分子生物學(xué)檢驗技術(shù)：第十二章 腫瘤的分子生物學(xué)檢驗

1、第12章腫瘤的分子生物學(xué)檢驗檢生學(xué)院 季敬璋1第一節(jié) 腫瘤診斷的生物標(biāo)志物1. 原位性腫瘤相關(guān)物質(zhì)如：前列腺特異性抗原 （PSA） 前列腺癌；2. 異位性腫瘤相關(guān)物質(zhì)如：神經(jīng)元特異性烯醇化酶（NSE） 小細(xì)胞肺癌；3. 胎盤和胎兒性腫瘤相關(guān)物質(zhì)如：甲胎蛋白（AFP） 肝癌；癌胚抗原（CEA）結(jié)腸癌；4. 病毒性腫瘤相關(guān)物質(zhì)，如：EB病毒的隱伏膜蛋白（LMP）鼻咽癌屬于免疫學(xué)檢驗診斷范疇2一. 腫瘤相關(guān)的染色體異常熒光原位雜交熒光定量PCR多重連接探針擴增技術(shù)微陣列比較基因組雜交白血病診斷染色體異常分析34二. 腫瘤相關(guān)的基因異常癌基因 又稱原癌基因（proto-oncogene ），是一類在細(xì)

2、胞的增殖、分化和信息傳遞過程中起重要調(diào)控作用的基因。突變、擴增、重排、低甲基化狀態(tài)等變異可導(dǎo)致其正常的結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生改變，稱為原癌基因的活化。這種活化了的基因的生物學(xué)功能會發(fā)生時間和空間的錯位，從而在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中起促進作用。如：ras、myc、erbB、mdm2，等表12-1：大致了解567c-abl原癌基因的易位激活 c-abl原癌基因，經(jīng)重排后插入到另一稱為bcr (break point cluster region)基因的啟動子之后， 9號和22號染色體長臂易位的結(jié)果。易位使9號染色體長臂（9q34）上的原癌基因abl和22號染色體(22q11)上的bcr基因重新組合成融合基因

3、。后者具有增高了的酪氨酸激酶活性，而使其轉(zhuǎn)錄活性增加，從而引起慢性粒細(xì)胞性白血病的發(fā)生 （Philadelphia chromosome,Ph）Ph染色體已被公認(rèn)為慢性粒細(xì)胞性白血病的特異標(biāo)記染色體Bcr有一個可變性的模體，它和信號傳遞有關(guān)，具有ser/thr激酶活性，在此部位的蛋白具有自我磷酸化殘基，磷酸化后可與C-ABL的SH2功能區(qū)相互作用而改變構(gòu)象，從而激活了的C-ABL潛在致癌性8抑癌基因 一類大多在細(xì)胞的增殖過程中起負(fù)調(diào)節(jié)作用的基因，其致癌作用是在純合性缺失或失活的情況下才顯示出來，因而又被稱為隱性癌基因（recessive oncogene ）。缺失、突變、異常高甲基化狀態(tài)等是導(dǎo)

4、致其失活的主要原因。如：Rb、p53、p16、BRCA，等9細(xì)胞周期調(diào)節(jié)基因10細(xì)胞凋亡相關(guān)基因11Rb磷酸化對細(xì)胞周期的影響在 G0、 G1期，低磷酸化型的 Rb蛋白與 E-2F結(jié)合成復(fù)合物，使 E-2F處于非活化狀態(tài)；在S期，Rb蛋白被磷酸化而與E-2F解離，結(jié)合狀態(tài)的E-2F變成游離狀態(tài)，細(xì)胞立即進入增殖階段。當(dāng)Rb基因發(fā)生缺失或突變，喪失結(jié)合、抑制E-2F的能力，于是細(xì)胞增殖活躍，導(dǎo)致腫瘤發(fā)生。E2F蛋白與DP蛋白結(jié)合能夠活化一系列由G1期進入S期所必需的基因的表達(dá),細(xì)胞立即進入增殖階段12P53-基因組衛(wèi)士（guardian of the genome）p53基因突變后，由于其空間構(gòu)

5、象發(fā)生改變，失去了對細(xì)胞生長、凋亡和DNA 修復(fù)的調(diào)控作用 在G1期檢查DNA損傷點，監(jiān)視基因組的完整性。如有損傷，p53蛋白阻止DNA復(fù)制，以提供足夠的時間使損傷DNA修復(fù)；如果修復(fù)失敗，p53蛋白則引發(fā)細(xì)胞凋亡；如果p53基因的兩個拷貝都發(fā)生了突變，對細(xì)胞的增殖失去控制，導(dǎo)致細(xì)胞癌變。 P53基因與人類50%的腫瘤有關(guān)有肝癌、乳腺癌、膀胱癌、胃癌、結(jié)腸癌、前列腺癌、軟組織肉瘤、卵巢癌、腦瘤、淋巴細(xì)胞腫瘤、食道癌、肺癌（80%）、成骨 肉瘤等13p53 基因異常與腫瘤腫瘤中p53的突變突變的形式是：點突變、缺失突變、插入突變、移碼突變、基因重排絕大多數(shù)突變集中在第5-8外顯子處，即“熱點突變

6、”。少數(shù)突變存在于其它外顯子或內(nèi)含子的剪切位點上p53大多數(shù)點突變是引起蛋白功能改變的錯義突變，少數(shù)是無義突變或終止碼突變14p16 基因又叫MTS（multiple tumor suppressor 1）基因p16基因定位于人染色體9p21，由2個內(nèi)含子及3個外顯子組成p16基因是細(xì)胞周期中的一種基本基因，其表達(dá)產(chǎn)物直接參與細(xì)胞增殖的負(fù)調(diào)節(jié)有人把它比作細(xì)胞周期中的剎車裝置，一旦失靈則會導(dǎo)致細(xì)胞惡性增殖，導(dǎo)致惡性腫瘤發(fā)生15p16基因體積小，只有p53的1/10在人類50%腫瘤細(xì)胞株中發(fā)現(xiàn)有純合子缺失，突變，認(rèn)為p16是比p53更重要的一種新型抗癌基因在肺癌、乳腺癌、腦腫瘤、骨腫瘤、皮膚癌、膀

7、胱癌、腎癌、卵巢癌和淋巴瘤、黑色素瘤中發(fā)現(xiàn)：p16 基因純合子缺失，無義、錯義移碼突變表明p16 基因以缺失，突變方式廣泛參與腫瘤形成，但多為純合性缺失，在腫瘤細(xì)胞系中可達(dá)80以上，在實體瘤中可達(dá)70左右檢測p16基因有無改變對判斷患者腫瘤的易感性以及預(yù)測腫瘤的預(yù)后，具有十分重要的臨床意義p16基因用于基因診療、更易操作，對臨床腫瘤治療更具有現(xiàn)實意義p16 基因16P16蛋白的生物學(xué)功能p16基因編碼產(chǎn)物是p16蛋白，定位于細(xì)胞核內(nèi)p16蛋白是作用于細(xì)胞分裂周期（cell division cycle，cdc）的關(guān)鍵酶之一是CDK（cyclin-dependent kinase）的抑制因子P1

8、6蛋白是細(xì)胞周期的直接抑制因子P16蛋白既是細(xì)胞周期的有效調(diào)控者又是抑制腫瘤細(xì)胞生長的關(guān)鍵因子不能合成促進DNA合成的酶，細(xì)胞就不能實現(xiàn)G1期到S期的過渡，導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯，從而抑制細(xì)胞的生長分化。17P16與RB的相互關(guān)系通常情況下，以去磷酸化形式存在的RB可抑制DNA合成，從而負(fù)調(diào)控細(xì)胞的生長，防止腫瘤的發(fā)生。P16抑制CDK4，可導(dǎo)致RB不被磷酸化，保持活性狀態(tài)，使細(xì)胞停滯于G1/S期，細(xì)胞增殖受阻。失活或磷酸化的Rb基因可釋放與RB結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子，游離轉(zhuǎn)錄因子可激活p16基因轉(zhuǎn)錄，造成p16高度表達(dá)，從而限制Rb基因的過度失活1819維持細(xì)胞基因組穩(wěn)定的相關(guān)基因-DNA修復(fù)基因腫瘤的重

9、要生物學(xué)標(biāo)志之一APE1與大腸癌XRCC3 241 Thr/Thr與肺癌MGMT、XRCC1與食管癌與腫瘤放、化療的敏感性密切相關(guān)核苷酸剪切修復(fù)（NER）堿基切除修復(fù)（BER）的相關(guān)基因預(yù)測腫瘤對放、化療的敏感性 20染色體不穩(wěn)定性癌化的細(xì)胞中常見到三倍體和單倍體染色體的缺失，還有染色體大片段的重排(插入、重復(fù)、缺失、倒轉(zhuǎn)、易位) 染色體之間或染色體本身的交互作用，可能也參與了細(xì)胞基因表達(dá)的調(diào)控利用FISH相關(guān)技術(shù)檢測染色體不穩(wěn)定性 多色熒光FISHDNA結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定 微衛(wèi)星染色體不穩(wěn)定性 異質(zhì)性丟失 維持細(xì)胞基因組穩(wěn)定的相關(guān)基因-基因組不穩(wěn)定性21腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)基因 22腫瘤血管生成相關(guān)基因 2

10、3三. 腫瘤相關(guān)的單核苷酸多態(tài)性24四. 腫瘤相關(guān)的表觀遺傳異常25腫瘤相關(guān)的miRNA 26非編碼-RNA：曾經(jīng)被認(rèn)為是毫無意義的多余物tRNArRNAsnRNAtmRNARnase P RNAvRNAsgRNAsMRP RNASRP RNAs端粒酶RNA轉(zhuǎn)錄/染色體結(jié)構(gòu)調(diào)節(jié)因子轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子蛋白功能調(diào)節(jié)因子RNA/蛋白定位調(diào)節(jié)因子RNA 轉(zhuǎn)錄 調(diào)節(jié)RNAmiRNAsiRNApiRNA反義 RNA編碼蛋白的mRNA 非編碼 RNA 轉(zhuǎn)錄核仁小RNAs管家 RNAs 非編碼-RNA在復(fù)雜的基因組學(xué)中起重要作用27microRNA 檢測28 microRNA（miRNA）是長度在1825個核苷酸左

11、右的內(nèi)源性非編碼小分子RNA。miRNA在進化上高度保守，具有轉(zhuǎn)錄后基因調(diào)控功能。它由基因組DNA編碼，在RNA聚合酶II的作用下被轉(zhuǎn)錄。這些小分子通過RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體（RNA-induced silencing complex, RISC）靶向到達(dá)mRNA，進而行使阻遏翻譯或引導(dǎo)酶切的功能。最近有研究表明，miRNA具有多種生物學(xué)功能，如調(diào)節(jié)細(xì)胞發(fā)育、分化、增殖、凋亡等。 29MiRNA生物合成基本過程 MiRNA調(diào)控基因表達(dá)兩種機制3031microRNAs腫瘤形成診斷 預(yù)后miR-9神經(jīng)母細(xì)胞瘤miR-10b乳腺癌miR-15, miR-15a白血病，垂體瘤miR-16, miR-

12、16-1白血病，垂體瘤miR-17-5p, miR-17-92肺癌，淋巴瘤miR-20a淋巴瘤，肺癌miR-21乳腺癌，膽管癌，頭頸腫瘤，白血病胰腺癌miR-29, miR-29b白血病，膽管癌miR-31結(jié)直腸癌miR-34a胰腺癌神經(jīng)母細(xì)胞瘤miR-96結(jié)直腸癌miR-98頭頸部腫瘤miR-103胰腺癌miR-107白血病，胰腺癌miR-125a, miR-125b神經(jīng)母細(xì)胞瘤，乳腺癌miR-128膠質(zhì)瘤miR-133b結(jié)直腸癌miR-135b結(jié)直腸癌miR-143結(jié)腸癌miR-145乳腺癌，結(jié)直腸癌miR-146甲狀腺癌32microRNAs腫瘤形成 診斷 預(yù)后miR-155, has-

13、miR-155乳腺癌，白血病，胰腺癌肺癌miR-181, imR-181a, imR-181b, imR-181c白血病，膠質(zhì)瘤，甲狀腺癌miR-183結(jié)直腸癌miR-184神經(jīng)母細(xì)胞瘤miR-193胃癌miR-196a-2胰腺癌miR-221膠質(zhì)瘤，甲狀腺癌胰腺癌miR-222甲狀腺癌miR-223白血病miR-301胰腺癌miR-376胰腺癌let-7, let-7a, let-7a-1, has-let-7a-2, let-7a-3肺癌，結(jié)腸癌肺癌Cho WC. MicroRNAs: potential biomarkers for cancer diagnosis, prognosis

14、 and targets for therapy. Int J Biochem Cell Biol 2010.Cho WC. OncomiRs: the discovery and progress of microRNAs in cancers. Mol Cancer 2007;6:60.33Cancer - multi-step and multi-gene diseaseCancerogenesis process series of eventsAll types of cancers are caused by changes in genes.Cancer - a genetic

15、disease of somatic cells.Cancer - the most common human genetic disease. Various independent gene mutations - breakdown of several pathways. All in all34Pathway Leading to Cancer35第二節(jié) 腫瘤的分子生物學(xué)檢驗技術(shù)1. 基因芯片2. 測序技術(shù)3. 分子病理學(xué)4. 分子影像技術(shù)5. 質(zhì)譜技術(shù)36P 2563738“癌癥指紋”蛋白指紋圖譜技術(shù)，實現(xiàn)高通量、高效率、高靈敏度和自動化分析篩查 蛋白芯片技術(shù)SELDI-TOF-M

16、S飛行時間質(zhì)譜技術(shù)Detector N-LaserTOF-MSTrace ViewGel ViewMap View 化學(xué)表面 蛋白質(zhì)表達(dá)剖析 :(反相疏水) (陰離子)(金屬離子)(正相親水)(陽離子)(PS-1 or PS-2)(抗體 抗原)(受體- 配體)(DNA 蛋白質(zhì))生物表面 蛋白質(zhì)相互作用檢測:39Difference mapPatientControlGelViewTM蛋白芯片蛋白指紋圖40胃癌蛋白指紋圖1 基本信息：2 蛋白指紋譜圖：3 印象：檢測到陽性的胃癌蛋白指紋（4595Da，5335Da，5898Da），根據(jù)治療情況隨診，必要時復(fù)查。蛋白指紋圖譜分析 41第三節(jié) 腫瘤分

17、子生物學(xué)檢驗的臨床應(yīng)用4243腫瘤臨床分子生物學(xué)檢驗診斷內(nèi)容診斷預(yù)后評估判定治療效果分子內(nèi)容基因突變基因表達(dá)有無類型位置效應(yīng)有無水平效應(yīng)臨床應(yīng)用檢測技術(shù)PCR基因測序蛋白芯片核酸雜交免疫化學(xué)44診斷內(nèi)容樣本內(nèi)容與遺傳有關(guān)的基因突變檢測技術(shù)PCR基因測序蛋白芯片基因測序免疫化學(xué)血液腫瘤組織血漿DNA變化血漿變中癌基因表達(dá)檢測腫瘤標(biāo)志物的檢測腫瘤細(xì)胞的基因突變腫瘤細(xì)胞的基因表達(dá)腫瘤細(xì)胞的蛋白表達(dá)PCR腫瘤臨床分子生物學(xué)檢驗45三、腫瘤的分子診斷內(nèi)容（4） 腫瘤分子遺傳學(xué)診斷46第三節(jié) 腫瘤分子生物學(xué)檢驗的臨床應(yīng)用乳腺癌47BRCA1 and BRCA2 are human genes that b

18、elong to a class of genes known as tumor suppressors. In normal cells, BRCA1 and BRCA2 help ensure the stability of the cells genetic material (DNA) and help prevent uncontrolled cell growth. Mutation of these genes has been linked to the development of hereditary breast and ovarian cancer. The name

19、s BRCA1 and BRCA2 stand for breast cancer susceptibility gene 1 and breast cancer susceptibility gene 2, respectively.48BRCA1 and BRCA2gene involved in 4% of all female cancers. In 1994, two breast cancer susceptibility genes were identified: BRCA1 on chrm. 17 BRCA2 on chrm. 13 Mutation - risk of br

20、east or ovarian cancer. 49How does the loss of BRCA protein cause cancer susceptibility?DNA repair defectivedisruption of p53 functionaccumulation of new DNA gene mutationsloss of tumour suppressor genesactivation of oncogenesproliferation of mutant cell types hyperplasia dysplasia carcinoma增生畸形 發(fā)育異

21、常、結(jié)構(gòu)異常 癌50How does a BRCA gene mutation cause cancer susceptibility?cell makes 50% of usual amount of BRCA proteincell functions normallysecond hit result: no BRCA protein is madeDNA not repairedBRCA geneBRCA proteinDNA damage repairwith time .inherited BRCA1 gene mutationnew BRCA1 gene mutationinhe

22、rited BRCA1 gene mutationDNA damagecell with no BRCA proteinBRCA1 proteincells blood vesselDNA damagedysplasiaCancer cells51Type of Cancer General Population That Will Develop Disease People With BRCA1 Mutation Who Will Develop Disease People With BRCA2 Mutation Who Will Develop Disease Breast 12.5%

23、 55 85% 33 86% Ovarian 1.43% 28 44% 10 30% Prostate 4 6% 12 18% 12 18%Male breast cancer Less than 1% 6% 4 14% Pancreatic 0.6% not applicable 6 7% 52c-erb B-2/HER2基因5354識別早期乳腺癌的有效指標(biāo)分子分型依據(jù)表12-6IHC (for HER2 protein) and FISH55Screening for Breast CancerMonthly breast self-examClinical breast exam eve

24、ry 6 months 25Annual Mammogram 25, Bi-annual 50Discuss +/- of prophylactic mastectomy with MDScreening for Ovarian CancerAt least annual rectovaginal pelvic examCA 125 and transvaginal ultrasound Prophylactic bilateral oophorectomy by age 355657乳腺癌分子生物學(xué)檢測的意義 P 223降低風(fēng)險，安全更放心，關(guān)心自己，更關(guān)愛家人保乳手術(shù)的術(shù)式選擇：BRCA突

25、變攜帶者乳腺癌復(fù)發(fā)或?qū)?cè)乳腺癌風(fēng)險可高達(dá)70%-80%，因此基因突變攜帶者不宜做保乳手術(shù)，還是以乳腺切除術(shù)為好。某些婦女可預(yù)防切除另一側(cè)乳腺。遺傳性乳腺癌并非不可預(yù)知，關(guān)鍵在于加強監(jiān)測、早期診斷、早期治療。如果檢出BRCA突變，可盡早采取有效的防治措施，降低癌癥危險度，保障健康人生，同時，可以告知家族成員接受BRCA檢測，了解自身癌癥風(fēng)險。58乳腺癌分子生物學(xué)檢測適宜人群 (如果有以下因素，強烈建議接受乳腺癌BRCA檢查) 一個或多個直系親屬有乳腺癌史，如母親或姐妹 家族成員里有早發(fā)乳腺癌患者，發(fā)病年齡早于40歲 家族成員里兩代以上出現(xiàn)乳腺癌患者 家族成員有雙側(cè)乳腺癌患者 家族成員里有卵巢癌患

26、者 家族成員有男性成員乳腺癌患者 一個或多個家族成員攜帶BRCA基因突變，即遺傳檢測陽性 59CML的細(xì)胞遺傳學(xué)特征/scitable/nated/content/25070/2326Ph1Chromosome_EBesa_mid_1.jpghttp:/www.meb.uni-bonn.de/Media/CDR0000533336.jpg60t(9;22) results in the chimeric BCR/ABL fusion gene.The chimeric BCR/ABL fusion gene (present in 99% of CML patients) produces a

27、 hybrid tyrosine kinase p210BCR/ABL which is constitutively active, leading to autophosphorylation of proteins in signaling pathways (deregulation of TK)increased proliferation of affected cell lines with eventual domination in the CML patientCML的細(xì)胞遺傳學(xué)特征6162The BCR/ABL gene product p210BCR/ABLAnti-a

28、poptotic effects, leading to long-lived CML affected cells (survival advantage)Loss/reduction of the ability of CML affected hematopoietic cells to bind stromal cells in the bone marrow, leading to premature release into the peripheryCML的細(xì)胞遺傳學(xué)特征63CML 診斷技術(shù) Focus on two main techniques:Fluorescence in

29、-situ hybridization (FISH) for detection of t(9;22) Reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR) detection of t(9;22)64FISH for detection of t(9;22) short probes (100-300 bp), constructed via PCR, consisting of a known DNA sequence labeled directly with fluorescently labeled nucleotides

30、(in RT-PRC or via nick translation) indirectly using a ligand (i.e. biotin or digoxigenin) against which a fluorescently labeled Ab can be applied 65FISH for detection of t(9;22)The probes can be used with either metaphase chromosomes (involved preparation, poor resolution Mbp level) or with interph

31、ase chromosomes (easier to obtain and better resolution (i.e. 10000 bp)Probes and target DNA are denatured; probes are then hybridized to the patient sample. UV light is used for visualization 66FISH in action/scitable/nated/content/35120/10.1038_nrg1692-f1_mid_1.jpg67FISHing for CML:Directly labele

32、d probes spanning the breakpoint regions of the ABL and BCR genes are applied to metaphase or interphase chromosomes, Ph+ cells obtained from peripheral bloodTRITC (red) for BCR on ch 22, FITC (green) for ABL on ch 9If the BCR/ABL fusion gene is present, a YELLOW fusion signal will appear68FISH appl

33、ication in CML6970Advantages of FISH:Can use peripheral blood Can use BM smears for hybridization experiments -Good resolution obtainable from easily obtained interphase chromosomesReduced false positives and false negatives with larger probes spanning the gene breakpoints (vs older method using pro

34、bes upstream and downstream of the genes)Adds value and diagnostic power when combined with other methods (i.e. karyotype analysis)71Disadvantages of FISHNon-specific probe hybridization or detection Ab binding leading to background interferenceLow resolution of metaphase based hybridization experim

35、entsPotential for false positives/negatives with variation in breakpoint regions Not optimal for MRD testing (qualitative method, and could miss some BCR/ABL pos cells if at very low numbers)CML without Ph+ or CML with a variant translocation resulting in a BCR/ABL gene may not generate typical sign

36、als, leading to false positive or negative results72Reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR) detection of t(9;22)PB or BM cells are collected, lysed, and mRNA is collectedReverse transcriptase enzyme uses mRNA as a template for the generation of complementary DNA (cDNA). cDNA can then be used in a PCR reaction to amplify the gene productThe amplicons can then be sequenced, or transfected into cells for protein production and quantitation 73RT-PCR for