核酸轉(zhuǎn)膜、探針標記、-課件

1、實驗 八、九核酸轉(zhuǎn)膜、探針標記、分子雜交實驗目的學習核酸雜交技術的相關知識及其重要性，掌握點雜交的轉(zhuǎn)膜方法、探針的標記以及分子雜交操作過程。相關知識核酸雜交技術根本上是從Hall等1961年的工作開始的，探針與靶序列在溶液中雜交，通過平衡密度梯度離心別離雜交體。該法很慢、費力且不精確，但它開拓了核酸雜交技術的研究。60年代中期Nygaard 等的研究為應用標記DNA或RNA探針檢測固定在硝酸纖維素NC膜上的DNA序列奠定了根底。70年代末期到80年代早期，分子生物學技術有了突破性進展，限制性內(nèi)切酶的開展和應用使分子克隆成為可能。各種載體系統(tǒng)的誕生，尤其是質(zhì)粒和噬菌體DAN載體的構(gòu)建，使特異性D

2、NA探針的來源變得十分豐富。人們可以從基因組DNA文庫和cDNA文庫中獲得特定基因克隆，只需培養(yǎng)細菌，便可提取大量的探針DNA。由于固相化學技術和核酸自動合成儀的誕生，現(xiàn)在可常規(guī)制備18100個堿基的寡核苷酸探針。應用限制酶和Southern印跡技術，用數(shù)微克DNA就可分析特異基因。特異DNA或RNA序列的量和大小均可用Southern印跡和Northern印跡來測定，與以前的技術相比，大大提高了雜交水平和可信度。目前核酸雜交技術與其它技術相結(jié)合廣泛應用于特定基因的表達、基因定位、遺傳病的檢測、組織病理學的研究、生物分類方面。是指將核酸分子固定在纖維膜上的過程。將核酸從電泳后的凝膠中轉(zhuǎn)移到膜上

3、或直接將核酸點到膜上。是核酸雜交過程中的主要步驟之一。轉(zhuǎn)膜探針的標記探針的標記方法：缺口平移、DNA快速末端標記、用T4多核苷酸激酶標記DNA 5末端、隨機引物延伸、聚合酶鏈反響。核酸探針的種類：DNA探針、cDNA探針、RNA探針、寡核酸探針。在選擇標記方法時，應考慮實驗的要求，如靈敏度和顯示方法等。一般認為放射性探針比非放射性探針的靈敏度高。在檢測單拷貝基因序列時，應選用標記效率高、顯示靈敏的探針標記方法。在對靈敏要求不高時，可采用保存時間長的生物素探針技術和比較穩(wěn)定的堿性磷酸酶顯示系統(tǒng)或過氧化物酶系統(tǒng)。雜交的方法：菌落原位雜交Colony in situ hybridization 、點

4、雜交Dot blot、Southern印跡雜交 Southern blot 、Northern印跡雜交Northern blot、組織原位雜交Tissue in situ hybridization等。菌落原位雜交是將細菌從培養(yǎng)平板轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜上，然后將濾膜上的菌落裂菌以釋出DNA。將DNA烘干固定于膜上與32P標記的探針雜交，放射自顯影檢測菌落雜交信號，并與平板上的菌落對位。菌落原位雜交Colony in situ hybridization點雜交法是將被檢測標本點到膜上，烘烤固定。這種方法耗時短，可做半定量分析，一張膜上可同時檢測多個樣品。為使點樣準確方便，市售有多種多管吸印儀ma

5、nifolds，如Minifold I和II、Bio-Dot (BioRad )和HybriDot,它們有許多孔，樣品加到孔中，在負壓下就會流到膜上呈斑點狀或狹縫狀，反復沖洗進樣孔，取出膜烤干或紫外線照射以固定標本，這時的膜就可以進行雜交。點雜交法Dot blotSouthern blot 是研究DNA圖譜的根本技術，在遺傳診斷DNA圖譜分析、特定基因組的分析及PCR產(chǎn)物分析等方面有重要價值。Southern印跡雜交根本方法是將DNA標本用限制性內(nèi)切酶消化后，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳別離各酶解片段，然后經(jīng)堿變性，Tris緩沖液中和，高鹽下通過毛吸作用將DNA從凝膠中轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素濾膜上，烘干固定后即

6、可用于雜交。凝膠中DNA片段的相對位置在DNA片段轉(zhuǎn)移到濾膜的過程中繼續(xù)保持著。附著在濾膜上的DNA與32P標記的探針雜交，利用放射自顯影術確定探針互補的每條DNA帶的位置，從而可以確定在眾多酶解產(chǎn)物中含某一特定序列的DNA片段的位置和大小。Southern印跡雜交 Southern blot這是一種將RNA從瓊脂糖凝膠中轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素膜上的方法。DNA印跡技術由Southern于1975年創(chuàng)立，稱為Southern印跡技術。RNA印跡技術正好與DNA相對應，故被趣稱為Northern印跡雜交，與此原理相似的蛋白質(zhì)印跡技術那么被稱為Western blot。Northern印跡雜交的RNA吸

7、印與Southern印跡雜交的DNA吸印方法類似，只是在進樣前用甲基氧化汞、乙二醛或甲醛使RNA變性，而不用NaOH，因為它會水解RNA的2-羥基基團。RNA變性后有利于在轉(zhuǎn)印過程中與硝酸纖維素膜結(jié)合以及保持其單鏈狀態(tài)。Northern印跡雜交Northern blot組織原位雜交簡稱原位雜交，指組織或細胞的原位雜交，它與菌落的原位雜交不同。原位雜交是經(jīng)適當處理后，使細胞通透性增加，讓探針進入細胞內(nèi)與DNA或RNA雜交。因此,原位雜交可以確定探針的互補序列在胞內(nèi)的空間位置，這一點具有重要的生物學和病理學意義。例如，與細胞RNA的雜交可精確分析一種RNA在細胞中和組織中的分布。此外，原位雜交還是

8、顯示細胞亞群分布和動向及病原微生物存在方式和部位的一種重要技術。組織原位雜交Tissue in situ hybridization實驗材料及試劑：用于點樣的DNA (質(zhì)粒DNA)，用于標記的DNAPCR產(chǎn)物)，雜交膜，UV-Cross Linker或烤箱，North2South Direct HRP Labeling and Detection Kit(chemiluminescent detection)該試劑盒包含Northern 和Southern雜交中標記與化學發(fā)光所需試劑。操作步驟示意圖探針制備：10ng 溶于10l水中的DNA 在95變性5分鐘。然后在冰上放置5分鐘(為得到好的結(jié)

9、果，標記的核酸中不能有蛋白污染，而且應溶解在極純的水中。如果含鹽的濃度大于10mM將影響標記反響);參加10l North2South Direct Stabilized HRP 標記液;參加10l North2South Direct Reaction Buffer。45-50溫育15分鐘或3730分鐘。注意：在參加酶穩(wěn)定劑前不要用冰冷卻探針，否那么將在膜上出現(xiàn)小斑點。參加30l North2South Direct Enzyme Stabilizer, ng/l;穩(wěn)定劑參加后將探針凍起來或立即使用。未用的探針可以凍存。在再次使用或再次凍存時混勻。雜交前準備：使用前使所有的試劑溫度到達室溫;

10、將雜交爐和保溫裝置調(diào)到適宜溫度;準備洗滌緩沖液： 2X SSC/0.1%SDS：100ml 20X SSC + 10ml 10% SDS +890ml water 加熱至雜交溫度。 2X SSC: 100ml 20X SSC + 900ml H2ODNA點膜試劑準備: 1N NaOH，2SSC-200mlRT，2SSC/0.1%SDS 200ml55DNA變性pCMV-Myc-T10,250ng/l,5l為單鏈形式:在無DNAmllDNA和20l無核酸酶的水混合，使終濃度為10ng/l。煮沸5分鐘，立即在冰上冷卻5分鐘。準備雜交膜：注意：帶無粉末的手套，用乙醇清洗過的鑷子來操作膜a. 用45l

11、 0.1N NaOH稀釋 5l 變性DNA，使其濃度為10ng/l，N NaOHng/l。 b.分別將各稀釋樣品點1l于膜上。雖然干膜也可以得到結(jié)果，最好還是預濕膜，在半干的時候點樣。c.在1TE中快速10秒潤洗。微波爐高熱2分鐘，紫外交聯(lián)或干烤固定2小時。注意1：取膜要用鑷子小心的夾取膜的角。在各步驟之間最好將鑷子在乙醇里浸泡并使其枯燥。雜交之后、洗膜之前換洗膜的容器會使雜交結(jié)果更干凈；注意2：在雜交、洗膜和檢測期間不要讓膜枯燥；注意3：雜交緩沖液在雜交期間可能變色。預雜交和雜交室溫下， 將等體積的North2South 直接雜交緩沖液成份1與成份2(North2South Direct H

12、ybridization Buffer Component 1,2)混合，配成足以覆蓋膜的雜交緩沖液，每cm2ml。混合容器并于55C溫育；溫育雜交緩沖液至少5分鐘后，參加膜并在適當溫下預雜交至少15分鐘，同時輕柔攪動振蕩或翻轉(zhuǎn)。確保膜均勻接觸緩沖液。雜交緩沖液包含封閉試劑，因此這步包括封閉和預雜交兩步；預雜交步驟2之后，參加HRP標記的探針，每ml雜交液中DNA 探針8ng (5 - 10 ng )；注意：在參加雜交緩沖液之前，不要加熱HRP標記的探針。標記探針之后，核酸雙鏈不會復性。不需要加熱，否那么將使HRP失活。在適當溫度下溫育1小時可延長至4小時，同時輕柔攪動振蕩或翻轉(zhuǎn)。不要溫育超過4小時。洗膜雜交之后，將膜轉(zhuǎn)到一個新的盛有洗膜緩沖液2XSSC / 0.1%SDS的容器中。在與雜交相同的溫度下，用40ml約0.5 ml/cm2緩沖液洗膜三次，每次5分鐘。在室溫下，用2XSSC洗膜三次約0.5 ml/cm2，每次5分鐘。底物顯色制備化學發(fā)光工作液，將等體積North2South發(fā)光/增強溶液(North2South Direct Luminol/Enhancer Solution)與North2South穩(wěn)定過氧化物溶液(North2South Direct Stab