肝素原應(yīng)用研究進(jìn)展

1、肝素原應(yīng)用研究進(jìn)展陳祥娥（濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院生物科學(xué)學(xué)院，山東 日照 276826）摘 要：肝素原（heparosan）是某些細(xì)菌莢膜中多糖骨架的二糖重復(fù)單位，同時(shí)也是肝素和硫酸乙酰肝素的生物合成前體。以發(fā)酵獲得的肝素原為前體骨架多糖，采用化學(xué)或生物修飾生產(chǎn)肝素及其類(lèi)似物是目前非動(dòng)物來(lái)源肝素生產(chǎn)的研究熱點(diǎn)。近來(lái)發(fā)現(xiàn)，肝素原還可作為良好的藥物載體，具有調(diào)節(jié)腸道菌群等作用，本文對(duì)其應(yīng)用研究作一綜述。關(guān)鍵詞：肝素前體；肝素；藥物載體；腸道菌群 中圖分類(lèi)號(hào)： 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： 文章編號(hào)：Progress on application of heparosan CHEN Xiang-e(School of Biol

2、ogical Sciences, Jining Medical University, Rizhao 276826, China)Abstract: Heparosan is the polysaccharide found in the capsule of certain bacteria, as well as the biosynthesis precursor of heparin or heparan sulfate in animals. Now, research mainly focused on the chemical or biological modification

3、s of heparosan that obtained by fermentation as a kind of non-animal origin production of heparin. It has been recently found that heparosan can serve as good drug carrier, regulate the intestinal flora and so on. This article reviews the latest progress of its application.Keywords: Heparosan; Hepar

4、in; Drug carrier; Intestinal flora肝素原（heparosan，又稱(chēng)N-acetylheparosan），（-4-D-GlcA-1,4-D- GlcNAc-1）n （其中GlcA代表葡糖醛酸；GlcNAc代表乙酰氨基葡糖）1，是某些細(xì)菌莢膜中多糖骨架的二糖重復(fù)單位，同時(shí)也是肝素和硫酸乙酰肝素（heparan sulfate，HS）的生物合成前體。細(xì)菌莢膜肝素原的發(fā)現(xiàn)，引起了廣泛關(guān)注。因?yàn)樗雇ㄟ^(guò)細(xì)菌合成，化學(xué)或生物修飾生產(chǎn)肝素、HS成為可能。肝素原二糖骨架結(jié)構(gòu)與脊椎動(dòng)物中的肝素類(lèi)似，但未硫酸化，也沒(méi)有將GlcA異構(gòu)化為艾杜糖醛酸（IdoA）2。已發(fā)現(xiàn)的可以生產(chǎn)肝

5、素原的細(xì)菌有大腸桿菌K5 (Escherichia coli K5)，多殺性巴氏桿菌D型 (Pasteurella multocida type D)以及副雞禽桿菌基因型II （Avibacterium paragallinarum genetype II）3種3-5。肝素原可以通過(guò)微生物發(fā)酵提取或重組酶體外合成6。目前，文獻(xiàn)報(bào)道的肝素原發(fā)酵生產(chǎn)多采用E. coli K5。Wang等7采用優(yōu)化培養(yǎng)基，富氧給予并指數(shù)補(bǔ)加葡萄糖，在7 L發(fā)酵罐中培養(yǎng)E. coli K5菌株制備肝素原，產(chǎn)量可達(dá)15 g/L，相對(duì)分子質(zhì)量為5.8104，重均分子質(zhì)量為8.4104。目前，肝素原的研究熱點(diǎn)集中于以其作為

6、前體骨架修飾合成肝素、HS及其類(lèi)似物8。近來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，肝素原還可作為良好的藥物載體、具有調(diào)節(jié)腸道菌群等作用9-10。 肝素類(lèi)生物合成前體肝素被發(fā)現(xiàn)已即將100年，作為抗凝血和抗血栓藥物廣為應(yīng)用。2008年，曾因雜質(zhì)過(guò)量引起嚴(yán)重的過(guò)敏反應(yīng)甚至死亡。動(dòng)物源性肝素的質(zhì)量成為廣泛關(guān)注的焦點(diǎn)，同時(shí)也引發(fā)了對(duì)非動(dòng)物來(lái)源肝素大規(guī)模生產(chǎn)的需求11。脊椎動(dòng)物合成肝素或HS的過(guò)程是先催化合成肝素原作為前體聚合物，然后在一系列酶的作用下進(jìn)行硫酸化及異構(gòu)化修飾，生成的高度N-, O-硫酸化，IdoA含量較高的多糖鏈為肝素，而部分修飾后生成的O-硫酸化程度較低，GlcNAc、GlcA含量較高的多糖鏈為HS12。目前，商

7、品化肝素主要從豬腸黏膜或牛肺中提取，以細(xì)菌發(fā)酵獲得的肝素原為前體，經(jīng)化學(xué)或生物修飾生產(chǎn)肝素是一種較有希望的替代方法13-15。1.1 合成途徑以肝素原作為前體多糖，首先采用化學(xué)方法或在N-去乙酰化酶/ N-磺基轉(zhuǎn)移酶（N-deacetylase/N-sulfatransferase, NDST）的作用下獲得N-去乙?；? N-硫酸化的肝素原，在C5-異構(gòu)化酶（C-5 epimerase, C5-epi）作用下將大部分GlcA異構(gòu)化為IdoA后，經(jīng)2-O-磺基轉(zhuǎn)移酶（2-O-sulfotransferase, 2-OST）、6-OST和3-OST的依次作用，在IdoA的C2位，GlcA的C3和C

8、6位進(jìn)行硫酸化修飾，即可獲得具有抗凝血活性的肝素或HS16-20。部分修飾可生成N-硫酸化肝素原（NSH）、O-硫酸化肝素原（OSH）、N,O-硫酸化肝素原（NOSH）、差向異構(gòu)化N,O-硫酸化肝素原（Epi-NOSH）等一系列衍生物。采用肝素原作為前體還可修飾獲得低分子肝素類(lèi)產(chǎn)品，如Arixtra21。Bhaskar等22研究開(kāi)發(fā)了一鍋燴化學(xué)酶法合成肝素的制備工藝。構(gòu)建可表達(dá)C5-epi、2-OST、6-OST-1、6-OST-3、3-OST-1和芳基磺基轉(zhuǎn)移酶IV（AST IV）融合蛋白的E. coli，發(fā)酵培養(yǎng)獲得重組酶。具體制備工藝是先化學(xué)修飾肝素原獲得NSH作為底物。在緩沖體系中加入

9、3-磷酸腺苷5-磷酰硫酸（PAPS）作為硫酸基供體，在重組酶的作用下，37 孵育過(guò)夜即可獲得具有抗凝血活性的全長(zhǎng)或寡聚肝素/HS。本工藝主要通過(guò)對(duì)酶與底物比的控制實(shí)現(xiàn)酶活性的調(diào)節(jié)，適于進(jìn)行肝素結(jié)構(gòu)異質(zhì)性及其對(duì)構(gòu)效關(guān)系影響的高通量篩選研究。1.2 生物活性以肝素原為起始物，修飾生成的多種肝素類(lèi)衍生物表現(xiàn)出多種與肝素類(lèi)似的生物活性，主要有抗凝血、抗炎、抗癌、抗病毒和誘導(dǎo)干細(xì)胞分化等23-25。已報(bào)道的由肝素原修飾獲得的衍生物的基本結(jié)構(gòu)及活性見(jiàn)表1。表1 肝素原衍生物的基本結(jié)構(gòu)及活性衍生物基本結(jié)構(gòu)活性Sulfaminoheparosan (SAH, NSH)-GlcA-GlcNS-抗凝Epi- NO

10、SH-GlcA3S(or H)6S-GlcNS6S-IdoA2S-GlcNS6S抗炎抗病毒OSH(H)-GlcA2S3S-GlcNAc3S6S-抗炎抗癌抗病毒NOSH(L)-GlcA-GlcNS6S- 抗癌抗病毒誘導(dǎo)分化NOSH(H)-GlcA2S3S-GlcNS6S-抗癌抗病毒Epi- OSH(L)-GlcA-GlcNS6S-IdoA2SGlcNS6S抗病毒Epi- OSH(H)-GlcA2S3S-GlcNS6S-IdoA2SGlcNS6S抗病毒Neoheparin-IdoA2S-GlcNS6S-GlcAGlcNS3S6S-IdoA2SGlcNS3S6S-GlcA3S-GlcNS6S抗凝抗血

11、栓注：L. 低度硫酸化；H. 高度硫酸化肝素原硫酸化衍生物的藥理作用與肝素類(lèi)似，部分明顯優(yōu)于肝素，如OSH、NOSH的抗病毒活性，且不引發(fā)出血等副作用23。隨著人們對(duì)肝素結(jié)構(gòu)和功能之間關(guān)系的不斷認(rèn)識(shí)和研究，可以有選擇性的對(duì)肝素原進(jìn)行修飾，獲得具有特定功能的衍生物，以更好地適用于不同的治療需求。藥物載體肝素原作為肝素和HS的生物合成前體，具有良好的生物相容性，生物可降解性、低毒性和易于化學(xué)修飾的特點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)，肝素原具有細(xì)胞內(nèi)化作用，可逃避調(diào)理素作用，具有適宜的血漿循環(huán)半衰期，不具有免疫原性，可作為良好的藥物載體改進(jìn)藥物的藥代動(dòng)力學(xué)特性，提高性能26-27?；诟嗡卦募{米載體可以實(shí)現(xiàn)藥物的胞內(nèi)

12、傳遞，細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn)表明，其內(nèi)吞途徑包括網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用和巨胞飲。Chen等28采用基于肝素原和去氧膽酸共軛作為藥物載體制備的新型膠束，可以抵抗血清吸附，表現(xiàn)出良好的穩(wěn)定性。熒光實(shí)驗(yàn)證實(shí)，這種膠束能夠有效地將模型疏水性藥物阿霉素靶向運(yùn)送到Hela細(xì)胞。此膠束為pH敏感型，在pH 5.0的酸性條件下阿霉素的釋放速率遠(yuǎn)高于生理pH 7.4時(shí)的釋放速率，在過(guò)表達(dá)-葡糖醛酸酶的腫瘤組織中也可加速釋放，增強(qiáng)治療效果，具有良好的臨床應(yīng)用潛能。作為荷負(fù)電的糖胺聚糖家族一員，肝素原有望成為新一代藥物載體29。調(diào)節(jié)腸道菌群研究表明，肝素和HS具有廣譜抗感染作用。越來(lái)越多不同種類(lèi)的傳染性微生物對(duì)宿主的黏附、胞

13、內(nèi)化或在體內(nèi)的轉(zhuǎn)移已證實(shí)可被肝素或HS降低。但肝素靜脈注射治療潰瘍性結(jié)腸炎的臨床試驗(yàn)結(jié)果并不理想，部分病人甚至出現(xiàn)了嚴(yán)重的直腸出血反應(yīng)30。 體外研究發(fā)現(xiàn)，肝素原可顯著抑制腸致病性大腸桿菌、金黃色葡萄球菌等常見(jiàn)腸道致病菌對(duì)腸道上皮細(xì)胞和黏液層的黏附，對(duì)鼠李糖乳酸桿菌等益生菌的黏附則無(wú)明顯影響，可協(xié)同增強(qiáng)益生菌的黏附競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)，表現(xiàn)出與肝素類(lèi)似的作用效果10。大鼠體內(nèi)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，肝素原可調(diào)節(jié)體內(nèi)腸道菌群組成，增加和維持Lactobacillus taiwanensis和Lactobacillus gallinarum等乳酸桿菌屬益生菌的相對(duì)數(shù)量及優(yōu)勢(shì)，有利于維持健康腸道菌群，有效預(yù)防外源性致病菌感染

14、，減少腸道疾病的發(fā)生，且與肝素之間并無(wú)顯著性差異31。肝素原具有與肝素類(lèi)似骨架結(jié)構(gòu)，可發(fā)酵生產(chǎn)，有開(kāi)發(fā)為腸道菌群調(diào)節(jié)劑的潛能，且不引發(fā)出血等副作用，在臨床應(yīng)用方面比肝素更有優(yōu)勢(shì)。4 其他Munoz等32將生物素酰化的肝素原固定在傳感器芯片上，用參與肝素生物合成的酶選擇性修飾獲得與肝素具有相似結(jié)構(gòu)的多糖，通過(guò)表面等離子體共振檢測(cè)確定這些多糖與抗凝血酶的相互作用，進(jìn)行肝素-蛋白質(zhì)相互作用的高通量篩選，并可提供參與結(jié)合的關(guān)鍵硫酸化基團(tuán)的結(jié)構(gòu)信息。展望肝素原作為肝素和HS的生物合成前體，具有良好的生物相容性，生物可降解性和易于化學(xué)修飾的特點(diǎn)。細(xì)菌莢膜肝素原的發(fā)現(xiàn)，為我們提供了一條通過(guò)發(fā)酵工程獲得肝素原

15、的途徑，使以肝素原為前體，化學(xué)或酶法修飾生產(chǎn)肝素成為可能，并獲得了一些具有特殊生物活性的衍生物。肝素原還具有開(kāi)發(fā)為新一代藥物載體及腸道菌群調(diào)節(jié)劑的良好潛能。隨著研究的深入和不斷開(kāi)展，肝素原在生化藥物開(kāi)發(fā)和功能材料等方面的應(yīng)用將更為廣泛。參考文獻(xiàn)：1 陳祥娥, 凌沛學(xué), 張?zhí)烀? 關(guān)于heparosan中文譯名的建議J. 中國(guó)科技術(shù)語(yǔ), 2014, 16(4): 33-34.2 陳祥娥, 凌沛學(xué), 張?zhí)烀? 細(xì)菌肝素前體（heparosan）合酶J. 中國(guó)生化藥物雜志, 2008, 29(6): 422-424.3 Hickey A M, Bhaskar U, Linhardt R J, et

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