腫瘤組織起源基因檢測(cè)試劑盒（PCR熒光探針?lè)ǎ–SZ2100184）

1、受理號(hào)：CSZ2100184體外診斷試劑產(chǎn)品注冊(cè)技術(shù)審評(píng)報(bào)告產(chǎn)品中文名稱： 腫瘤組織起源基因檢測(cè)試劑盒（PCR熒光探針?lè)ǎ┊a(chǎn)品管理類別： 第三類申 請(qǐng) 人 名 稱 ： 杭州可幫基因科技有限公司國(guó)家藥品監(jiān)督管理局醫(yī)療器械技術(shù)審評(píng)中心 1 目 錄基本信息.3一、申請(qǐng)人名稱.3二、申請(qǐng)人住所.3三、生產(chǎn)地址.3技術(shù)審評(píng)概述.4一、產(chǎn)品概述.4二、臨床前研究概述 .7三、臨床評(píng)價(jià)概述.12四、產(chǎn)品受益風(fēng)險(xiǎn)判定.14綜合評(píng)價(jià)意見(jiàn).17 2 基本信息一、 申請(qǐng)人名稱杭州可幫基因科技有限公司二、 申請(qǐng)人住所浙江省杭州市余杭區(qū)余杭經(jīng)濟(jì)技術(shù)開(kāi)發(fā)區(qū)新顏路 22 號(hào) 7 幢301M三、 生產(chǎn)地址杭州市余杭區(qū)龍船塢路

2、 157 號(hào) 3 幢 5 層 502 室；杭州市余杭區(qū)龍船塢路 157 號(hào) 5 幢 3 層 1309、1310 室 3 技術(shù)審評(píng)概述一、 產(chǎn)品概述（一）產(chǎn)品主要組成成分試劑盒由以下組分組成，主要組成成分見(jiàn)表 1。表 1 試劑盒主要組成成分編號(hào) 組分名稱 主要成分 數(shù)量1 逆轉(zhuǎn)錄預(yù)混試劑引物、脫氧核糖核苷三磷酸（dNTP）1管（250L/管）2 逆轉(zhuǎn)錄酶 RNA依賴性DNA聚合酶 1管（55L/管）3 RNA酶抑制劑 抑制劑酶 1管（15L/管）4 PCR擴(kuò)增預(yù)混試劑DNA聚合酶、脫氧核糖核苷三磷酸（dNTP）1瓶（11mL/瓶）5 探針引物預(yù)混板 引物、熒光探針10板（4L/孔，96孔/板）6

3、 陽(yáng)性對(duì)照品 人源乳腺癌組織總RNA 1管（10L/管）7 陰性對(duì)照品 人源淋巴細(xì)胞系總RNA 1管（10L/管）8 稀釋液 無(wú)核酸酶水 1瓶（8mL/瓶）9 透光膜 1袋（10張/袋）10 加樣槽 2袋（5個(gè)/袋，共10個(gè)）具體內(nèi)容詳見(jiàn)產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)。（二）產(chǎn)品預(yù)期用途本產(chǎn)品適用于定性檢測(cè)組織分化程度較差或疑似轉(zhuǎn)移的實(shí)體腫瘤患者的福爾馬林固定、石蠟包埋組織樣本中 90 個(gè)組織特異基因表達(dá)模式（Gene Expression Pattern），用于判別腫瘤組織起 4 源，具體包括：乳腺癌、宮頸癌、結(jié)直腸癌、胃及食管癌、腎癌、肝膽腫瘤、肺癌、黑色素瘤、神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤、卵巢癌、前列腺癌、生殖細(xì)胞腫瘤、

4、甲狀腺癌和尿路上皮癌。本產(chǎn)品與腫瘤組織起源基因分析軟件配合使用，不用于區(qū)分原發(fā)性腫瘤與轉(zhuǎn)移性腫瘤。在惡性腫瘤病理檢查過(guò)程中，對(duì)于不能排除為轉(zhuǎn)移性腫瘤的患者，本產(chǎn)品可為病理醫(yī)生診斷腫瘤的類型和組織起源提供支持；但在確定腫瘤分期、評(píng)估預(yù)后和指導(dǎo)治療等方面，本產(chǎn)品不能替代免疫組化。同時(shí)，本產(chǎn)品的檢測(cè)結(jié)果不能作為癌癥診斷的唯一依據(jù)。病理醫(yī)生還應(yīng)參考病史信息、影像學(xué)檢查和其他病理檢查結(jié)果，對(duì)受檢標(biāo)本的腫瘤類型和組織起源進(jìn)行綜合判斷，出具診斷報(bào)告。本產(chǎn)品不適用于淋巴瘤和經(jīng)脫鈣處理的骨腫瘤樣本。病理診斷是當(dāng)前腫瘤診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，而免疫組化檢測(cè)則是病理診斷中對(duì)腫瘤進(jìn)行分型的基礎(chǔ)，對(duì)于腫瘤分化程度較差（HE切片上

5、缺少腫瘤細(xì)胞起源的特征）或者疑似轉(zhuǎn)移性腫瘤尤為重要。腫瘤的分型通常需要聯(lián)合數(shù)個(gè)免疫組化抗體，分步驟地進(jìn)行檢測(cè)，病理醫(yī)生往往只能選取數(shù)量有限的免疫組化抗體進(jìn)行檢測(cè)。免疫組化用于腫瘤診斷所面臨的挑戰(zhàn)還包括，對(duì)于部分腫瘤無(wú)法找到特異性的免疫組化抗體。當(dāng)缺乏特異性的免疫組化標(biāo)記或少數(shù)非特異性免疫組化標(biāo)記為陽(yáng)性時(shí)，病理診斷往往只能給出較為模糊的診斷結(jié)果。國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道，轉(zhuǎn)移性腫瘤的基因表達(dá)譜與轉(zhuǎn)移 5 部位組織的基因表達(dá)譜存在差異，而與其原發(fā)部位組織的基因表達(dá)譜更相似，提示腫瘤在其發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移的過(guò)程中，始終保留其組織起源的分子特征。因此，基因表達(dá)譜檢測(cè)可在分子水平揭示腫瘤的組織起源，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤的

6、分型。（三）產(chǎn)品包裝規(guī)格10 測(cè)試/盒（四）產(chǎn)品檢驗(yàn)原理該產(chǎn)品基于實(shí)時(shí)熒光 PCR 平臺(tái)，檢測(cè)腫瘤樣本 RNA 中組織特異基因的表達(dá)模式，并與參考數(shù)據(jù)庫(kù)中已知腫瘤類型的基因表達(dá)模式進(jìn)行比對(duì)，判斷待測(cè)腫瘤樣本組織起源。該產(chǎn)品利用特異引物對(duì) 90 個(gè)組織特異基因進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，并通過(guò) TaqMan-MGB 探針對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，在實(shí)時(shí)熒光PCR平臺(tái)上獲取樣本組織特異基因的表達(dá)模式。采用腫瘤組織起源基因分析軟件對(duì)待測(cè)樣本的基因表達(dá)模式進(jìn)行分析，軟件可自動(dòng)比較待測(cè)樣本與已知組織起源的腫瘤基因表達(dá)模式之間的相關(guān)性，從而判斷待測(cè)腫瘤樣本的組織起源。腫瘤組織起源基因分析軟件參考數(shù)據(jù)庫(kù)涵蓋根據(jù)組織細(xì)胞起

7、源和解剖學(xué)部位定義的 14 種腫瘤類型，具體包括：乳腺癌、宮頸癌、結(jié)直腸癌、胃及食管癌、腎癌、肝膽腫瘤、肺癌、黑色素瘤、神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤、卵巢癌、前列腺癌、生殖細(xì)胞腫瘤、甲狀腺癌及尿路上皮癌。該產(chǎn)品選用人源管家基因作為內(nèi)部參照（以下簡(jiǎn)稱內(nèi)參）系 6 統(tǒng)，對(duì)樣本 RNA 提取、逆轉(zhuǎn)錄和 PCR 反應(yīng)過(guò)程進(jìn)行質(zhì)量控制。二、 臨床前研究概述（一）主要原材料1.主要原材料的選擇該產(chǎn)品的主要原材料包括引物、探針、dNTPs、DNA 聚合酶、隨機(jī)引物、逆轉(zhuǎn)錄酶及對(duì)照品等。原材料均通過(guò)外購(gòu)的方式獲得。申請(qǐng)人對(duì)主要原材料進(jìn)行了供應(yīng)商的選擇，通過(guò)功能性實(shí)驗(yàn)篩選出合格供應(yīng)商，制定了各主要原材料的技術(shù)要求和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)并

8、經(jīng)檢驗(yàn)合格。2.企業(yè)參考品和質(zhì)控品設(shè)置情況該產(chǎn)品企業(yè)參考品包括陽(yáng)性參考品、陰性參考品、檢測(cè)限參考品和重復(fù)性參考品。質(zhì)控品分為陽(yáng)性對(duì)照品和陰性對(duì)照品。企業(yè)參考品的主要原材料為臨床組織樣本。陽(yáng)性參考品包括28 種，分別為該產(chǎn)品涵蓋的 14 種腫瘤類型的 FFPE 腫瘤組織樣本。陰性參考品包括 8 種，分別為該產(chǎn)品不涵蓋的 5 種腫瘤類型的 FFPE 腫瘤組織樣本，以及 3 種 FFPE 正常組織樣本。檢測(cè)限參考品包括 15 種，分別為 14 種腫瘤類型最低檢測(cè)限參考品，由陽(yáng)性參考品的 RNA 稀釋而成；以及 1 種基因表達(dá)最低檢測(cè)限參考品，涵蓋該產(chǎn)品所有檢測(cè)基因。重復(fù)性參考品包括 2 種，分別為涵

9、蓋該產(chǎn)品所有檢測(cè)基因的強(qiáng)陽(yáng)性重復(fù)性參考品和弱陽(yáng)性重復(fù)性參考品?；虮磉_(dá)最低檢測(cè)限參考品和重復(fù)性參考品均由臨床 7 腫瘤組織 RNA 樣品經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄得到 cDNA，采用數(shù)字 PCR 方法測(cè)定拷貝數(shù)后進(jìn)行稀釋而成。該試劑盒同時(shí)設(shè)置了陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照，用于檢測(cè)過(guò)程中試劑和儀器的質(zhì)量控制。此外，每個(gè)樣本均檢測(cè)內(nèi)參基因，用于結(jié)果的判讀及評(píng)估樣本的質(zhì)量。（二）生產(chǎn)工藝及反應(yīng)體系研究申請(qǐng)人對(duì)試劑盒反應(yīng)體系的研究包括引物探針濃度的確定、PCR 擴(kuò)增預(yù)混試劑用量的確定、dNTPs 濃度的確定、隨機(jī)引物濃度的確定、逆轉(zhuǎn)錄酶濃度的確定等；對(duì) PCR 反應(yīng)條件的研究包括 PCR 反應(yīng)程序的優(yōu)化、基線閾值和閾值循環(huán)數(shù)的

10、確定；對(duì)樣本采集要求、樣本保存時(shí)間、樣本核酸提取方法和樣本用量進(jìn)行了研究。對(duì)產(chǎn)品檢測(cè)范圍內(nèi)的全部癌種分別進(jìn)行樣本 RNA 的提取及濃度、純度的研究，確定提取后 RNA 濃度應(yīng)60ng/L 且其A260/A280 應(yīng)在 1.72.1。通過(guò)功能性實(shí)驗(yàn)，最終確定了最佳的反應(yīng)體系。申請(qǐng)人根據(jù)試劑盒中試劑及組件的主要生產(chǎn)工藝的研究結(jié)果，確定了最佳的生產(chǎn)工藝。（三）分析性能評(píng)估該產(chǎn)品分析性能評(píng)估內(nèi)容包括樣本穩(wěn)定性、準(zhǔn)確度、分析特異性、最低檢測(cè)限、精密度、包容性、干擾物質(zhì)研究。1.樣本穩(wěn)定性研究 8 申請(qǐng)人對(duì)該產(chǎn)品適用的福爾馬林固定、石蠟包埋（FFPE）病理組織切片保存穩(wěn)定性、對(duì)提取后的 RNA 樣本保存條

11、件和凍融穩(wěn)定性進(jìn)行了研究。確定該產(chǎn)品可以檢測(cè)保存時(shí)間不超過(guò) 3 年的 FFPE 樣本；提取后的 RNA 樣本在-70-80保存不超過(guò) 6個(gè)月，凍融次數(shù)不超過(guò) 3 次。2.準(zhǔn)確度研究申請(qǐng)人檢測(cè) 28 份企業(yè)陽(yáng)性參考品，檢測(cè)結(jié)果分別為對(duì)應(yīng)的腫瘤類型，陽(yáng)性符合率 100%；檢測(cè) 8 份企業(yè)陰性參考品，檢測(cè)結(jié)果均為陰性，陰性符合率 100%；檢測(cè) 90 份病理診斷結(jié)果明確的低分化或未分化腫瘤和轉(zhuǎn)移性腫瘤臨床樣本，準(zhǔn)確性為 100%。3.分析特異性分析特異性研究包括組織起源鑒別能力研究和交叉反應(yīng)研究。申請(qǐng)人選擇產(chǎn)品檢測(cè)范圍內(nèi)的全部癌種的轉(zhuǎn)移性腫瘤樣本，使用三個(gè)批次的試劑盒對(duì)該產(chǎn)品的組織起源鑒別能力進(jìn)行研

12、究，檢測(cè)結(jié)果顯示能準(zhǔn)確鑒別腫瘤組織及其配對(duì)癌旁組織樣本的不同組織起源。申請(qǐng)人選擇產(chǎn)品檢測(cè)范圍外的 8 種腫瘤組織或正常組織樣本進(jìn)行交叉反應(yīng)研究，包括淋巴瘤、陰莖癌、骨髓瘤、胸腺癌、皮膚鱗癌、淋巴結(jié)組織、扁桃體組織、皮膚組織，結(jié)果均為陰性。4.最低檢測(cè)限研究最低檢測(cè)限研究包括各個(gè)靶基因最低檢測(cè)限的研究和可檢測(cè)腫瘤組織最低比例的研究。 9 申請(qǐng)人使用三個(gè)不同批次的試劑盒分別對(duì)產(chǎn)品 90 個(gè)靶基因的最低檢測(cè)限進(jìn)行研究，確定試劑盒對(duì)于每個(gè)靶基因最低檢測(cè)限，結(jié)果顯示各個(gè)靶基因的最低檢測(cè)限為 5 拷貝/L 至 50 拷貝/L。申請(qǐng)人使用三個(gè)不同批次的試劑盒分別對(duì)產(chǎn)品檢測(cè)范圍內(nèi)的全部癌種進(jìn)行研究。對(duì)每種腫瘤

13、類型的不同腫瘤細(xì)胞比例的樣本進(jìn)行檢測(cè)，確定可檢測(cè)腫瘤組織的最低比例為腫瘤細(xì)胞比例 60%。5.精密度精密度研究采用三個(gè)不同批次的試劑盒，通過(guò)不同地點(diǎn)、人員、輪次、日間和批次對(duì)不同癌種的腫瘤臨床樣本進(jìn)行連續(xù) 20天精密度研究，檢測(cè)結(jié)果（相似度分?jǐn)?shù)最大值）變異系數(shù) CV 均不高于 15%。對(duì)連續(xù)三批生產(chǎn)的試劑盒采用企業(yè)強(qiáng)陽(yáng)性重復(fù)性參考品和弱陽(yáng)性重復(fù)性參考品進(jìn)行重復(fù)性檢測(cè)，每批試劑盒每份參考品重復(fù)檢測(cè) 10 次，每個(gè)靶基因的 Ct 值變異系數(shù) CV 均不高于 5%。6.包容性研究申請(qǐng)人采用三個(gè)不同批次的試劑盒對(duì)試劑盒檢測(cè)范圍內(nèi)的各腫瘤類型及相關(guān)亞型進(jìn)行包容性確認(rèn)，結(jié)果表明試劑盒對(duì)各腫瘤類型及其相關(guān)亞

14、型均能正確檢出，試劑盒包容性良好。7.干擾物質(zhì)研究干擾物質(zhì)研究分為外源性干擾物質(zhì)研究和內(nèi)源性干擾物質(zhì)研究。 10 外源性干擾物研究包括針對(duì) FFPE 樣本在處理過(guò)程中的常見(jiàn)的酒精、福爾馬林和石蠟的干擾試驗(yàn)研究。研究結(jié)果表明，當(dāng)酒精1%（V/V）、福爾馬林0.005%（V/V）、石蠟1%（V/V）時(shí)，對(duì)該產(chǎn)品的檢測(cè)結(jié)果不產(chǎn)生干擾。內(nèi)源性干擾物研究包括針對(duì)癌旁組織和壞死組織的干擾試驗(yàn)研究。研究結(jié)果表明，當(dāng)待測(cè)樣本中癌旁組織或壞死組織比例40%時(shí)，對(duì)該產(chǎn)品的檢測(cè)結(jié)果不產(chǎn)生影響。（四）陽(yáng)性判斷值研究該產(chǎn)品陽(yáng)性判斷值的研究采用診斷信息明確的 600 例臨床腫瘤樣本，涵蓋全部腫瘤類型。對(duì) 600 例腫瘤臨

15、床樣本的最大相似度分?jǐn)?shù)采用最優(yōu)離散化算法確定試劑盒的相似度分?jǐn)?shù)陽(yáng)性判斷值為 45.3。結(jié)果顯示當(dāng)相似度分?jǐn)?shù)45.3 時(shí)，樣本的檢測(cè)結(jié)果為陰性；當(dāng)相似度分?jǐn)?shù)45.3 時(shí)，樣本的檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性。當(dāng)以最大相似度分?jǐn)?shù) 45.3作為陽(yáng)性判斷值，對(duì)診斷明確的臨床腫瘤樣本的組織起源或類型進(jìn)行判定時(shí)，各腫瘤類型的陽(yáng)性符合率和陰性符合率，結(jié)果如下：腫瘤類型 陽(yáng)性符合率 陰性符合率乳腺癌 100.00% 100.00%宮頸癌 93.33% 99.39%結(jié)直腸癌 93.33% 99.60%胃及食管癌 89.47% 98.77% 11 腎癌 96.00% 100.00%肝膽腫瘤 96.00% 99.20%肺癌 95.

16、12% 99.59%黑色素瘤 100.00% 100.00%神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤 94.12% 100.00%卵巢癌 93.75% 99.59%前列腺癌 100.00% 100.00%生殖細(xì)胞腫瘤 91.67% 100.00%甲狀腺癌 100.00% 100.00%尿路上皮癌 96.15% 99.80%（五）穩(wěn)定性研究申請(qǐng)人對(duì)該產(chǎn)品的穩(wěn)定性研究包括貨架效期穩(wěn)定性、運(yùn)輸穩(wěn)定性和使用穩(wěn)定性（包括開(kāi)瓶穩(wěn)定性、凍融穩(wěn)定性）。貨架有效期穩(wěn)定性：將三批次試劑盒置于-15-25保存，分別于不同時(shí)間點(diǎn)使用企業(yè)參考品對(duì)試劑盒的性能進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明試劑盒在-15-25保存條件下，產(chǎn)品有效期為 12 個(gè)月。此外，申請(qǐng)人

17、對(duì)產(chǎn)品的運(yùn)輸穩(wěn)定性和使用穩(wěn)定性分別進(jìn)行了研究。結(jié)果顯示產(chǎn)品的性能均滿足產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)的聲稱。三、 臨床評(píng)價(jià)概述申請(qǐng)人以臨床試驗(yàn)的方式進(jìn)行臨床評(píng)價(jià)。臨床試驗(yàn)在復(fù)旦大學(xué)腫瘤醫(yī)院、北京腫瘤醫(yī)院和浙江省腫瘤醫(yī)院共三家臨床試驗(yàn)機(jī) 12 構(gòu)開(kāi)展，采用試驗(yàn)醫(yī)療器械對(duì)腫瘤組織起源的判定結(jié)果與臨床參考標(biāo)準(zhǔn)（即組織病理學(xué)檢查結(jié)果）進(jìn)行比較研究，評(píng)價(jià)試驗(yàn)醫(yī)療器械臨床性能。入組樣本主要為低分化腫瘤、未分化腫瘤和轉(zhuǎn)移性腫瘤 FFPE 樣本，腫瘤類型包括乳腺癌、宮頸癌、結(jié)直腸癌、胃及食管癌、腎癌、肝膽腫瘤、肺癌、黑色素瘤、神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤、卵巢癌、前列腺癌、生殖細(xì)胞腫瘤、甲狀腺癌和尿路上皮癌等共 14 種腫瘤。臨床試驗(yàn)共計(jì)入組

18、 1010 例受試者，陽(yáng)性樣本共計(jì) 923 例，陰性樣本 87 例（陰莖癌、淋巴瘤、皮膚鱗癌等在本研究中作為陰性病例）；其中低分化腫瘤、未分化腫瘤共計(jì) 656 例，轉(zhuǎn)移性腫瘤共 192 例；各種腫瘤陽(yáng)性病例數(shù)分別為：乳腺癌 88 例、宮頸癌 63 例、結(jié)直腸癌 53 例、胃及食管癌 66 例、腎癌 27 例、肝膽腫瘤 62 例、肺癌 105 例、黑色素瘤 54 例、神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤 41例、卵巢癌 53 例、前列腺癌 31 例、生殖細(xì)胞腫瘤 40 例、甲狀腺癌 67 例和尿路上皮癌 51 例。試驗(yàn)結(jié)果顯示，試驗(yàn)體外診斷試劑檢測(cè)結(jié)果與組織病理學(xué)檢查結(jié)果的陽(yáng)性符合率為 90.79%（95%CI：88

19、.74%，92.58%），陰性符合率為 91.95%（95%CI：84.12%，96.70%），總符合率90.89%（95%CI：88.95%，92.59%）；每種腫瘤陽(yáng)性符合率均高于 85%。針對(duì) 172 例轉(zhuǎn)移性腫瘤，試驗(yàn)體外診斷試劑檢測(cè)結(jié)果與臨床診斷結(jié)果符合率為 81.98%。 13 綜上所述，該產(chǎn)品與組織病理學(xué)檢查具有良好的一致性，產(chǎn)品臨床性能滿足臨床需求。四、 產(chǎn)品受益風(fēng)險(xiǎn)判定根據(jù)YY/T 0316-2016 醫(yī)療器械風(fēng)險(xiǎn)管理對(duì)醫(yī)療器械的應(yīng)用及其內(nèi)部質(zhì)量管理體系規(guī)定執(zhí)行風(fēng)險(xiǎn)管理相關(guān)活動(dòng)，對(duì)該產(chǎn)品進(jìn)行受益風(fēng)險(xiǎn)判定。（一）受益評(píng)估本產(chǎn)品適用于定性檢測(cè)組織分化程度較差或疑似轉(zhuǎn)移的實(shí)體腫瘤患

20、者的福爾馬林固定、石蠟包埋組織樣本中 90 個(gè)組織特異基因表達(dá)模式（Gene Expression Pattern），用于判別腫瘤組織起源，具體包括：乳腺癌、宮頸癌、結(jié)直腸癌、胃及食管癌、腎癌、肝膽腫瘤、肺癌、黑色素瘤、神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤、卵巢癌、前列腺癌、生殖細(xì)胞腫瘤、甲狀腺癌和尿路上皮癌。該產(chǎn)品可以為病理醫(yī)生提供一種腫瘤組織起源或腫瘤分類輔助診斷方法的選擇。在惡性腫瘤病理檢查過(guò)程中，對(duì)于不能排除為轉(zhuǎn)移性腫瘤的患者，本產(chǎn)品可為病理醫(yī)生診斷癌癥的類型和組織起源提供支持，需進(jìn)一步加做免疫組化標(biāo)記明確腫瘤的原發(fā)病灶。（二）風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估該產(chǎn)品已知和可預(yù)見(jiàn)的風(fēng)險(xiǎn)主要有以下幾個(gè)方面：該產(chǎn)品的檢測(cè)結(jié)果不能作為癌癥

21、診斷的唯一依據(jù)。在具體臨床應(yīng)用時(shí)，病理醫(yī)生還應(yīng)參考病史信息、影像學(xué)檢查和其他病理 14 檢查結(jié)果，對(duì)受檢標(biāo)本的腫瘤類型和組織起源進(jìn)行綜合判斷，出具診斷報(bào)告。腫瘤組織（細(xì)胞）可能存在較大異質(zhì)性，不同部位取樣可能會(huì)得到不同的檢測(cè)結(jié)果。惡性腫瘤在轉(zhuǎn)移過(guò)程中易發(fā)生分子特征的改變，導(dǎo)致腫瘤特征基因的表達(dá)特異性降低，使得該試劑盒在轉(zhuǎn)移性腫瘤中的性能降低，可能造成判斷錯(cuò)誤。不合理的樣本采集、轉(zhuǎn)運(yùn)及處理，以及不當(dāng)?shù)脑囼?yàn)操作和實(shí)驗(yàn)環(huán)境均有可能導(dǎo)致假陰性或假陽(yáng)性結(jié)果。該產(chǎn)品僅限于規(guī)定的樣本類型及檢測(cè)儀器和系統(tǒng)（包括適用機(jī)型、核酸提取試劑、檢測(cè)方法、腫瘤組織起源基因分析軟件等）。該產(chǎn)品適用于包含在參考數(shù)據(jù)庫(kù)中的 1

22、4 種腫瘤類型。當(dāng)檢測(cè)結(jié)果為陰性或無(wú)法判別時(shí)，提示該樣本可能屬于 14 種以外的其他腫瘤類型；或該樣本中 RNA 濃度較低，不在該試劑盒檢測(cè)能力范圍內(nèi)。通過(guò)風(fēng)險(xiǎn)/受益綜合評(píng)價(jià)，合理地定義了該產(chǎn)品受益和風(fēng)險(xiǎn)的種類和可能性。目前已知及可預(yù)見(jiàn)風(fēng)險(xiǎn)均提出了相應(yīng)的控制措施和適應(yīng)癥限制，能較大程度的滿足醫(yī)療需求。經(jīng)綜合評(píng)價(jià)，認(rèn)為該產(chǎn)品上市帶來(lái)的預(yù)期受益大于風(fēng)險(xiǎn)，綜合剩余風(fēng)險(xiǎn)可接受。盡管目前認(rèn)為該試劑盒的受益大于風(fēng)險(xiǎn)，但為保證用械安全， 15 基于對(duì)主要剩余風(fēng)險(xiǎn)的防控，已在該試劑盒說(shuō)明書(shū)中提示以下信息：1.預(yù)期用途：本產(chǎn)品與腫瘤組織起源基因分析軟件配合使用，不用于區(qū)分原發(fā)性腫瘤與轉(zhuǎn)移性腫瘤。在惡性腫瘤病理檢

23、查過(guò)程中，對(duì)于不能排除為轉(zhuǎn)移性腫瘤的患者，本產(chǎn)品可為病理醫(yī)生診斷腫瘤的類型和組織起源提供支持；但在確定腫瘤分期、評(píng)估預(yù)后和指導(dǎo)治療等方面，本產(chǎn)品不能替代免疫組化。同時(shí)，本產(chǎn)品的檢測(cè)結(jié)果不能作為癌癥診斷的唯一依據(jù)。病理醫(yī)生還應(yīng)參考病史信息、影像學(xué)檢查和其他病理檢查結(jié)果，對(duì)受檢標(biāo)本的腫瘤類型和組織起源進(jìn)行綜合判斷，出具診斷報(bào)告。本產(chǎn)品不適用于淋巴瘤和經(jīng)脫鈣處理的骨腫瘤樣本。2.警示及注意事項(xiàng)：該試劑盒說(shuō)明書(shū)中明確了該試劑盒【檢驗(yàn)方法的局限性】及使用中的【注意事項(xiàng)】。 16 綜合評(píng)價(jià)意見(jiàn)本申報(bào)項(xiàng)目為境內(nèi)第三類醫(yī)療器械產(chǎn)品注冊(cè)，屬于境內(nèi)同品種首個(gè)產(chǎn)品。申請(qǐng)人的注冊(cè)申報(bào)資料符合現(xiàn)行要求，依據(jù)醫(yī)療器械監(jiān)督

24、管理?xiàng)l例（國(guó)務(wù)院令第 680 號(hào)）、體外診斷試劑注冊(cè)管理辦法（原國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局令 2014年第 5號(hào)）等相關(guān)醫(yī)療器械法規(guī)與配套規(guī)章，經(jīng)系統(tǒng)評(píng)價(jià)后，建議準(zhǔn)予注冊(cè)。2022 年 7 月 10 日附件：產(chǎn)品說(shuō)明書(shū) 17 腫瘤組織起源基因檢測(cè)試劑盒（PCR熒光探針?lè)ǎ┱f(shuō)明書(shū)【產(chǎn)品名稱】通用名稱：腫瘤組織起源基因檢測(cè)試劑盒（PCR熒光探針?lè)ǎ景b規(guī)格】10測(cè)試/盒【預(yù)期用途】本產(chǎn)品適用于定性檢測(cè)組織分化程度較差或疑似轉(zhuǎn)移的實(shí)體腫瘤患者的福爾馬林固定、石蠟包埋組織樣本中90個(gè)組織特異基因表達(dá)模式（Gene Expression Pattern），用于判別腫瘤組織起源，具體包括：乳腺癌、宮頸癌、

25、結(jié)直腸癌、胃及食管癌、腎癌、肝膽腫瘤、肺癌、黑色素瘤、神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤、卵巢癌、前列腺癌、生殖細(xì)胞腫瘤、甲狀腺癌和尿路上皮癌。本產(chǎn)品與腫瘤組織起源基因分析軟件配合使用，不用于區(qū)分原發(fā)性腫瘤與轉(zhuǎn)移性腫瘤。在惡性腫瘤病理檢查過(guò)程中，對(duì)于不能排除為轉(zhuǎn)移性腫瘤的患者，本產(chǎn)品可為病理醫(yī)生診斷腫瘤的類型和組織起源提供支持；但在確定腫瘤分期、評(píng)估預(yù)后和指導(dǎo)治療等方面，本產(chǎn)品不能替代免疫組化。同時(shí)，本產(chǎn)品的檢測(cè)結(jié)果不能作為癌癥診斷的唯一依據(jù)。病理醫(yī)生還應(yīng)參考病史信息、影像學(xué)檢查和其他病理檢查結(jié)果，對(duì)受檢標(biāo)本的腫瘤類型和組織起源進(jìn)行綜合判斷，出具診斷報(bào)告。本產(chǎn)品不適用于淋巴瘤和經(jīng)脫鈣處理的骨腫瘤樣本。病理診斷是當(dāng)

26、前腫瘤診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，而免疫組織化學(xué)（簡(jiǎn)稱“免疫組 18 化”）檢測(cè)則是病理診斷中對(duì)腫瘤進(jìn)行分型的基礎(chǔ)，對(duì)于腫瘤分化程度較差（HE切片上缺少腫瘤細(xì)胞起源的特征）或者疑似轉(zhuǎn)移性腫瘤尤為重要。腫瘤的分型通常需要聯(lián)合數(shù)個(gè)免疫組化抗體，分步驟地進(jìn)行檢測(cè)，病理醫(yī)生往往只能選取數(shù)量有限的免疫組化抗體進(jìn)行檢測(cè)。免疫組化用于腫瘤診斷所面臨的挑戰(zhàn)還包括，對(duì)于部分腫瘤無(wú)法找到特異性的免疫組化抗體。當(dāng)缺乏特異性的免疫組化標(biāo)記或少數(shù)非特異性免疫組化標(biāo)記為陽(yáng)性時(shí)，病理診斷往往只能給出較為模糊的診斷結(jié)果1。國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道，轉(zhuǎn)移性腫瘤的基因表達(dá)譜與轉(zhuǎn)移部位組織的基因表達(dá)譜存在差異，而與其原發(fā)部位組織的基因表達(dá)譜更相似，提示腫

27、瘤在其發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移的過(guò)程中，始終保留其組織起源的分子特征2，3。因此，基因表達(dá)譜檢測(cè)可在分子水平揭示腫瘤的組織起源，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤的分型?！緳z驗(yàn)原理】本產(chǎn)品基于實(shí)時(shí)熒光PCR平臺(tái)，檢測(cè)腫瘤樣本RNA中組織特異基因的表達(dá)模式，并與參考數(shù)據(jù)庫(kù)中已知腫瘤類型的基因表達(dá)模式進(jìn)行比對(duì)，判斷待測(cè)腫瘤樣本組織起源。本產(chǎn)品利用特異引物對(duì)90種組織特異基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并通過(guò)TaqMan-MGB探針對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，在實(shí)時(shí)熒光PCR平臺(tái)上獲取樣本組織特異基因的表達(dá)模式。采用腫瘤組織起源基因分析軟件對(duì)待測(cè)樣本的基因表達(dá)模式進(jìn)行分析，軟件可自動(dòng)比較待測(cè)樣本與已知組織起源的腫瘤基因表達(dá)模式之間的相關(guān)性，從而判

28、斷待測(cè)腫瘤樣本的組織起源。腫瘤組織起源基因分析軟件參考數(shù)據(jù)庫(kù)涵蓋以下適用的14種腫瘤類型 19 的基因表達(dá)模式：乳腺癌、宮頸癌、結(jié)直腸癌、胃及食管癌、腎癌、肝膽腫瘤、肺癌、黑色素瘤、神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤、卵巢癌、前列腺癌、生殖細(xì)胞腫瘤、甲狀腺癌及尿路上皮癌。本產(chǎn)品選用人源管家基因作為內(nèi)部參照（以下簡(jiǎn)稱內(nèi)參，InternalControl（IC）系統(tǒng)，對(duì)樣本RNA提取、逆轉(zhuǎn)錄和PCR反應(yīng)過(guò)程進(jìn)行質(zhì)量控制?！局饕M成成分】1. 本試劑盒主要組成及組分如下：表1 試劑盒組成及組分表編號(hào) 組分名稱 主要成分 數(shù)量1 逆轉(zhuǎn)錄預(yù)混試劑 引物、脫氧核糖核苷三磷酸（dNTP） 1管（250L/管）2 逆轉(zhuǎn)錄酶 RN

29、A依賴性DNA聚合酶 1管（55L/管）3 RNA酶抑制劑 抑制劑酶 1管（15L/管）4 PCR擴(kuò)增預(yù)混試劑DNA聚合酶、脫氧核糖核苷三磷酸（dNTP）1瓶（11mL/瓶）5 探針引物預(yù)混板 引物、熒光探針 10板（4L/孔，96孔/板）6 陽(yáng)性對(duì)照品 人源乳腺癌組織總RNA 1管（10L/管）7 陰性對(duì)照品 人源淋巴細(xì)胞系總RNA 1管（10L/管）8 稀釋液 無(wú)核酸酶水 1瓶（8mL/瓶）9 透光膜 1袋（10張/袋）10 加樣槽 2袋（5個(gè)/袋，共10個(gè)）注意：1）隨意替換試劑盒中的任何試劑，都可能影響使用效果。不同批號(hào)試劑盒中各組分不可相互混用。 20 2）其中，探針引物預(yù)混板（96

30、 孔 PCR 反應(yīng)板）布局，如下表：表 2 探針引物預(yù)混板布局 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12A IC Gene Gene Gene Gene Gene Gene Gene Gene Gene 1 2 3 4 5 6 7 8 9B Gene Gene Gene Gene Gene Gene Gene Gene Gene Gene Gene Gene 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21C Gene Gene Gene Gene Gene Gene Gene Gene Gene Gene Gene Gene 22 23 24 25 26 2

31、7 28 29 30 31 32 33D Gene Gene Gene Gene Gene Gene Gene Gene Gene Gene Gene Gene 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45E Gene Gene Gene Gene Gene Gene Gene Gene Gene Gene Gene Gene 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57F Gene Gene Gene Gene Gene Gene Gene Gene Gene Gene Gene Gene 58 59 60 61 62 63 64 65 6

32、6 67 68 69G Gene Gene Gene Gene Gene Gene Gene Gene Gene Gene Gene Gene 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81H Gene Gene Gene Gene Gene Gene Gene Gene Gene NTC 82 83 84 85 86 87 88 89 90其中A2為待測(cè)樣本內(nèi)參基因（IC）檢測(cè)孔，H11為無(wú)模板對(duì)照（NTC）檢測(cè)孔，A1、A12、H1和H12孔未預(yù)置探針引物，剩余90孔為待測(cè)樣本組織特異性基因檢測(cè)孔。2. 試劑盒不包含但檢測(cè)必須的試劑組分：RNA 提取試劑盒：杭州可幫

33、基因科技有限公司的石蠟包埋組織總 RNA 提取試劑盒（吸附柱法）（浙杭械備 20170206 號(hào)）。3. 完成本檢測(cè)所需的其他儀器和耗材：1）無(wú)核酸酶的移液器吸嘴；2）無(wú)核酸酶的1.5mL離心管及0.2mL PCR管；3）微量紫外分光光度計(jì)；4）掌上離心機(jī)；5）96孔板離心機(jī)； 21 6）恒溫金屬浴/PCR儀（可選，用于逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)）；7）單通道移液器、多通道移液器；8）96孔板透光膜敷貼器；9）聯(lián)網(wǎng)且已安裝腫瘤組織起源基因分析軟件的電腦。4. 試劑盒質(zhì)控品主要組成成分及生物學(xué)來(lái)源：1）陽(yáng)性對(duì)照品是外購(gòu)商品化人源總 RNA；來(lái)源于乳腺癌組織，濃度為100ng/L10ng/L；相似度分?jǐn)?shù)45.3，

34、判讀結(jié)果為乳腺癌。2）陰性對(duì)照品是外購(gòu)商品化人源總 RNA；來(lái)源于淋巴細(xì)胞系，濃度為100ng/L10ng/L；相似度分?jǐn)?shù)45.3，判讀結(jié)果為陰性。【儲(chǔ)存條件及有效期】1. 試劑盒有效期：在-15-25保存，有效期為 12 個(gè)月。試劑盒生產(chǎn)日期、失效日期：見(jiàn)標(biāo)簽。2. 運(yùn)輸條件：不高于 8條件下運(yùn)輸。收到貨后試劑盒需-15-25保存。試劑盒開(kāi)封后有效期為 12 個(gè)月，其中透光膜及加樣槽建議開(kāi)封后室溫保存，PCR 擴(kuò)增預(yù)混試劑和稀釋液開(kāi)封后 28保存，其余試劑-15-25保存；避免反復(fù)凍融，凍融次數(shù)不超過(guò) 5 次。【適用儀器】1. 本試劑盒適用于 ABI7500 熒光 PCR 儀。2. 使用 A

35、BI7500 熒光 PCR 儀時(shí)探針模式設(shè)置，報(bào)告基團(tuán)：FAM，參比熒光染料：ROX?！緲颖疽蟆?22 1. 適用樣本類型：福爾馬林固定、石蠟包埋（FFPE）病理組織切片，切片厚度推薦為 5m10m。切片表面積推薦為 0.5cm21.0cm2，切片用量推薦為 5 張15 張，如果組織小于 0.5cm2，請(qǐng)適當(dāng)增加切片用量。2.手術(shù)前接受任何治療（如放化療、靶向治療、新輔助化療等）的腫瘤患者的 FFPE 樣本；穿刺樣本（包括粗針穿刺和細(xì)針穿刺樣本）；冰凍樣本、塑膠包被的樣本、細(xì)胞塊或者細(xì)胞學(xué)樣本，均不適用于本產(chǎn)品。3. 福爾馬林固定和石蠟包埋的程序會(huì)導(dǎo)致核酸的片段化和核酸分子間的交聯(lián)。為了保證

36、提取得到的 RNA 質(zhì)量，在 FFPE 樣本制備過(guò)程中，請(qǐng)根據(jù)臨床技術(shù)操作規(guī)范-病理學(xué)分冊(cè)進(jìn)行常規(guī)脫水、透明、浸蠟、石蠟包埋4。4. RNA提取液需用微量紫外分光光度計(jì)測(cè)定濃度和純度，RNA濃度應(yīng)60ng/L且其A260/A280應(yīng)在1.72.1。提取的RNA建議立即進(jìn)行檢測(cè)，否則請(qǐng)于-70-80保存，保存時(shí)間不超過(guò)6個(gè)月，凍融次數(shù)不超過(guò)3次。5. 石蠟包埋組織一般選擇保存未超過(guò)3年的樣本，盡量避免壞死組織及石蠟邊緣，所取部分盡量在蠟塊中部。6. 樣本或經(jīng)富集處理后樣本的腫瘤細(xì)胞比例60%，壞死組織比例40%。【檢驗(yàn)方法】1. 樣本 RNA 的提取及濃度、純度測(cè)定1.1 RNA提?。壕唧w請(qǐng)參照

37、石蠟包埋組織總RNA提取試劑盒（吸附柱法） 23 的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。1.2 RNA 濃度和純度測(cè)定：對(duì)步驟 1.1 中提取的 RNA 進(jìn)行濃度和純度測(cè)定，如下：1）打開(kāi)微量紫外分光光度計(jì)，選擇“核酸模式”，選擇檢測(cè)的樣本類型“RNA”；2）取石蠟包埋組織總RNA提取試劑盒（吸附柱法）中的RNA洗脫液1L，選擇“背景扣除/空白對(duì)照”；3）取1L RNA溶液，測(cè)定其濃度和A260/A280比值。注意：RNA濃度60ng/L且A260/A280比值在1.72.1范圍內(nèi)，即可進(jìn)行下步反應(yīng)。如果提取的RNA未同時(shí)滿足上述條件，請(qǐng)重新抽提。2. 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)2.1 解凍逆轉(zhuǎn)錄預(yù)混試劑，振蕩混勻，5000rpm瞬

38、時(shí)離心10秒。依據(jù)所需檢測(cè)樣本數(shù)量按下表比例計(jì)算，并在無(wú)核酸酶的1.5mL離心管中配制逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液。建議每次逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，均設(shè)置無(wú)模板對(duì)照，準(zhǔn)備n+1（n為待測(cè)樣本，1為無(wú)模板對(duì)照）管逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液。表3 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液配制比例表（/管）組成成份 體積（L）/管逆轉(zhuǎn)錄預(yù)混試劑 12逆轉(zhuǎn)錄酶 2.5RNA酶抑制劑 0.7總計(jì) 15.22.2 將上述混合液用移液器吹打混勻，5000rpm瞬時(shí)離心10秒； 24 2.3 取適量0.2mL PCR管/1.5mL離心管，每管分裝15.2L逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液；2.4 取其中一管逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)管，加入35L稀釋液，吹打混勻，作為無(wú)模板對(duì)照；2.5 向其余反應(yīng)管中分別加入35

39、L待測(cè)樣本RNA或已稀釋的陽(yáng)性對(duì)照品或陰性對(duì)照品，吹打混勻；注意：陽(yáng)性對(duì)照品和陰性對(duì)照品進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)前，需在冰上進(jìn)行解凍，5000rpm瞬時(shí)離心10秒后，在對(duì)應(yīng)試劑管中懸空加入25L的稀釋液，制備成已稀釋的陽(yáng)性對(duì)照品或陰性對(duì)照品。其他操作同待測(cè)樣本。2.6 將所有反應(yīng)管5000rpm瞬時(shí)離心10秒；2.7 將反應(yīng)管放入恒溫金屬浴/PCR儀中進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，反應(yīng)條件如下：表4 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)程序步驟1 步驟2 步驟3 步驟4溫度 25 37 85 4 時(shí)間 10 分鐘 120 分鐘 5 分鐘 2.8 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)完成后，反應(yīng)產(chǎn)物cDNA溶液可用于后續(xù)PCR擴(kuò)增。若不能立即進(jìn)行擴(kuò)增，可將cDNA溶液在

40、28保存，保存時(shí)間不宜超過(guò)24小時(shí)。3. PCR 擴(kuò)增3.1 根據(jù)所檢測(cè)樣本數(shù)取出n（n為待測(cè)樣本）個(gè)加樣槽，在每一個(gè)加樣槽中分別加入1080L的PCR擴(kuò)增預(yù)混試劑和598L的稀釋液；3.2 將步驟2.8中待測(cè)樣本的全部逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物分別轉(zhuǎn)移至步驟3.1加樣槽中，進(jìn)行稀釋，移液器吸打混勻； 25 注意：反應(yīng)組分已經(jīng)包含了富余量。3.3 根據(jù)所檢測(cè)樣本數(shù)取出n（n為待測(cè)樣本）塊探針引物預(yù)混板，將探針引物預(yù)混板解凍，振蕩混勻，2500rpm轉(zhuǎn)速離心1分鐘，使得每個(gè)反應(yīng)孔內(nèi)的探針引物離心至管底；每塊探針引物預(yù)混板只能用于一份cDNA樣本進(jìn)行PCR擴(kuò)增；3.4 輕輕揭開(kāi)探針引物預(yù)混板的封板膜；3.5 在N

41、TC孔（H11孔）中分別加入10L PCR擴(kuò)增預(yù)混試劑、6L NTC逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，作為PCR擴(kuò)增的無(wú)模板對(duì)照；3.6 使用多通道移液器吸取步驟3.2中的混合液16L，分別加入探針引物預(yù)混板的其余每個(gè)反應(yīng)孔內(nèi)；注意：使用多通道移液器加樣時(shí)，H11孔勿加入混合液。3.7 用透光膜密封探針引物預(yù)混板，振蕩混勻，2500rpm轉(zhuǎn)速離心1分鐘。注意：陽(yáng)性對(duì)照品和陰性對(duì)照品的PCR擴(kuò)增操作同待測(cè)樣本。4. PCR 反應(yīng)板加載4.1 將探針引物預(yù)混板放入實(shí)時(shí)熒光 PCR 儀器；4.2 打開(kāi)儀器窗口，選擇相對(duì)定量反應(yīng)，進(jìn)行樣品板設(shè)置，其中“探針名”設(shè)置為Origin-PanCA， “樣品名”為對(duì)應(yīng)樣本編號(hào)，對(duì)P

42、CR反應(yīng)板的96孔均指定上述探針名和樣品名；選擇20L反應(yīng)體系，創(chuàng)建循環(huán)參數(shù)：第一階段：95 10分鐘 1個(gè)循環(huán)；第二階段：95 15秒 60 1分鐘 40個(gè)循環(huán)。信號(hào)收集：第二階段60時(shí)收集FAM信號(hào)，執(zhí)行熒光PCR；保存文件。 26 4.3 在完成PCR反應(yīng)后，自動(dòng)導(dǎo)出PCR數(shù)據(jù)。5. 質(zhì)量控制5.1 檢測(cè)無(wú)模板對(duì)照（NTC）的熒光信號(hào)（H11孔），用于判斷是否存在體系污染：1）若Ct值38，或者Ct值無(wú)顯示，無(wú)擴(kuò)增曲線，則繼續(xù)分析；2）若Ct值38，則說(shuō)明體系可能存在污染，試驗(yàn)結(jié)果不可信，需重新提取。5.2 檢測(cè)內(nèi)參基因（IC）的熒光信號(hào)（A2孔），用于評(píng)估被檢測(cè)RNA的質(zhì)量：1）若Ct

43、值38，則繼續(xù)分析；2）若Ct值38，說(shuō)明RNA可能存在部分片段化或降解，試驗(yàn)結(jié)果不可信，建議重新提取RNA后再進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。6. 數(shù)據(jù)上傳6.1 打開(kāi)腫瘤組織起源基因分析軟件客戶端，登錄后，輸入樣本臨床信息并上傳PCR數(shù)據(jù)；注意：實(shí)驗(yàn)前請(qǐng)及時(shí)使用腫瘤組織起源基因分析軟件安裝程序進(jìn)行客戶端的安裝，并根據(jù)軟件使用說(shuō)明進(jìn)行用戶注冊(cè)。6.2 軟件自動(dòng)對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)處理，獲得該樣本特異的基因表達(dá)模式；并與參考數(shù)據(jù)庫(kù)中儲(chǔ)存的各腫瘤類型基因表達(dá)模式進(jìn)行對(duì)比，腫瘤組織起源基因分析軟件自動(dòng)計(jì)算相似度分?jǐn)?shù)；獲得分析結(jié)果（見(jiàn)圖1 腫瘤組織起源基因檢測(cè)結(jié)果圖）。 27 【陽(yáng)性判斷值】1. 內(nèi)參基因（IC孔）Ct值38

44、。2. 無(wú)模板對(duì)照（NTC孔）Ct值38，或者Ct值無(wú)顯示，無(wú)擴(kuò)增曲線。3. 結(jié)果判定：腫瘤組織起源基因分析的相似度分?jǐn)?shù)陽(yáng)性判斷值為45.3。本試劑盒檢測(cè)結(jié)果通過(guò)配套使用的軟件進(jìn)行分析。該分析軟件核心算法基于腫瘤的基因表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行監(jiān)督學(xué)習(xí)，篩選特征基因，構(gòu)建分類模型，計(jì)算腫瘤樣本基因表達(dá)模式與算法分類模型中儲(chǔ)存的已知腫瘤類型的基因表達(dá)模式的相似度，實(shí)現(xiàn)對(duì)臨床樣本腫瘤類型的判別?！緳z驗(yàn)結(jié)果的解釋】1. 本產(chǎn)品可同時(shí)檢測(cè)樣本中90個(gè)組織特異基因的表達(dá)模式和1個(gè)內(nèi)參基因表達(dá)情況。2. 采用腫瘤組織起源基因分析軟件將樣本90個(gè)組織特異基因的表達(dá)模式與參考數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行對(duì)比，計(jì)算相似度分?jǐn)?shù)，根據(jù)相似度最高原

45、則判定該樣本的腫瘤類型。若相似度分?jǐn)?shù)最大值大于等于45.3，判別結(jié)果為陽(yáng)性，提示樣本最有可能起源于最高相似度分?jǐn)?shù)對(duì)應(yīng)的組織類型。若相似度分?jǐn)?shù)最大值低于45.3，提示檢測(cè)基因表達(dá)模式非特異，可能由于樣本中腫瘤組織成分過(guò)低，也可能該樣本所屬腫瘤類型沒(méi)有包括在參考數(shù)據(jù)庫(kù)中，因此判別結(jié)果為陰性。如圖1所示，該腫瘤樣本最有可能的3種組織來(lái)源分別為：乳腺、宮頸和肺，相似度分?jǐn)?shù)分別為97.3、1和0.4。根據(jù)相似度分?jǐn)?shù)最高的判定規(guī)則， 28 該腫瘤樣本最有可能來(lái)源于乳腺組織，因此判定為乳腺癌。圖1 腫瘤組織起源基因檢測(cè)結(jié)果圖注意：本產(chǎn)品不適用于腎上腺腫瘤、腦腫瘤、間皮瘤、胰腺癌、頭頸部鱗癌、子宮內(nèi)膜癌、肉瘤

46、的組織起源判定，當(dāng)檢測(cè)結(jié)果中最高相似度分?jǐn)?shù)對(duì)應(yīng)為上述腫瘤類型時(shí)，該樣本的組織起源判定結(jié)果為無(wú)法判別。3. 以最大相似度分?jǐn)?shù)45.3作為陽(yáng)性判斷值，對(duì)診斷明確的臨床腫瘤樣本的組織起源或類型進(jìn)行判定，分別計(jì)算14種腫瘤類型的陽(yáng)性符合率和陰性符合率，結(jié)果如下：腫瘤類型 陽(yáng)性符合率 陰性符合率乳腺癌 100.00% 100.00%宮頸癌 93.33% 99.39%結(jié)直腸癌 93.33% 99.60%胃及食管癌 89.47% 98.77%腎癌 96.00% 100.00%肝膽腫瘤 96.00% 99.20%肺癌 95.12% 99.59% 29 黑色素瘤 100.00% 100.00%神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤 9

47、4.12% 100.00%卵巢癌 93.75% 99.59%前列腺癌 100.00% 100.00%生殖細(xì)胞腫瘤 91.67% 100.00%甲狀腺癌 100.00% 100.00%尿路上皮癌 96.15% 99.80%【檢驗(yàn)方法的局限性】1. 本試劑盒的檢測(cè)結(jié)果僅供臨床參考，對(duì)患者的診斷應(yīng)結(jié)合其癥狀/體征、病史、影像學(xué)檢查及其他實(shí)驗(yàn)室檢查等情況綜合考慮。2. 本試劑盒僅適用于包含在參考數(shù)據(jù)庫(kù)中的 14 種腫瘤類型。當(dāng)檢測(cè)結(jié)果為陰性或無(wú)法判別時(shí)，提示該樣本可能屬于 14 種以外的其他腫瘤類型；或該樣本中 RNA 濃度較低，不在本試劑盒檢測(cè)能力范圍內(nèi)。3. 惡性腫瘤在轉(zhuǎn)移過(guò)程中易發(fā)生分子特征的改

48、變，導(dǎo)致腫瘤特征基因的表達(dá)特異性降低，使得本試劑盒在轉(zhuǎn)移性腫瘤中的性能降低，可能造成判斷錯(cuò)誤。病理醫(yī)生應(yīng)參考患者的病史信息、影像學(xué)檢查和其他病理檢查結(jié)果，對(duì)受檢標(biāo)本的腫瘤類型和組織起源進(jìn)行綜合判斷。4. 本試劑盒不適用于區(qū)分良性與惡性病變，不適用于區(qū)分原發(fā)性腫瘤與轉(zhuǎn)移性腫瘤，不適用于區(qū)分腫瘤組織病理亞型，也不適用于評(píng)估腫瘤患者的治療效果和生存狀況。5. 腫瘤組織（細(xì)胞）可能存在較大異質(zhì)性，不同部位取樣可能會(huì)得到不同的檢測(cè)結(jié)果。 30 6. 不合理的樣本采集、轉(zhuǎn)運(yùn)及處理，以及不當(dāng)?shù)脑囼?yàn)操作和實(shí)驗(yàn)環(huán)境均有可能導(dǎo)致假陰性或假陽(yáng)性結(jié)果。7. 該檢測(cè)僅限于規(guī)定的樣本類型及檢測(cè)儀器和系統(tǒng)（包括適用機(jī)型、核

49、酸提取試劑、檢測(cè)方法、腫瘤組織起源基因分析軟件等）?！井a(chǎn)品性能指標(biāo)】1. 試劑盒應(yīng)組分齊全，包裝外觀清潔、無(wú)漏液、無(wú)破損；標(biāo)志標(biāo)簽字跡清楚。試劑融化后，應(yīng)澄清，無(wú)渾濁。2. 準(zhǔn)確度1）陽(yáng)性符合率：檢測(cè)28份企業(yè)陽(yáng)性參考品，檢測(cè)結(jié)果應(yīng)分別為對(duì)應(yīng)的腫瘤類型，陽(yáng)性符合率100%。2）陰性符合率：檢測(cè)8份企業(yè)陰性參考品，檢測(cè)結(jié)果均為陰性，陰性符合率100%。3）臨床樣本準(zhǔn)確度：檢測(cè)90份病理診斷明確的低分化或未分化腫瘤和轉(zhuǎn)移性腫瘤臨床樣本，準(zhǔn)確性為100%。3. 分析特異性：選取14種腫瘤臨床樣本，同步檢測(cè)每例樣本的腫瘤組織及其癌旁組織，檢測(cè)結(jié)果均能準(zhǔn)確鑒別腫瘤組織與癌旁組織的不同起源。4. 最低檢測(cè)

50、限：檢測(cè)14份企業(yè)腫瘤類型最低檢測(cè)限參考品，檢測(cè)結(jié)果應(yīng)分別為對(duì)應(yīng)的腫瘤類型；檢測(cè)1份企業(yè)基因表達(dá)最低檢測(cè)限參考品，重復(fù)檢測(cè)3次，每個(gè)基因的Ct值應(yīng)均38；檢測(cè)腫瘤細(xì)胞比例60%的14種腫瘤樣本，檢測(cè)結(jié)果分別為對(duì)應(yīng)的腫瘤類型，且基因表達(dá)Ct值與數(shù)字PCR驗(yàn)證結(jié)果符合。 31 5. 精密度1）重復(fù)性：分別檢測(cè)1份企業(yè)弱陽(yáng)性重復(fù)性參考品和1份企業(yè)強(qiáng)陽(yáng)性重復(fù)性參考品，每份參考品重復(fù)檢測(cè)10次，每個(gè)基因的Ct值變異系數(shù)CV應(yīng)不高于5%。2）采用腫瘤臨床樣本分別對(duì)試驗(yàn)日內(nèi)/間、操作者間、實(shí)驗(yàn)室間精密度進(jìn)行評(píng)價(jià)，檢測(cè)結(jié)果（相似度分?jǐn)?shù)最大值）變異系數(shù)CV均不高于15%。6. 包容性研究：選擇本試劑盒檢測(cè)范圍內(nèi)

51、的14種腫瘤類型及相關(guān)亞型，具體包括：乳腺癌（乳腺導(dǎo)管癌、乳腺小葉癌）、宮頸癌（宮頸鱗癌、宮頸腺癌）、結(jié)直腸癌（結(jié)腸癌、直腸癌）、胃及食管癌（胃癌、食管癌）、腎癌（嫌色細(xì)胞癌、透明細(xì)胞癌、乳頭狀腎癌）、肝膽腫瘤（肝細(xì)胞肝癌、膽管細(xì)胞癌）、肺癌（肺腺癌、細(xì)支氣管肺泡癌、肺大細(xì)胞癌、肺鱗癌）、黑色素瘤（皮膚黑色素瘤、眼黑色素瘤）、神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤（肺小細(xì)胞癌、胰腺神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤）、卵巢癌（卵巢內(nèi)膜樣腺癌、卵巢漿液性腺癌、透明細(xì)胞癌、粘液性癌）、前列腺癌（前列腺腺癌）、生殖細(xì)胞腫瘤（生殖細(xì)胞瘤、精原細(xì)胞瘤、胚胎癌、畸胎瘤、卵黃囊瘤）、甲狀腺癌（甲狀腺乳頭狀癌、甲狀腺濾泡狀癌）、尿路上皮癌（膀胱尿路上皮癌、上尿路上皮癌）。7. 干擾物質(zhì)研究：1）外源性干擾物質(zhì)：評(píng)估FFPE樣本在處理過(guò)程中可能受酒精、福爾馬林和石蠟的影響，當(dāng)酒精濃度1%V/V、福爾馬林0.005%V/V、石蠟 32 1%V/V時(shí)，對(duì)本試劑盒的檢測(cè)結(jié)果不產(chǎn)生干擾。2）內(nèi)源性干擾物質(zhì)：當(dāng)待測(cè)樣本中癌旁