基因熔合技術

1、基因融合技術及其應用近年來，基因融合技術已在生物醫(yī)學研究領域中得到愈來愈廣泛的應用。在結構生物學領域，構建重 組融合蛋白可以增加可溶性蛋白的表達，有利于蛋白的純化fAltmanetal., 1991： Samuelsson ef al, 1991),也可用于體外實驗研究蛋白的功能和活性(Goulaouic and Chow, 1 996； Bushman and Miller, 1997)；在生物工程領域中可以用于篩選和生產(chǎn)抗體、多功能酶工程、特定功能的蛋白(特異性靶基因的 蛋白)(Kim and Pabo, 1997； Tang et al., 2000)。本文對基因融合技術及近年來的主要應

2、用作簡要綜 述。1基因融合技術基因融合技術是將不同的基因連接起來從而表達具有復合功能的融合蛋白，構建融合蛋白的基本原則 是：將第一個蛋白基因的終止密碼子刪除，再接上帶有終止密碼子的第二個蛋白基因，即可實現(xiàn)2個基 因的融合表達。融合蛋白除了具有衍生因子的雙重活性外，其各自的活性可能發(fā)生如下變化。1 一些融合蛋白的活性較各自野生型低HBs Ag和小鼠IL18融合蛋白誘導BALB / c鼠免疫應答的能力時，融合表達質粒不能增強免疫應答， 反而降低了機體的免疫應答水平(柯亨寧等，2001) o IL-2與IL15的融合分子未能顯著提高IL-15分 子的功能(Ozdemir and Savasan 20

3、05)。1.2活性與野生型因子活性的相加作用一致Weich ef aJ. (1993)構建了 3種IL3和促紅細胞生成素不同組合方式的融合蛋白并在CHO細胞表達，受 體結合實驗及生物活性分析表明，IL3和促紅細胞生成素的融合蛋白的活性并不比兩種因子聯(lián)合使用的 活性高。3融合蛋白的活性高于衍生因子的相加活性Hazamaet aJ. (1993)用IL-2和單純皰疹病毒胞膜糖蛋白D構建的重組融合分子研究表明，融合蛋白在 體內具有協(xié)同與增強作用。用基因重組方法將表達IL-2和I-IBV的preS的質粒轉染Cos-7細胞，該細 胞分泌表達的IL-2 preS融合蛋白保留了 IL-2和preS抗原天然分

4、子的生物學活性，且能增強preS抗原 的免疫原性，產(chǎn)生協(xié)同作用，促進機體免疫應答。IL-2 preS誘導小鼠產(chǎn)生的抗preS抗體較單獨preS 抗原誘導產(chǎn)生的高達8倍左右，說明IL-2 preS融合蛋白產(chǎn)生了協(xié)同作用，增強了 preS抗原的免疫原性， 增強了免疫應答的效應(周衛(wèi)紅等，1999)。4人工構建的新蛋白可能具有與衍生因子無關的新活性E. coli表達的IL-6和IL-2融合蛋白CH925，生物活性分析結果顯示，CH925不但可以提高不同級別的 紅系祖細胞的增殖，還能提高LAK細胞的體外增殖(趙春華等，1 995)。2影響基因融合的主要因素1融合蛋白接頭(1inker)的設計和選擇將2

5、個或多個不同的模塊連接成為一個大分子，其中起連接作用的氨基酸鏈即為linker,具有一定柔.I 生以允許兩側的分子完成各自獨立的功能。設計linker接頭時應考慮以下幾個因素。1. 1 linker的長度 一般是在1015個氨基酸之間。若使用的linker較長，由于在重組蛋白 的生產(chǎn)過程中對蛋白裂解比較敏感，可能會導致融合蛋白產(chǎn)量的降低；同時又涉及免疫原性的問題，因 接頭序列本身就是新的抗原。應用較短的linker雖可克服蛋白酶分解的問題，但可能使2個分子相距太近，影響兩種蛋白高級結構的折疊，從而相互十擾，導致蛋白功能喪失(LaVallie and Mccoy, 1995)。1.2 linke

6、r的整體折疊Robinson和Sauer(1998)發(fā)現(xiàn)linker序列的組成對融合蛋白的穩(wěn)定折疊 有重大影響。linker序列有太多的僅螺旋或B角結構會限制融合蛋白的伸縮性，結果會影響到融合蛋白 的功能活性。因此，設計linker序列時需要仔細分析以避免二級結構的產(chǎn)生。為此，Chiquito和 Feng(2000)等開發(fā)了軟件LINKER，它可以根據(jù)輸入的參數(shù)自動生成一系列l(wèi)inker序列。這個程序x衍 射品體結構或NMR質譜結構推測，適于更廣范圍的確定融合蛋白中的linker序列。1. 3 linker中常見的氨基酸非極性的疏水氨基酸如甘氨酸(Gly)、絲氨酸(ser)，因其結構簡單， 具

7、有構象的廣泛性，有利于運動，常出現(xiàn)在蛋白質中運動性大的區(qū)域，如絞鏈區(qū)；且體積小的特點又使 其利于堆積，不易產(chǎn)生碰撞。Chaudhary et al. (1989)用2個脯氨酸(Pro)作中間接頭，具有較好柔韌 性，在表達hIL-2 / mGM-CSF融合蛋白中獲得較理想的結果。1. 4 linker內部核苷酸序列 調整linker序列(GGGGS)，的核苷酸組成，雖未改變原接頭linker 的氨基酸序列，結果卻發(fā)現(xiàn)重組融合蛋白在mRNA水平上顯著增加30倍，產(chǎn)生高水平轉染克隆更穩(wěn)定 (Trinh et al.， 2004)。linker序列在融合蛋白的構建中起著重要作用，但也有學者認為，融合蛋

8、白中沒有必要增加linker。 鄭黎燕等(2001)構建IL-6-D24-PE40和IL-6-D24-1inker-PE40兩種融合蛋白，比較發(fā)現(xiàn)，柔性接頭對 融合蛋白的生物活性沒有影響，這說明柔性接頭并不能增加IL-6與其受體的結合，據(jù)作者推測于IL-6-D24和PE40融合蛋白沒有必要加link. et，這種結果可能同樣適用于其它分子導向藥物。智剛等 (1991)通過定點誘變技術將人腫瘤壞死因子和干擾素基因首尾相連，未加任何接頭序列，也表達出1個 具有抗腫瘤和抗病雙重活性的融合蛋白，但其活性較單獨使用腫瘤壞死因子和干擾素分別低24倍和15 倍。所以，具體涉及到每種蛋白在構建融合蛋白時，應多

9、選擇幾種融合方式，從中優(yōu)化出理想的連接方 式。2構建融合蛋白的常用技術2.2. 1重疊延伸基因融合技術夏榮等(2001)通過具有互補末端序列的2,3引物，PCR重疊延伸將 hIL-2和mGM-CSF通過2個脯氨酸(Pro)的中間接頭連接起來，克隆出hIL-2 / mGM-CSF融合基因。此項 技術有一定的局限性，在PCR過程中容易產(chǎn)生序列錯誤。2. 2以酶切位點相連構建融合基因 編碼5肽GSGGS中GGATCC與BamI-I I酶切位點的DNA 序列相同，故將研究所用質粒多克隆酶切位點中的BamHI酶切位點設計在linker內，以利于鑒定和操 作(孫強明等，2002；卿玉玲等，2003)。劉冬

10、梅等(2002)構建rhGM-CSF / IL-2融合蛋白表達載體時也選 用了該種融合方法，在linker的前部設計了一個BamI-I位點，GM-CSF的下游引物與IL-2的上游引物 均起始于該點。然后通過PCR、酶切和連接一系列的分子克隆的方法，構建融合蛋白的克隆及表達載體。3融合基因的主要應用融合蛋白的研究側重兩個方面，一個是利用其生物學功能，另一個是利用其與受體結合的特異性，構建 導向藥物。融合蛋白中輔助性因子的介入可能對其表達和生物效應有所幫助，使人們可以較隨意地控制 基因的表達，故而這一技術頗受青睞。1多功能細胞因子融合基因細胞因子可以介導機體多種免疫反應，如腫瘤免疫、感染免疫、移植

11、免疫、自身免疫及造血系統(tǒng)等 過程中發(fā)揮著重要的作用。細胞因子的作用具有多相性、網(wǎng)絡性的特點，它們不僅可以單獨的發(fā)揮生物 學活性，而且不同的細胞因子之間還有相互協(xié)調和相互制約的作用，利用細胞因子的這一特點，人們可 以根據(jù)自己的設想，通過基因融合等技術創(chuàng)造出自然界原本不存在的活性更佳的細胞因子融合蛋白。Seno et al. (1986)用 EcoR I 的 12 個核苷酸(4 肽)CCGGAATTCATG 為接頭，將 IFN-,y 和 IL-2 片段 連接，結果發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生的蛋白具有IFN-,y和IL-2的雙重活性。Feng ef al. (1988)將羧基C端經(jīng)過重組/FN-7和人TNF-p基因片

12、段組建成融合蛋白基因，在E. coli表達系統(tǒng)中得到表達，表達產(chǎn)物在體外細 胞毒效應明顯高于原單因子的作用。Kim ef al. (1998)研究發(fā)現(xiàn)/ L-2和TNF-o融合基因顯著提高輔助性T細胞的增殖；還報道了共注射 IL-15和TNF-a后，DNA疫苗增加HIV 一 1抗原的細胞毒反應。Yoon et al. (2001)表達GM-CSF和分枝 桿菌分泌型蛋白可以增強T細胞的免疫反應，仍有遺憾的是在用結核分枝桿菌病原攻擊時并未增強機體 的保護性。2與抗原分子形成的融合基因利用基因融合技術，將粘附因子、單克隆抗體、其它利于特異性結合真核細胞的受體或多糖等輔助蛋 白與靶抗原嵌合，不僅可以增

13、加免疫反應，還可在眾多的疑難疾病病因學和診斷治療方面有重要作用。3.2.1細胞因子與抗原分子的融合 細胞因子用以調節(jié)T細胞的活性，可以增強抗原遞呈細胞(APC) 的信號轉導，提高機體對病原的免疫反應，但細胞因子的毒性和體內半衰期短的特點限制它們在全身的 使用。融合策略可以增強免疫反應，確保抗原和細胞因子被遞呈給同一抗原細胞并活化同一 APC ；與此 同時還會延長了細胞因子的在體內的半衰期，使之更好的發(fā)揮佐劑的功能(Maecker et al.，2001； Blease efa.，2001)。細胞因子受體有助于與細胞因子相連抗原的吸收(Faulkner ef al.，2001)。早期研究顯示這種

14、嵌合的疫苗可以提高疾病保護能力，例如：肺炎球菌表面蛋白A與IL-2融合可以誘 導產(chǎn)生特異性抗體，抵抗病原的攻擊(Wortham et a1.，1998)。Kang ef al. (1999)研究中觀察到抗原 與IL-2的融合蛋白可以保持體內T細胞抗原特異性細胞毒反應。IFN和HIVI型表面糖蛋白gpl20的融 合蛋白免疫小鼠能顯著增強了 gpl20的初次免疫反應，尤其是IgG2a亞類的水平，融合蛋白初次免疫極 大地增強了 T細胞免疫和抗原特異性IFN-的產(chǎn)生fMcCormick ef al，2001)。Chelsea et a，. (2002) 構建IL-2、IFN-y與鏈球菌M6蛋白CRR(

15、保守的C端重復域1抗原的融合蛋白，皮下免疫鼠發(fā)現(xiàn)融合蛋 白明顯的上調了全身免疫反應。這表明鏈球菌可以將生物活性分子(如細胞因子)與抗原一起遞呈于免疫 系統(tǒng)。IFNa -2b和Env通過T4連接酶頭尾正向連接，其融合蛋白成功地在真核細胞中獲得表達，與痘 苗病毒共轉染的細胞懸液免疫小鼠未發(fā)現(xiàn)不良反應，且能產(chǎn)生很好的體液免疫反應(王洪軍等，2002)。 這些結果證實分泌細胞因子、非入侵細菌疫苗載體與抗原共表達可以調節(jié)免疫反應。本實驗室在前期的研究工作顯示：ChIL-2與IBDV(Li et al. ,2004)等疫苗聯(lián)合免疫能不同程度增 強相應疫苗的免疫應答水平，使雞體的細胞、體液免疫水平都得到了提

16、高。利用家蠶/桿狀病毒系統(tǒng)， 制備表達了傳染性法氏囊病病毒的主要保護性抗原VP2與ChIL-2的融合蛋白分子，間接免疫熒光和 Wester blot都證實了構建的融合分子兼具了 2種分子的免疫原性。Faulkneret al. (2003)構建流感病毒血凝素HA的T、B細胞表位與IFN-丫的融合蛋白，在脂質體包裹 成顆粒下，免疫小鼠觀察到融合蛋白誘導的ifn-y產(chǎn)量顯著高于包括混合免疫的對照組。肺病毒含量滴 度顯著低于對照組，證實經(jīng)脂質體包裝的顆粒融合蛋白是抵抗疾病增強免疫力的有效方法。郭曉蘭等 (2004)成功地構建GM-CSF和preS2融合基因表達質粒，重組質粒在HepG2細胞中表達。為

17、進一步增強乙 肝病毒的DNA疫苗的研究打下基礎。2. 2不同抗原分子構成的嵌合重組的免疫原多個T細胞表位融合，獲得免疫原性的增強(Mc一 Cormickefa1. ,2001)，或通過基因重組技術融合T細胞和B細胞的表位構建融合蛋白有效的增強對體 液和細胞兩大免疫系統(tǒng)的刺激(Lietal.，1999； Brumeanu ef al.，1996)。這種嵌合重組的免疫原 可以發(fā)揮免疫治療作用，從而引起了更為廣泛的關注。2. 3細胞因子與毒素融合利用細胞因子為導彈，特異性抗體與毒素以共價鍵連接成的雜交分子即 所謂的免疫毒素，這使毒素蛋白選擇性地殺傷相應的細胞因子受體陽性細胞，起到免疫抑制作用，以治

18、療那些由于細胞因子而引發(fā)起病理性作用的疾病(如自身免疫性疾病、移植排斥反應等)(Kreitman， 2000)。鄭黎燕等(2001)將N末端缺失24個氨基酸的重組人IL-6與缺失細胞結合區(qū)的綠膿桿菌外毒素PE40融合在一起，構建了 IL-6-D24-PE40融合蛋白，并在E. coli中實現(xiàn)了高效表達。純化的 IL-6-D24-PE40融合蛋白依賴于IL-6-D24與IL-6R的特異性結合，將其攜帶至高表達IL-6R的靶細胞表 面，通過受體介導的內吞作用進入細胞內部，然后穿膜進入胞漿而發(fā)揮PE40的細胞毒作用。因此， IL-6-D24-PE40融合蛋白能高度特異地選擇性殺傷高表達IL-6R的U

19、937細胞，而對不表達IL-6R的CEM 細胞無殺傷作用。這為進一步研究利用IL-6 / IL-6R系統(tǒng)來介導高度選擇性地殺傷高表達IL-6R的白血 病和腫瘤細胞奠定了基礎。利用細胞因子一受體系統(tǒng)介導重組細胞因子一毒素融合蛋白的選擇性殺傷作為導向治療腫瘤的第二代新 策略，是現(xiàn)代分子導向藥物研究的重要發(fā)展方向。重組的細胞因子與其受體特異性結合，導向的特異性 強；細胞因子與細菌外毒素通過基因工程技術重組后穩(wěn)定性好、相對分子量更小、細胞穿透能力更強， 可進行工業(yè)化生產(chǎn)，成本低、產(chǎn)物均一、活性穩(wěn)定；便于在基因水平設計出特異性更好、殺傷力更強、 相對分子質量更小、細胞穿透力更強、療效更好的重組毒素。3與

20、單鏈抗體分子構建的融合基因由抗體和細胞因子構成的融合蛋白，又稱為免疫細胞因子(immuno-cytokines)，也是腫瘤免疫治療 的新方法之一。免疫細胞因子保持了抗體和細胞因子的活性，同時表現(xiàn)了很強的抗腫瘤活性，這比單獨 的抗體和細胞因子、非腫瘤特異性的融合蛋白效果要好。Heloaera ef aJ. (2002)研究發(fā)現(xiàn)在神經(jīng)外胚 層腫瘤細胞存在特殊的神經(jīng)節(jié)苷脂GD2、骨髓瘤細胞中的RM4，使用特異性抗體與細胞因子(如IL-2、IFN- Y等)融合即可實現(xiàn)靶向腫瘤治療作用。董俊等(2001)將抗膠質瘤單鏈抗體與缺失細胞結合區(qū)的綠膿桿菌外毒素融合在一起，構建融合蛋白并在 E. coli中實現(xiàn)了高效表達。純化后依賴于單鏈抗體與膠質瘤細胞膜抗原特異結合，將其攜帶全