噬菌體的檢查研究方法

1、噬菌體的檢查研究方法【摘要】噬菌體在普通顯微鏡下看不到，在電子顯微鏡下有四種外形，即有尾(均有一立方對稱的頭及螺旋對稱的尾)、立方體(無尾，衣殼為立方對稱)、絲桿狀(無頭尾區(qū)別，呈螺旋對稱)，和多形性(有包膜無衣殼)。大多數(shù)噬菌體由頭部和尾部組成。例如大腸桿菌t4噬菌體頭部呈六邊形，立體對稱，大小約9565n，內(nèi)含遺傳物質(zhì)核酸；尾部是管狀器官，長95125n，直徑1320n，是由一個內(nèi)徑約2.5n中空的尾髓和外面包著的尾鞘組成。尾髓具有收縮功能，可使頭部核酸注入宿主菌。在頭和尾連接處的頸部還有一個頸圈構(gòu)造，頸圈有六根須。尾部末端有尾板、尾刺和尾絲。尾板內(nèi)可能有使宿主菌細(xì)胞壁裂解的溶菌酶。尾絲為

2、噬菌體的吸附器官，能識別宿主菌外表的特殊受體?！娟P(guān)鍵詞】噬菌體檢驗一、噬菌體的別離所有樣品必須是液體。土壤和其它污物可懸于適量液體培養(yǎng)基中。為了易于別離，可以預(yù)先經(jīng)過培養(yǎng)，使樣品中的噬菌體數(shù)量增加，這一步稱富集。其方法是將23g土樣或5l水放入滅菌三角瓶中，參加對數(shù)生長的敏感指示菌35l，并補加培養(yǎng)基2025l，在適宜溫度下振蕩或靜止培養(yǎng)過夜。假如樣品中有噬菌體，將隨細(xì)菌的生長繁殖而使噬菌體數(shù)量增多，因此到達富集目的。需要定量檢查相對噬菌體時，應(yīng)該省略上述操作，直接進展別離。將上述樣品液以3000rin離心或通過微孔濾膜(孔徑045)除去雜菌。有的實驗室采用氯仿消除雜菌，即在樣品上清液中參加1

3、50110體積氯仿，混合，渦動，保溫1h后取上清液。這種方法僅對氯仿不敏感的噬菌體適用。取消除雜菌后的上清液用肉湯或緩沖液，經(jīng)適當(dāng)稀釋后用雙層或單層瓊脂法檢查。二、溶原性細(xì)菌的檢查(一)自發(fā)釋放噬菌體的菌株檢查許多細(xì)菌自發(fā)釋放噬菌體，其頻率為10-210-5。從溶原菌中別離噬菌體，首先必須排除由噬菌體本身所攜帶的游離噬菌體，其次是選擇足夠數(shù)量的相近菌株。測定所釋放的噬菌體，關(guān)鍵是選擇敏感指示菌，才能在指示菌的菌苔上形成噬斑而加以區(qū)別。缺適宜的指示菌就不能獲得噬斑，也無法判斷是否釋放噬菌體和作出結(jié)論。1先在平板上挑選典型單菌落，在生理鹽水制成懸液，振蕩分散細(xì)胞，在3000rin離心30in，棄去

4、上清液，重懸在生理鹽水中，離心洗滌三次，取沉淀物適當(dāng)稀釋后，涂布在平板上，獲得單菌落，連續(xù)洗滌三次的目的是脫除所攜帶的噬菌體。2取上述處理的菌株培養(yǎng)物，按1的接種量接入10l培養(yǎng)基的三角瓶中，在適宜溫度(因菌不同而不同)下振蕩培養(yǎng)253h，或靜止培養(yǎng)過夜14h。3取對數(shù)生長的敏感指示菌培養(yǎng)物0.2l和稀釋的上清液0.1l混合。用雙層或單層瓊脂平板，鋪展上述混合物。在適宜溫度下培養(yǎng)。4凡出現(xiàn)噬斑的菌株，可證明該菌株是溶原性菌株；未出現(xiàn)噬斑的菌株：還不能確定為非溶原性菌株，可能需要尋找適當(dāng)?shù)闹甘揪?，再?jīng)過測定才能得出正確結(jié)論。(二)經(jīng)誘導(dǎo)產(chǎn)生噬菌體的菌株檢查有些溶原菌以極低的頻率產(chǎn)生噬菌體，而利用

5、常規(guī)方法無法檢測。假如利用紫外線或絲裂霉素誘導(dǎo)，可明顯進步噬菌體產(chǎn)生的幾率。紫外線誘導(dǎo)操作程序：1取對數(shù)生長的細(xì)菌懸液(5108l)，經(jīng)緩沖液洗滌，重懸在緩沖液中，配成108l。將5l懸液放入帶有一微型轉(zhuǎn)子的直徑9小皿中。2小皿放在電動攪拌器上，間隔 15紫外線燈管30處，燈管應(yīng)事先啟動30in后再照射。3在蔽光下開動攪拌器進展照射，以5s，10s，20s，30s，40s，50s和60s計時照射。4取出4l照射液，參加1l5倍濃縮培養(yǎng)基混合。移入所需溫度振蕩培養(yǎng)數(shù)小時，遮光。53000rin離心30in沉降細(xì)胞碎片，取上清液，適當(dāng)稀釋，用雙層或單層瓊脂法在指示菌平板培養(yǎng)，觀察噬斑。6凡有噬斑出

6、現(xiàn)的菌株為溶原性菌株。三、噬菌體的檢測如今普遍采用雙層法進展噬菌體的檢查和定量測定。事先分別配制含1.52.0和0.51瓊脂(因瓊脂質(zhì)量不同可加減變化)的兩種培養(yǎng)基。將2瓊脂培養(yǎng)基作底層，鋪成平板待用。取02l對數(shù)生長的菌懸液或用生理鹽水也可用培養(yǎng)基洗下生長旺盛的細(xì)菌斜面，配制菌懸液和被測定的噬菌體液或待測樣品液01l，參加已融化冷卻至45含有1瓊脂培養(yǎng)基34l，于試管中混合，立即倒在平板上鋪平凝固后，移入溫箱培養(yǎng)。一般經(jīng)過1020h(有些噬菌體培養(yǎng)在3745h)，即可觀察結(jié)果。如有噬菌體，在瓊脂的上層出現(xiàn)透亮的圓形或近似圓形的空斑。這是噬菌體感染敏感細(xì)胞后，釋放子代噬菌體，繼續(xù)向附近正在生長

7、的細(xì)菌侵染，通過幾次連續(xù)侵染，在瓊脂層不斷往外擴展，逐漸形成抑制和裂解細(xì)菌的區(qū)域，在菌苔上即可看到透明的斑，即噬菌斑(plaque)。1個直徑為0.5nnn的噬菌斑可能含有1056個噬菌體顆粒。噬斑是噬菌體的一種特性標(biāo)志，在一定條件下相對穩(wěn)定。但是隨著宿主生理條件，年齡以及培養(yǎng)條件如瓊脂的濃度、底層平板的厚度、培養(yǎng)溫度和時間會影響斑的變化。噬菌斑的形態(tài)有的形成暈圈，有的形成多重同心圓斑，也有近似圓形。斑的大小差異懸殊，一般直徑在0.12.0左右。在觀察和斷定噬斑時，往往與經(jīng)歷有關(guān)，可能在開場時會遇到不易判斷的困難。在難于做出結(jié)論時，建議將可疑的斑挑出，在生理鹽水中經(jīng)適當(dāng)稀釋后再按雙層瓊脂法分析，可以得出可靠無誤的結(jié)果。另一種簡易測定是單層法，即省略底層，而將含1瓊脂的培養(yǎng)基連同菌懸液和噬菌體液直接在平皿中鋪成平板。此法較雙層法簡便省料。為了確切定量，常用雙層法。四、噬茵體的保存大多數(shù)噬菌體在其增殖的培養(yǎng)基或肉湯中穩(wěn)定。效價到達1010pful以上的原液才適宜保存。密封或用螺旋帽蓋緊后，以石臘膜封閉保存在4(勿使結(jié)冰)。一般可保存數(shù)月至數(shù)年，隨不同噬菌體而異。最好的方法是保存在70，也可保存在液氮。參考文獻1朱興全,龔廣學(xué),薛富漢等.1993.旋毛蟲