細(xì)胞電生理研究進(jìn)展

1、關(guān)于細(xì)胞電生理研究進(jìn)展第一張，PPT共四十五頁，創(chuàng)作于2022年6月第二張，PPT共四十五頁，創(chuàng)作于2022年6月一 電壓鉗（voltage clamp）技術(shù)第三張，PPT共四十五頁，創(chuàng)作于2022年6月 20世紀(jì)50年代，Hodgkin and Huxley 首次應(yīng)用電壓鉗技術(shù)對槍烏賊的標(biāo)本進(jìn)行膜電流的測定。 在槍烏賊大纖維內(nèi)縱向插入兩根細(xì)鉑絲，一根記錄電壓E，另一根記錄電流I。記錄膜電位E與調(diào)定電壓差值經(jīng)放大進(jìn)入快速電壓-電流轉(zhuǎn)換器(FBA), 加入反饋電流I, 直至膜電位與調(diào)定電壓相等為止, 維持膜電壓不變。 當(dāng)一個神經(jīng)沖動到達(dá)時，出現(xiàn)膜離子電流，為了維持膜電位不變，就必須輸入一個與膜離

2、子電流大小相等，方向相反的補(bǔ)償電流,記錄下這個補(bǔ)償電流就是膜電流的鏡像。第四張，PPT共四十五頁，創(chuàng)作于2022年6月工作原理：離子流過通道所形成的離子流是形成動作電位的基礎(chǔ)。電生理實(shí)驗(yàn)以電流作為刺激源，使可興奮細(xì)胞產(chǎn)生興奮，然后測定其膜電壓以確定離子通道的狀態(tài)。但在形成動作電位時所產(chǎn)生的離子流可影響膜電位，而膜電位的變化又會影響該離子的通透性的變化。因而，須人為地使膜電位在一定時間內(nèi)維持在一個固定水平。電壓鉗技術(shù)是通過插入細(xì)胞內(nèi)的一根微電極人為向胞內(nèi)補(bǔ)充電流，補(bǔ)充的電流正好等于跨膜流出的反相離子電流（大小相等方向相反）。意義 ：1）確保膜通透性發(fā)生改變時，控制膜電位始終維持在指令電位的水平（

3、不變）；2）通過電流檢測裝置，記錄到補(bǔ)充入胞內(nèi)的注入電流，它相當(dāng)于離子電流的反相電流。這樣可測定在不同膜電位水平的離子電流，從而了解膜通道的電導(dǎo)及功能活動。第五張，PPT共四十五頁，創(chuàng)作于2022年6月（一）電壓鉗 基本原理離子通道電流: 細(xì)胞膜上的電流 膜電容充放電電流 電壓鉗技術(shù)消除膜電容電流的影響 電壓鉗技術(shù)的基本原理：用微電極將膜電壓鉗制到新的數(shù)值上，保持一段時間不變使膜電容完成充放電過程進(jìn)入電壓鉗制的穩(wěn)態(tài)期， 測得的跨膜電流可以認(rèn)為來自于離子通道電流。 第六張，PPT共四十五頁，創(chuàng)作于2022年6月（二）理想的電壓鉗存在問題： 沒有考慮鉗制電壓的微電極阻抗RCE（兆歐姆數(shù)量級） 若考

4、慮微電極電阻，鉗制電壓VC就就被分壓， 并且，膜電阻Rm 可以有大幅度改變， 第七張，PPT共四十五頁，創(chuàng)作于2022年6月（三）雙電極電壓鉗 加記錄電極實(shí)現(xiàn)閉環(huán)電路的反饋控制 A1和A2為兩個高增益的運(yùn)算放大器，A1連接成電壓跟隨器，提供 高輸入阻抗和低輸出阻抗；A2連接成負(fù)反饋放大器。 第八張，PPT共四十五頁，創(chuàng)作于2022年6月（四）單電極電壓鉗 在電壓鉗制的穩(wěn)態(tài)期，鉗制電壓VC = Vm (Rm RCE)/Rm 只有當(dāng)鉗制電極的電阻RCE遠(yuǎn)小于細(xì)胞膜電阻Rm時，VmVC第九張，PPT共四十五頁，創(chuàng)作于2022年6月二、膜片鉗實(shí)驗(yàn)技術(shù) 膜片鉗技術(shù)是細(xì)胞生物學(xué)研究的一個重大發(fā)明。 由德國

5、神經(jīng)生物學(xué)家赫尼（Neher）和薩克曼 （Sakmann）在1970s年代中期發(fā)明，1991年兩人共同榮獲諾貝爾生理學(xué)和醫(yī)學(xué)獎。 NeherSakmann第十張，PPT共四十五頁，創(chuàng)作于2022年6月（一）膜片鉗技術(shù)發(fā)展歷史 1976年德國馬普生物物理化學(xué)研究所Neher和Sakmann首次在青蛙肌細(xì)胞上用雙電極鉗制膜電位的同時，記錄到ACh激活的單通道離子電流，從而產(chǎn)生了膜片鉗技術(shù)。1980年Sigworth等在記錄電極內(nèi)施加5-50 cmH2O的負(fù)壓吸引，得到10-100G的高阻封接（Giga-seal），大大降低了記錄時的噪聲實(shí)現(xiàn)了單根電極既鉗制膜片電位又記錄單通道電流的突破。1981年

6、Hamill和Neher等對該技術(shù)進(jìn)行了改進(jìn)，引進(jìn)了膜片游離技術(shù)和全細(xì)胞記錄技術(shù)，從而使該技術(shù)更趨完善，具有1pA的電流靈敏度、1m的空間分辨率和10s的時間分辨率。 1983年10月，Single-Channel Recording一書問世，奠定了膜片鉗技術(shù)的里程碑。Sakmann 和Neher也因其杰出的工作和突出貢獻(xiàn)，榮獲1991年諾貝爾醫(yī)學(xué)和生理學(xué)獎。第十一張，PPT共四十五頁，創(chuàng)作于2022年6月（二）膜片鉗技術(shù)的原理 同電壓鉗，用特制的玻璃微吸管吸附于細(xì)胞表面,使之形成10100的密封(giga-seal)，被孤立的小膜片面積為m量級,內(nèi)中僅有少數(shù)離子通道。使與電極尖開口處相接的細(xì)

7、胞膜的小區(qū)域（膜片）與其周圍在電學(xué)上絕緣，然后對該膜片實(shí)行電壓鉗位，可測量單個離子通道開放產(chǎn)生的pA（10安培）量級的電流，這種通道開放是一種隨機(jī)過程。通過觀測單個通道開放和關(guān)閉的電流變化，可直接得到各種離子通道開放的電流幅值分布、開放幾率、開放壽命分布等功能參量，并分析它們與膜電位、離子濃度等之間的關(guān)系。還可把吸管吸附的膜片從細(xì)胞膜上分離出來，以膜的外側(cè)向外或膜的內(nèi)側(cè)向外等方式進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。這種技術(shù)對小細(xì)胞的電壓鉗位、改變膜內(nèi)外溶液成分以及施加藥物都很方便。 第十二張，PPT共四十五頁，創(chuàng)作于2022年6月第十三張，PPT共四十五頁，創(chuàng)作于2022年6月（一）膜片鉗技術(shù)的原理 1 顯微照片2

8、 單個離子通道電流3 多個離子通道電流的疊加。 第十四張，PPT共四十五頁，創(chuàng)作于2022年6月雙電極電壓鉗技術(shù)低電阻P2、高增益A2時，VmVc 對細(xì)胞有損傷，不宜于小細(xì)胞 單電極電壓鉗技術(shù)（膜片鉗）電極電阻遠(yuǎn)小于膜片電阻， A1高增益，A2單位增益（檢測），第十五張，PPT共四十五頁，創(chuàng)作于2022年6月運(yùn)算放大器的正負(fù)輸入端子為等電位，向正輸入端子施加指令電位、經(jīng)過短路負(fù)端子可以使膜片等電位，達(dá)到電位鉗制的目的。當(dāng)膜片微電極尖端與膜片之間形成10G歐（以上封接時其間的分流電流達(dá)到最小，橫跨膜片的電流（I）可100做為來自膜片電極的記錄電流（Ip）而被測量出來。RsealIpIIpRfR0

9、第十六張，PPT共四十五頁，創(chuàng)作于2022年6月R0是與膜片阻抗相串聯(lián)的局部串聯(lián)電阻（或稱輸入阻抗）。R0通常為1-5 M歐，如果Rseal高達(dá) 10G歐，此時Ip/I=Rseal/(R0+Rseal).此時Ip可作為在IV轉(zhuǎn)換器(點(diǎn)線）內(nèi)的高阻抗反饋電阻（Rf）的電壓降而被檢測出。實(shí)際上這時場效應(yīng)管運(yùn)算放大器A1的輸出中包括著膜電阻成分，這部分將在第二級場效應(yīng)管運(yùn)算放大器A2時被減掉。RsealIpIIpRfR0第十七張，PPT共四十五頁，創(chuàng)作于2022年6月(二 )膜片鉗電極的制備1. 標(biāo)本制備根據(jù)研究目的的不同，可采用不同的細(xì)胞組織，如心肌細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞等，現(xiàn)在幾乎可對各種細(xì)

10、胞進(jìn)行膜片鉗的研究。對所采用的細(xì)胞，必須滿足實(shí)驗(yàn)要求，一般多采用酶解分離法，也可采用細(xì)胞培養(yǎng)法；另外，由于與分子生物學(xué)技術(shù)的結(jié)合，現(xiàn)在也運(yùn)用分子克隆技術(shù)表達(dá)不同的離子通道，如利用非洲爪蟾卵母細(xì)胞表達(dá)外源性基因等。第十八張，PPT共四十五頁，創(chuàng)作于2022年6月2. 電極制備合格的膜片微電極是成功封接細(xì)胞膜的基本條件。要成功的封接細(xì)胞膜需要兩方面的因素保證，一是設(shè)法造成干凈的細(xì)胞膜表面，二是制成合格的電極。首先要選擇適當(dāng)?shù)牟Ａ?xì)管，其材料可使用軟質(zhì)玻璃（蘇打玻璃、電石玻璃）或硬質(zhì)玻璃（硼硅玻璃、鋁硅玻璃、石英玻璃）。軟玻璃電極常用于作全細(xì)胞記錄，硬質(zhì)玻璃因?qū)щ娐实汀⒃肼曅《Ｓ糜陔x子單通道記錄

11、。電極玻璃第十九張，PPT共四十五頁，創(chuàng)作于2022年6月3 .電極在實(shí)驗(yàn)前要灌注電極液，由于電極尖端較細(xì)，因此在充灌前，電極內(nèi)液要用0.2 m的濾膜進(jìn)行過濾。一般電極充灌可分灌尖(tipfilling)和后充(backfilling)兩步。灌尖時將電極尖端浸入內(nèi)液中5s即可，由于毛細(xì)作用溶液會進(jìn)入電極最尖端處，然后從電極后端用細(xì)小的聚丙烯注射管插至尖端附近將溶液充至1/4長度，用手指輕輕彈除尖端殘留的氣泡即可。灌注后的電極電阻一般為25M，而全細(xì)胞記錄則最好在23M。 4. 進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，記錄和分析數(shù)據(jù)準(zhǔn)備工作就緒后即可進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作，數(shù)據(jù)記錄和分析第二十張，PPT共四十五頁，創(chuàng)作于2022年6月

12、膜片鉗實(shí)驗(yàn)技術(shù)的新發(fā)展 傳統(tǒng)膜片鉗技術(shù)主要優(yōu)缺點(diǎn)總結(jié) 第二十一張，PPT共四十五頁，創(chuàng)作于2022年6月膜片鉗實(shí)驗(yàn)技術(shù)的新發(fā)展目前膜片鉗技術(shù)已從常規(guī)膜片鉗技術(shù)（Conventional patch clamp technique）發(fā)展到全自動膜片鉗技術(shù)（Automated patch clamp technique）。 第二十二張，PPT共四十五頁，創(chuàng)作于2022年6月 傳統(tǒng)膜片鉗技術(shù)每次只能記錄一個細(xì)胞（或一對細(xì)胞），對實(shí)驗(yàn)人員來說是一項(xiàng)耗時耗力的工作，它不適合在藥物開發(fā)初期和中期進(jìn)行大量化合物的篩選，也不適合需要記錄大量細(xì)胞的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)研究。全自動膜片鉗技術(shù)的出現(xiàn)在很大程度上解決了這些問題，

13、它不僅通量高，一次能記錄幾個甚至幾十個細(xì)胞，而且從找細(xì)胞、形成封接、破膜等整個實(shí)驗(yàn)操作實(shí)現(xiàn)了自動化，免除了這些操作的復(fù)雜與困難。這兩個優(yōu)點(diǎn)使得膜片鉗技術(shù)的工作效率大大提高了！ 第二十三張，PPT共四十五頁，創(chuàng)作于2022年6月膜片鉗實(shí)驗(yàn)技術(shù)的新發(fā)展1. Flip-Tip翻轉(zhuǎn)技術(shù)： 將一定密度的細(xì)胞懸液灌注在玻璃電極中，下降到電極尖端的單個細(xì)胞通過在電極外施加負(fù)壓可以與玻璃電極尖端形成穩(wěn)定的高阻封接，自動判斷封接形成是否良好并自動破膜形成全細(xì)胞模式。隨后,藥物化合物等可以被自動應(yīng)用到管內(nèi)進(jìn)行全細(xì)胞模式實(shí)驗(yàn)。這種方式形成的膜片鉗完全排除顯微鏡和顯微操作,從而革命性的實(shí)現(xiàn)膜片鉗技術(shù)的全自動化。它的顯

14、著特點(diǎn)是仍然采用玻璃毛坯作為電極。 第二十四張，PPT共四十五頁，創(chuàng)作于2022年6月 2. SealChip技術(shù)： 完全摒棄了玻璃電極，而是采用SealChip平面電極芯片，一定密度的細(xì)胞懸液灌注在芯片上面，隨機(jī)下降到芯片上約1-2m的孔上并在自動負(fù)壓的吸引下形成高阻封接，打破孔下面的細(xì)胞膜形成全細(xì)胞記錄模式。 第二十五張，PPT共四十五頁，創(chuàng)作于2022年6月 3. Population Patch Clamp（PPC）技術(shù)： 同SealChip技術(shù)一樣，完全摒棄了玻璃電極，而是采用PatchPlate平面電極芯片。該芯片含有多個小室，每個小室中含有很多1-2m的封接孔。在記錄時，每個小室

15、中封接成功的細(xì)胞數(shù)目較多，獲得的記錄是這些細(xì)胞通道電流的平均值。 第二十六張，PPT共四十五頁，創(chuàng)作于2022年6月 總而言之,全自動膜片鉗技術(shù)具有如下的優(yōu)點(diǎn):效率高,是傳統(tǒng)膜片鉗效率的20300倍;不需要專業(yè)電生理人員,簡單易用,所有的操作可以在電腦軟件控制的界面下完成,無須顯微防震系統(tǒng);大部分儀器的封接質(zhì)量在1G以上;部分儀器同時適用于研究配體門控通道和電壓門控通道;主要應(yīng)用于藥物藥理和毒理測試;在藥物微量加樣設(shè)計方面表現(xiàn)優(yōu)秀;儀器主要工作方式為全細(xì)胞膜片鉗方式。缺點(diǎn):儀器僅適用于懸浮細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。無疑地,隨著基因組測序的完成和蛋白質(zhì)組學(xué)的興起,離子通道在未來的細(xì)胞與藥物方面研究將會變得越來越

16、重要。與此同時,作為離子通道研究的最佳伴侶- 全自動膜片鉗,由于其獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)也必定在這一領(lǐng)域大展身手。 第二十七張，PPT共四十五頁，創(chuàng)作于2022年6月3離子通道3.1 重要的生理功能細(xì)胞生物電現(xiàn)象的基礎(chǔ)參與維持細(xì)胞正常形態(tài)細(xì)胞興奮-收縮偶聯(lián)和興奮-分泌偶聯(lián)細(xì)胞跨膜信號轉(zhuǎn)導(dǎo)第二十八張，PPT共四十五頁，創(chuàng)作于2022年6月3.1 重要的生理功能細(xì)胞生物電現(xiàn)象的基礎(chǔ)靜息電位的形成第二十九張，PPT共四十五頁，創(chuàng)作于2022年6月細(xì)胞生物電現(xiàn)象的基礎(chǔ)動作電位的形成第三十張，PPT共四十五頁，創(chuàng)作于2022年6月參與維持細(xì)胞正常形態(tài)第三十一張，PPT共四十五頁，創(chuàng)作于2022年6月細(xì)胞興奮-收縮偶

17、聯(lián)第三十二張，PPT共四十五頁，創(chuàng)作于2022年6月細(xì)胞興奮-分泌-興奮偶聯(lián)第三十三張，PPT共四十五頁，創(chuàng)作于2022年6月細(xì)胞跨膜信號轉(zhuǎn)導(dǎo)第三十四張，PPT共四十五頁，創(chuàng)作于2022年6月3.2離子通道分類第三十五張，PPT共四十五頁，創(chuàng)作于2022年6月在1902年，Bernstein創(chuàng)造性地將Nernst的理論應(yīng)用到生物膜上，提出了“膜學(xué)說”。他認(rèn)為在靜息狀態(tài)下，細(xì)胞膜只對鉀離子具有通透性，即細(xì)胞靜息電位的鉀離子學(xué)說；而當(dāng)細(xì)胞興奮的瞬間，膜的破裂使其喪失了選擇通透性，所有的離子都可以自由通過。Hodgkin、Huxley、Katz等人在20世紀(jì)3050年代做出了開創(chuàng)性研究。他們基于電壓

18、鉗技術(shù)，提出并驗(yàn)證了所謂的HodgkinHuxley方程，數(shù)學(xué)模擬出和真實(shí)狀況相符合的神經(jīng)沖動的傳導(dǎo)，由此建立了細(xì)胞動作電位的鈉離子學(xué)說。離子通道的近代觀念也由此產(chǎn)生。3.3離子通道研究理論第三十六張，PPT共四十五頁，創(chuàng)作于2022年6月3.4離子通道研究技術(shù)微電極電壓鉗-電流鉗技術(shù)傳統(tǒng)膜片鉗技術(shù)Erwin Neher(1944- )Kenneth Cole(1900-1984)第三十七張，PPT共四十五頁，創(chuàng)作于2022年6月3. 平板膜片鉗技術(shù)（膜片鉗技術(shù)新趨勢的關(guān)鍵）原創(chuàng)技術(shù)專利：第三十八張，PPT共四十五頁，創(chuàng)作于2022年6月表2. 膜片鉗技術(shù)的歷史角色第三十九張，PPT共四十五頁，創(chuàng)作于2022年6月3.5傳統(tǒng)膜片鉗設(shè)備的組成電學(xué)部分 信號放大器 數(shù)據(jù)采集卡 PC 周邊設(shè)備控制器等光學(xué)部分： 熒光顯微鏡 CCD照相機(jī) 監(jiān)視器 激光器等 機(jī)械部分 防震臺，氣壓泵或氣瓶 高精密微電極操作器 灌流操作器 顯微鏡移動平臺或可移動載物臺輔助部分： 信號屏蔽罩 微電極拉制儀 藥物灌流設(shè)備 溫度控制器第四十張，PPT共四十五頁，創(chuàng)作于2022年6月3.6 全自動膜片鉗設(shè)備的組成工作站平板芯片+即：德國Nanion公司Patchliner德國Nanion公司