克焦性沒食子酸+2毫升0。5克/毫升碳酸氫鈉方法：平皿法：在血平板上接種好厭氧菌，在皿蓋上鋪好薄紗布，將焦性沒食子酸0，5克置于紗布上，滴1毫升碳酸氫鈉，立刻將接種好的血平板扣在上面，并用熔化的石蠟密封周圍，置37攝氏度溫箱中培育。試管法：將厭氧菌接種于小試管內(nèi)，并在一大試管內(nèi)放入有焦性沒食子酸的玻璃珠，滴入碳酸氫鈉，迅速把小試管放入

56、大試管中去，并用橡膠塞塞緊，石蠟封口，置37攝氏度溫箱中培育。3厭氧罐法原理：厭氧罐是有塑料、有機(jī)玻璃或金屬構(gòu)成的圓描畫器，安裝有壓力表和通氣閥，可以抽換氣體，適宜于厭氧菌的培育。方法：抽氣換氣法：適宜于實(shí)驗(yàn)室運(yùn)用。將接種好細(xì)菌的平板或試管放入?yún)捬豕拗?，同時(shí)放入催化劑鈀和指示劑美蘭。擰緊蓋子，用真空泵抽氣，當(dāng)指針到零時(shí)，灌入高純氮?dú)?，如此反?fù)23次，最后一次參與氫氣和二氧化碳的混合氣體。封鎖，37攝氏度培育。氣袋發(fā)生袋法：適宜于床邊接種和野外厭氧菌培育。除不需真空泵和氣體瓶外，其他設(shè)備與抽氣法一樣。利用兩種藥片：一種是枸櫞酸和小蘇打，另一種是硼氫化鈉。前者遇水釋放二氧化碳，后者遇水釋放氫氣。4

57、厭氧袋法將接種好的平板放入裝有發(fā)生管和美蘭指示劑管的透明不透氣塑料袋內(nèi)，擠出袋內(nèi)空氣，將袋口扎緊，然后折斷發(fā)生管，產(chǎn)生的二氧化碳和氫氣使氣袋膨脹，出現(xiàn)水滴。半小時(shí)后，袋內(nèi)化學(xué)反響完成，袋內(nèi)已無游離氧，此時(shí)折斷美蘭指示劑管，美蘭仍為無色，闡明厭氧環(huán)境構(gòu)成，可以人工厭氧培育。 實(shí)驗(yàn)十二 結(jié)核桿菌結(jié)核桿菌為細(xì)長(zhǎng)分枝桿菌，有分枝生長(zhǎng)趨勢(shì)，不易著色，經(jīng)加溫或延伸時(shí)間后著色。一旦著色后又能抵抗鹽酸酒精的脫色，故又稱為抗酸桿菌。實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?. 掌握結(jié)核桿菌的形狀和染色特點(diǎn)。2. 了解結(jié)核桿菌的培育特性。3. 掌握抗酸染色法的操作和結(jié)果判別。實(shí)驗(yàn)資料：1. 結(jié)核桿菌抗酸染色示教片，結(jié)核桿菌在改良羅氏培育基的培

58、育物，含結(jié)核桿菌的痰液。2試劑：石炭酸復(fù)紅染液、3%鹽酸酒精、堿性美蘭3器具：顯微鏡、載玻片、酒精燈、試管夾、接種環(huán)實(shí)驗(yàn)內(nèi)容：1. 結(jié)核桿菌的形狀和染色特性油鏡下：結(jié)核桿菌為細(xì)長(zhǎng)或略帶彎曲的桿菌，有的呈分枝狀。單個(gè)存在或聚集成團(tuán)。菌體被復(fù)紅染成紅色，其他細(xì)菌及背景物質(zhì)呈藍(lán)色。2. 結(jié)核桿菌的培育特性固體培育基的形狀：結(jié)核桿菌在接種的羅氏培育基上，37攝氏度培育46周，可出現(xiàn)乳白色或米黃色顆粒，外表粗糙，邊緣不整齊，較為枯燥鞏固，形似花菜狀的菌落。液體培育基內(nèi)的生長(zhǎng)情況：結(jié)核桿菌為專性需氧菌，在液體培育基中呈皺襞狀表皮生長(zhǎng)。3. 抗酸染色法1涂抹標(biāo)本的制備在無菌條件下，用接種環(huán)取含有結(jié)核桿菌的少

59、許痰液，均勻涂抹于載玻片上；自然枯燥后；經(jīng)過火焰固定。2抗酸染色初染：將石炭酸復(fù)紅滴于方框中，使標(biāo)本被充分浸潤(rùn)，置于酒精燈火焰上方7、8厘米處，悄然加熱，當(dāng)有水蒸氣冒出時(shí)，可再加少許石炭酸復(fù)紅，防止干涸，但也不能沸煮，如此加熱繼續(xù)5分鐘。冷卻后用水沖洗，甩干。脫色：用3%的鹽酸酒精數(shù)滴浸潤(rùn)脫色，直至涂片無紅色染液脫下為止。繼續(xù)0.5分鐘左右。然后用水悄然沖洗，甩干。復(fù)染：加美蘭12滴，染色1分鐘，水洗，甩干，吸干。油鏡察看：結(jié)果見上節(jié)形狀描畫。附：改良羅氏培育基：磷酸二氫鉀1.2g，硫酸鎂0.12g，枸櫞酸鎂0.3g，天門冬素1.8g味精3.6g，甘油6ml，溶于300ml蒸餾水中。再參與馬鈴薯淀粉15g，沸水內(nèi)加熱，邊熱邊攪拌成糊狀。無菌操作將卵白、卵黃一同打成全卵液，取500ml參與。最后加2%孔雀綠溶液10ml，充分混合。分裝于滅菌的中試管內(nèi)，8560分鐘間歇滅菌2次。實(shí)驗(yàn)報(bào)告：繪破傷風(fēng)桿菌、產(chǎn)氣莢膜桿菌形狀圖，并注明染色性和放大倍數(shù)。記錄抗酸染色的步驟和繪染色結(jié)果圖，注明染色性和放大倍數(shù)。實(shí)驗(yàn)十三