2022醫(yī)學(xué)課件大腸埃希氏菌重點(diǎn)

1、大腸埃希氏菌藥典法生化檢查潘慶玲第一頁，共二十七頁。大腸埃希菌檢查大腸埃希菌Escherichia coil即大腸桿菌，為腸桿菌科埃希菌屬的模式種。大腸埃希菌是人和溫血動物腸道內(nèi)的棲居菌，隨糞便排出體外。在藥品中檢出大腸埃希菌，說明該樣品受到人和溫血動物糞便的污染，即可能是污染腸道病原體。大腸埃希菌除普通大腸埃希菌外，還有致病性大腸埃希菌，可引起嬰幼兒、成人爆發(fā)性腹瀉。為了保證人體健康，口服給藥制劑必須檢查大腸埃希菌。第二頁，共二十七頁。標(biāo)準(zhǔn)?中國藥典?2022年版二部口服給藥制劑細(xì)菌總數(shù)每1ml不得過100cfu霉菌和酵母菌總數(shù)每1ml不得過100cfu大腸埃希菌總數(shù)不得檢出第三頁，共二十七

2、頁。備料單增菌培養(yǎng)序號品名規(guī)格數(shù)量備注1錐形瓶250ml42刻度吸管10ml23刻度吸管1ml14燒杯250ml15量筒100ml16膽鹽乳糖培養(yǎng)基100ml3裝錐形瓶7pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液150ml1裝錐形瓶滅菌參數(shù)：121、20min第四頁，共二十七頁。操作過程樣品10ml90ml供試液稀釋液陰樣陽10ml10ml10ml菌懸液1mlBL培養(yǎng)基BL培養(yǎng)基BL培養(yǎng)基培養(yǎng)溫度：36培養(yǎng)時間：1824h必要時可延長至48h第五頁，共二十七頁。備料單快速生化試驗序號品名規(guī)格數(shù)量備注1刻度吸管1ml32試管中43MUG培養(yǎng)基5ml4分裝到試管中4靛基質(zhì)滅菌參數(shù)：115、20min第六頁

3、，共二十七頁。操作過程陰樣陽陰樣陽本底靛基質(zhì)試驗紫外熒光0.2ml0.2ml0.2ml培養(yǎng)溫度：361培養(yǎng)時間：1824h第七頁，共二十七頁。備料單別離培養(yǎng)序號品名規(guī)格數(shù)量備注1EMB或麥康凱瓊脂培養(yǎng)基60ml1置皿2平皿3滅菌參數(shù)：121、15min第八頁，共二十七頁。操作過程陰樣陽EMB或麥康凱瓊脂培養(yǎng)基接種環(huán)（四區(qū)劃線法）培養(yǎng)溫度：361培養(yǎng)時間：1824h第九頁，共二十七頁。生化試驗中MUG在紫外等下顯熒光的原理大腸埃希氏菌是指能產(chǎn)生-半乳糖苷酶分解ONPG使培養(yǎng)液呈黃色，能產(chǎn)生-葡萄糖醛酸酶分解MUG使培養(yǎng)液在波長366nm紫外光下 產(chǎn)生熒光的細(xì)菌。第十頁，共二十七頁。BL培養(yǎng)基配方

4、每升：胨20.0g 提供碳氮源 乳糖5.0g 可發(fā)酵的糖類 氯化鈉5.0g 維持均衡的滲透壓 磷酸氫二鉀4.0g 緩沖劑磷酸二氫鉀1.3g去氧膽酸鈉/牛膽鹽0.5g/2.0g 選擇性抑菌劑 第十一頁，共二十七頁。使用方法1、稱取本品35.8g，參加蒸餾水或去離子水1L，攪拌加熱煮沸至完全溶解，分裝三角瓶，每瓶100mL，121滅菌20min，待冷至常溫后，備用。2、樣品的處理。略。3、取膽鹽乳糖增菌液3份，2份分別參加規(guī)定量的供試液，其中一份參加對照菌50100個作陽性對照，第三份參加與供試液等量的稀釋液作陰性對照。4、將三角瓶放入3035恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)1824h。必要時可延長至48h。5、

5、觀察結(jié)果。陽性對照應(yīng)生長良好，陰性對照應(yīng)無菌生長。質(zhì)量控制：本品質(zhì)控菌株接種后，于361培養(yǎng)1824h，培養(yǎng)結(jié)果肉湯呈混濁。第十二頁，共二十七頁。MUG培養(yǎng)基配方每升：胰蛋白胨20.0g 提供碳氮源 3號膽鹽1.5g 抑制革蘭氏陽性菌 乳糖5.0g 可發(fā)酵的糖類 磷酸氫二鉀4.0g 緩沖劑 磷酸二氫鉀1.5g氯化鈉5.0g 維持均衡的滲透壓 MUG0.05g第十三頁，共二十七頁。使用方法1、稱取本品37.05g，參加蒸餾水或去離子水1L，攪拌加熱煮沸至完全溶解，分裝于帶有小倒管的試管中，115高壓滅菌20min，待冷至常溫，備用。2、將總大腸菌群多管發(fā)酵法初發(fā)酵產(chǎn)酸或產(chǎn)氣的管進(jìn)行大腸埃希氏菌檢

6、測。用燒灼滅菌的金屬接種環(huán)或無菌棉簽將上述試管中液體接種到EC-MUG肉湯管中。3、將已接種的EC-MUG管在培養(yǎng)箱或恒溫水浴中44.50.5培養(yǎng)24h2h。如使用恒溫水浴，在接種30min內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，水浴箱的液面應(yīng)高于EC-MUG肉湯液面。4、觀察結(jié)果：將培養(yǎng)基管置366nm紫外燈下約5cm處，以未接種培養(yǎng)物的EC-MUG培養(yǎng)基作空白對照，觀察有無藍(lán)白色熒光。空白對照管應(yīng)無藍(lán)白色熒光，試驗管出現(xiàn)藍(lán)白色熒光為陽性反響。 質(zhì)量控制：大腸埃希菌菌株接種后于361培養(yǎng)1824h，結(jié)果產(chǎn)氣，紫外燈下顯熒光。 第十四頁，共二十七頁。EMB瓊脂培養(yǎng)基配方每升：胨10.0g 提供氮源、維生素、氨牛肉浸出粉3

7、.0g 基酸和碳源 氯化鈉5.0g 維持均衡的滲透壓 乳糖10.0g 可發(fā)酵的糖類 瓊脂14.0g 培養(yǎng)基凝固劑 曙紅鈉0.4g 抑菌劑革蘭氏陽性菌亞甲藍(lán)0.065g pH指示劑在酸性條件下產(chǎn)生沉淀，形成紫黑色菌落或具黑色中心的外圍無色透明的菌落。第十五頁，共二十七頁。使用方法1、稱取本品42.5g，參加蒸餾水或去離子水1L，攪拌加熱煮沸至完全溶解，分裝三角瓶，121高壓滅菌15min。2、待培養(yǎng)基冷至50左右，以無菌手續(xù)，傾注滅菌平皿，待凝固后，備用。3、將供試液劃線接種于平板上。4、將平板翻轉(zhuǎn)，放入恒溫培養(yǎng)箱中，3035培養(yǎng)1824h。5、觀察結(jié)果。質(zhì)量控制：本培養(yǎng)基傾注平皿待冷卻后呈紫色

8、，可有細(xì)微沉淀。大腸埃希菌菌株接種后。361培養(yǎng)1824h， 培養(yǎng)結(jié)果呈黑心，有綠色金屬光澤。第十六頁，共二十七頁。麥康凱瓊脂培養(yǎng)基配方每升胨 20.0g 碳氮源、維生素和生長因子 牛膽鹽 5.0g 抑制革蘭氏陽性菌的生長 氯化鈉5.0g 維持均衡的滲透壓 瓊脂 14.0g 培養(yǎng)基的凝固劑 乳糖 10.0g 可發(fā)酵的糖類 中性紅 0.03g pH指示劑 細(xì)菌發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸時菌落呈粉紅色并在菌落周圍出現(xiàn)膽鹽沉淀的渾濁圈。第十七頁，共二十七頁。使用方法1、稱取本品54.0g，參加蒸餾水或去離子水1L，攪拌加熱煮沸至完全溶解，分裝三角瓶，121高壓滅菌15min。2、待培養(yǎng)基冷至5055傾注滅菌平皿，

9、待凝固后，備用。3、取待檢樣品劃線接種于麥康凱平板。4、將平板置培養(yǎng)箱于3035培養(yǎng)1824h。5、觀察結(jié)果。在做致瀉大腸埃希氏菌檢驗時，觀察結(jié)果不但要注意乳糖發(fā)酵的菌落，同時也要注意不發(fā)酵和緩慢發(fā)酵的菌落。 質(zhì)量控制：大腸埃希菌菌株經(jīng)361培養(yǎng)1824h菌落特征呈粉紅或紅，周圍有混濁膽鹽沉淀圈。第十八頁，共二十七頁。IMViC用來測定菌的生理生化特征的4個實(shí)驗.I:吲哚試驗 M:甲基紅試驗 V:V.P試驗 C:檸檬酸實(shí)驗 i是為個好讀加上去的 第十九頁，共二十七頁。吲哚indole實(shí)驗原理：有些細(xì)菌如大腸埃希菌、變形桿菌、霍亂弧菌等能分解培養(yǎng)基中的色氨酸生成吲哚靛基質(zhì)，經(jīng)與試劑中的對二甲基氨

10、基苯甲醛作用，生成玫瑰吲哚而呈紅色，是為吲哚試驗陽性。試驗菌用蛋白胨水培養(yǎng)基37培養(yǎng)24小時.在培養(yǎng)液中參加乙醚1ml(使呈明顯的乙醚層)充分振蕩,使吲哚試劑溶于乙醚.靜置片刻,待乙醚浮于培養(yǎng)液上面時沿管壁慢慢參加吲哚試劑10滴.呈玫瑰紅的為陽性,不變色的為陰.(注:參加吲哚試劑后,不可再搖動,否那么紅色不明顯)第二十頁，共二十七頁。甲基紅試驗M:甲基紅試驗為腸道細(xì)菌的IMViC四類測試中的M，甲基紅為一種酸性指示劑，根據(jù)腸道細(xì)菌的糖代謝途徑的不同，最終產(chǎn)生酸性產(chǎn)物不一，PH值有所差異，導(dǎo)致甲基紅顯示出不同的顏色，從而用于鑒別腸道細(xì)菌。呈現(xiàn)紅色為陽性；橘紅色為弱陽性；黃色為陰性。試驗菌用葡萄糖

11、蛋白胨培養(yǎng)基37培養(yǎng)24小時.沿管壁參加M.R.(甲基紅)試劑3-4滴.紅的為陽性,黃的為陰性.第二十一頁，共二十七頁。甲基紅試驗原理:某些細(xì)菌在糖代謝過程中，分解葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸，丙酮酸可進(jìn)一步分解，產(chǎn)生甲酸、乙酸、乳酸等，使培養(yǎng)基的pH降至4.5以下，當(dāng)參加甲基紅試劑那么呈紅色，為甲基紅試驗陽性。假設(shè)細(xì)菌分解葡萄糖產(chǎn)酸量少，或產(chǎn)生的酸進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為其他物質(zhì)如醇、酮、醚、氣體和水等，那么培養(yǎng)基的酸度仍在pH6.2以上，故參加甲基紅指示劑呈黃色，是為陰性。第二十二頁，共二十七頁。V.P試驗乙酰甲基甲醇試驗 某些細(xì)菌在葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)液中能分解葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸，丙酮酸縮合，脫羧成乙酰甲基甲醇，后

12、者在強(qiáng)堿環(huán)境下，被空氣中氧，氧化為二乙酰，二乙酰與蛋白胨中的胍基生成紅色化合物，稱VP+反響。試驗菌用葡萄糖蛋白胨培養(yǎng)基37培養(yǎng)24小時.參加40%KOH 10-20滴,再參加等量-茶酚,用力振蕩(拔去棉塞)再放入374h后再觀察,仍無色產(chǎn)生為陰.第二十三頁，共二十七頁。檸檬酸實(shí)驗 檸檬酸鹽培養(yǎng)基系一綜合性培養(yǎng)基，其中檸檬酸鈉為碳的唯一來源。而磷酸二氫銨是氮的唯一來源。有的細(xì)菌如產(chǎn)氣桿菌，能利用檸檬酸鈉為碳源，因此能在檸檬酸鹽培養(yǎng)基上生長，并分解檸檬酸鹽后產(chǎn)生碳酸鹽，使培養(yǎng)基變?yōu)閴A性。此時培養(yǎng)基中的溴麝香草酚藍(lán)指示劑由綠色變?yōu)樯钏{(lán)色。不能利用檸檬酸鹽為碳源的細(xì)菌，在該培養(yǎng)基上不生長，培養(yǎng)基不變色。 將試驗菌培養(yǎng)在檸檬酸鹽培養(yǎng)基斜面上37培養(yǎng)24-28小時.觀察有無細(xì)菌生長與培養(yǎng)基顏色變化.如果含有溴麝香草酚藍(lán)的斜面藍(lán)色者為陽性反響,呈綠色的為陰性反響;含苯酚紅的斜面如果呈紅色為陽性反響,呈黃色為陰性反響.第二十四頁，共二十七頁。IMViC的作用這4個試驗主要是用來快速鑒別大腸桿菌和產(chǎn)氣腸桿菌，多用于水的細(xì)菌檢查。大腸桿菌雖非致病菌，但在飲用水中如超過一定數(shù)量，那么表示水質(zhì)受糞便污染。產(chǎn)氣腸桿菌也廣泛存在于自然界中，因此檢查水時，要將兩者分開。第二十五頁，共二十七頁。謝謝！第二十六頁，共二十七頁。內(nèi)容總結(jié)大腸埃希氏菌藥典法生