加速衰老小鼠腦組織中的衰老相關(guān)基因的表達(dá)

1、PAGE PAGE 15加速衰老小鼠腦組織中的衰老相關(guān)基因的表達(dá)2004-03-18收稿，2004-05-18接受 國家重大基礎(chǔ)研究規(guī)劃項(xiàng)目（973）（No.2000016107）和北京靈泰必成醫(yī)藥技術(shù)有限公司資助 This research was funded by the grants from the State Basic Research Development Program “973” (No.2000016107), and Lingtai Bichen Medical Technology Co. Ltd., Beijing通迅作者(Corresponding author

2、). E-mail: qingxuanchen 動(dòng)物學(xué)報(bào) Acta Zoologica Sinica張 沖1,2 程錦雁1王錦剛3 陳清軒1* 1中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所，北京100080；2國科科學(xué)院研研究生院院，北京京10000399；3. 北北京靈泰泰必成醫(yī)醫(yī)藥技術(shù)術(shù)有限責(zé)責(zé)任公司司北京京11000086.摘 要 從分子子水平上上研究衰衰老對(duì)大大腦的影影響有助助于揭示示機(jī)體衰衰老的分分子機(jī)理理，也有有助于揭揭示衰老老相關(guān)性性腦功能能異常的的發(fā)生過過程。本本研究應(yīng)應(yīng)用DDDRTPCRR方法研研究衰老老相關(guān)基基因在SSAM（Sennesccencce-AAcceelerrateed

3、MMousse）小小鼠腦組組織中表表達(dá)的變變化情況況。在SSAMRR1TAA、SAAMP88/Taa、SAAMP110/TTa三個(gè)個(gè)品系中中，通過過比較不不同鼠齡齡SAMMP100/Taa（2、4、112、118月齡齡）的基基因表達(dá)達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)在在4月齡齡和122月齡分分別有一一個(gè)差異異表達(dá)片片段；對(duì)對(duì)不同鼠鼠齡的SSAMPP8/TTa（22、4、11月月齡）經(jīng)經(jīng)差顯比比較, 發(fā)現(xiàn)在在2月齡齡和111月齡各各有一差差異表達(dá)達(dá)片段。在不同同品系的的比較中中發(fā)現(xiàn)了了16個(gè)個(gè)差異性性片段，分別屬屬于SAAMP110/TTa(33個(gè))、SAMMP8/Ta(6個(gè))和SAAMR11TA（7個(gè)）。測序序結(jié)果

4、經(jīng)經(jīng)檢索顯顯示，它它們分別別與下列列基因轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物物同源：熱休克克識(shí)別蛋蛋白770、AATP依依賴性線線粒體RRNA螺螺旋酶、Dleeu mmRNAA、小鼠鼠X染色色體RPP23-3344C4克克隆DNNA序列列、還原原型輔酶酶Q-細(xì)細(xì)胞色素素c還原原酶復(fù)合合物7.2KDD亞單位位、600S核糖糖體蛋白白L211、FIIS、苯苯基烷基基胺鈣離離子拮抗抗物結(jié)合合蛋白、巖藻糖糖基轉(zhuǎn)移移酶99、膠質(zhì)質(zhì)細(xì)胞源源性神經(jīng)經(jīng)營養(yǎng)因因子家族族受體1、內(nèi)內(nèi)切核酸酸酶/逆逆轉(zhuǎn)錄酶酶、PEER1蛋蛋白相關(guān)關(guān)超級(jí)融融原核蛋蛋白、中中心體蛋蛋白CGG-NAAP、轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)鐵蛋白白重鏈基基因、巢巢蛋白-2基因因、DNNA依賴賴

5、性蛋白白激酶催催化亞單單位基因因prkkdc 動(dòng)物物學(xué)報(bào) 50（4） - ，220044。關(guān)鍵詞 加速速衰老小小鼠 衰老相相關(guān)基因因表達(dá) 逆轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)錄差異異顯示聚聚合酶鏈鏈?zhǔn)椒磻?yīng)應(yīng) 腦腦組織Exprresssionns oof ageeingg-asssocciatted genne iin ccereebraal ttisssue of sennesccencce-aacceelerrateed mmousse*Zhanng CChonng1.2 Cheeng Jinn-Yaan1 WWangg Jiin-GGangg3 Chhen Qinng-XXuann1* 1. IInsttituute

6、of Gennetiics andd Deevellopmmenttal Bioologgy, Thee Chhineese Acaademmy oof SScieencees, Beiijinng 11000080, Chhinaa2. GGradduatte SSchoool of Chiinesse Acaademmy oof SScieencees, Beeijiing 10000399, CChinna3. LLinggtaii Biicheen MMediicall Teechnnoloogy Co. Lttd. Beiijinng, 10000866, CChinnaAbasst

7、raact A bbettter unddersstanndinng oof tthe mollecuularr efffeccts of ageeingg inn thhe bbraiin mmay hellp tto rreveeal impporttantt asspeccts of orgganiismaal aageiing, as wwelll ass prroceessees tthatt leead to ageeingg-reelatted braain dyssfunnctiion. Inn thhis stuudy, thhe aageiing-speeciffic ex

8、ppresssioon ggenees oof tthe murrinee ceerebbrumm weere invvesttigaatedd byy emmplooyinng ddifffereentiial-dissplaay rreveersee trransscriiptiion pollymeerasse cchaiin rreacctioon (DDRRT-PPCR) inn thhreee seenesscennce-accceleeratted mouuse (SAAM) strrainns: SAMMP8/Ta, SAAMP110/TTa aand SAMMR1TTA. T

9、hrrouggh ccomppareed ggenee exxpreessiion proofille aamonng tthe agee 188, 112, 4, andd 2 monnth of thee SAAMP110/TTa sstraain, twwo ddifffereentiial fraagmeentss haave beeen ffounnd, whiich bellongg too 4 andd 12 mmontth iindiividduallly; annd iin aage 11, 4 andd 2 monnth of thee SAAMP88/Taa sttrai

10、in, twoo frragmmentts hhavee beeen fouund, whhichh beelonng tto 111 aand 2 mmontth rresppecttiveely. Annd ccomppareed ggenee exxpreessiion proofille iin ddifffereent strrainns mmicee, 116 ffraggmennts havve bbeenn deetecctedd, 33, 66 annd 77 off thhem bellongg too SAAMP110/TTa, SAMMP8/Ta andd SAAMR1

11、1TA resspecctivvelyy. SSequuencce rresuultss inndiccatee thhat thoose fraagmeentss arre hhomoologgouss wiith heaat sshocck pprotteinn coognaate prooteiin 770，ATPP-deepenndennt mmitoochoondrriall RNNA hheliicasse, Dleeu2 mRNNA, Mouuse DNAA seequeencee frrom cloone RP223-3334CC3 oon cchroomossomee X,

12、ubbiquuinool-ccytoochrromee c redducttasee coompllex (7.2 kkD), 600S rriboosommal prooteiin LL21, FIIS, pheenyllalkkylaaminne CCa2+ anntaggoniist (emmopaamill) bbinddingg prroteein, fuucossylttrannsfeerasse 99, ggliaal ccelll liine derriveed nneurrotrrophhic facctorr faamilly rreceeptoor aalphha 11,

13、 eendoonuccleaase/revversse ttrannscrripttasee, PPER11 innterracttingg prroteein of thee suupraachiiamaaticc nuucleeus hommoloog, cenntroosommal prooteiin CCG-NNAP, feerriitinn heeavyy chhainn geene, NIID-22 geene, annd pprkddc ggenee foor DDNA-deppenddentt prroteein kinnasee caatallytiic ssubuunitt

14、 Actta ZZoollogiica Sinnicaa 500(4): - , 20004. Key worrds Sennesccencce-AAcceelerrateed MMousse, Aggeinng-aassoociaatedd geene exppresssioon, Difffereentiial dissplaay rreveersee trransscriiptiion pollymeerasse cchaiin rreacctioon; Cereebraal TTisssue衰老是指指機(jī)體達(dá)達(dá)到其最最大繁殖殖能力后后生理功功能的進(jìn)進(jìn)行性降降低(RRoy et al.,

15、119966),是是一個(gè)自自發(fā)而又又與早期期的程序序化發(fā)育育相對(duì)應(yīng)應(yīng)的過程程。機(jī)體體的壽命命取決于于許多因因素，其其中包括括遺傳因因素（FFincch eet aal.,19997; Pucca eet aal., 20001）、激素素和生長長因子信信號(hào)(FFlurrkeyy ett all., 20001;CCoscchigganoo ett all., 20000)、體重(Piaantaanellli et al., 220011)、體體脂含量量和環(huán)境境因素(Cosschiiganno eet aal., 20000; Maasorro, 20000)等等。進(jìn)化化理論認(rèn)認(rèn)為衰老老并非是是機(jī)

16、體的的適應(yīng)性性特征，而是隨隨著時(shí)間間推移機(jī)機(jī)體許多多功能注注定喪失失的結(jié)果果。醫(yī)療療記錄也也給我們們這樣的的印象：衰老是是許多獨(dú)獨(dú)立導(dǎo)致致疾病并并最終導(dǎo)導(dǎo)致死亡亡的退行行性變化化過程的的集合(Hekkimii ett all., 20003)。模式動(dòng)物物加速衰衰老小鼠鼠（Seenesscennce-Accceleeratted Mouuse，SAMM）是由由一系列列相關(guān)的的純系所所組成，包括99個(gè)短壽壽的加速速衰老品品系和33個(gè)壽命命較長的的正常衰衰老的品品系（TTakeeda et al.,19981，19991）。SAMMP系小小鼠顯示示系特異異性衰老老相關(guān)的的病理表表型，包包括出現(xiàn)現(xiàn)衰老

17、表表征提前前和壽命命縮短。本研究究應(yīng)用了了三個(gè)品品系小鼠鼠作為研研究對(duì)象象，以期期發(fā)現(xiàn)衰衰老相關(guān)關(guān)表達(dá)的的基因。其中，SAMMP8/Ta與與SAMMP100/Taa表現(xiàn)為為短壽及及與鼠齡齡相關(guān)的的學(xué)習(xí)認(rèn)認(rèn)知損害害、情感感紊亂、晝夜節(jié)節(jié)律異常常，SAAMP88/Taa還表現(xiàn)現(xiàn)免疫損損害；SSAMRR1TAA則為正正常壽命命且無衰衰老相關(guān)關(guān)病理表表型的對(duì)對(duì)照系（Takkedaa，19999）。SAM模模式小鼠鼠顯示出出的加速速衰老的的病理表表型說明明：衰老老至少從從一定意意義上來來說是受受遺傳控控制的。迄今為為止，SSAM小小鼠己被被廣泛用用于衰老老相關(guān)性性疾病的的研究，但很少少涉及導(dǎo)導(dǎo)致其壽壽命

18、縮短短的分子子機(jī)理的的研究（Zhaang et al., 220022; KKumaar eet aal., 20000）。因此此，我們們應(yīng)用DDDRTT-PCCR方法法對(duì)不同同鼠齡和和不同品品系的加加速衰老老小鼠(SAMM)腦組組織進(jìn)行行了比較較研究，以期找找出與衰衰老相關(guān)關(guān)的基因因片段，進(jìn)而為為進(jìn)一步步研究衰衰老的分分子機(jī)制制打下基基礎(chǔ)。1 材料料和方法法1.1 材料1.1.1 實(shí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物物及飼養(yǎng)養(yǎng)條件 SSAMRR1TAA、SAAMP88/Taa、SAAMP110/TTa系小小鼠購自自日本京京都大學(xué)學(xué)，在本本所實(shí)驗(yàn)驗(yàn)動(dòng)物中中心按普普通級(jí)進(jìn)進(jìn)行飼養(yǎng)養(yǎng)，122小時(shí)明明暗光周周期，自自由飲水水

19、及采食食。實(shí)驗(yàn)驗(yàn)中動(dòng)物物使用飼飼料為購購自軍事事醫(yī)學(xué)科科學(xué)院實(shí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物物中心飼飼料廠的的商業(yè)化化小鼠飼飼料。1.1.2 實(shí)實(shí)驗(yàn)用試試劑 RNAA小量提提取試劑劑盒(QQiaggen)、 QQIAsshreeddeerTMM (QQiaggen)、 PPCR 管（Axxygeen）、M-MMuLVV逆轉(zhuǎn)錄錄酶(BBiollabssIncc.)、dNTTP (proomgaa)、TTaq DNAA聚合酶酶 (PPrommga)、-32p-dCTTP（亞亞輝）、無RNNA酶的的DNA酶酶(Prromgga)、RNAA酶抑制制劑(PPrommga)、尿素素（Prromgga）、糖原(SSigmma)、

20、瓊脂糖糖（Biioweest）、Wiizarrd PCRR Prreps DDNA純純化系統(tǒng)統(tǒng)（Prromgga）、pGEEM-T Eassy載體體(Prromgga)、氨芐青青霉素(siggma)、IPPTG(Proomgaa)、XX-Gaal (Prromgga)、 DHH5感感受態(tài)菌菌（天威時(shí)時(shí)代）、UlttraPPureeTM 質(zhì)粒粒純化試試劑盒（賽百盛盛）、XX光膠片片(Fuuji Phooto Fillm CCo.LLtd.)、BDD MaaratthonnTM ccDNAA 擴(kuò)增增試劑盒盒(BDD Biioscciennce Cloonteech)、 PPROTTRANN 硝酸酸

21、纖維素素轉(zhuǎn)印膜膜(Scchleeichher&Schhuelll)、 預(yù)雜雜交及雜雜交液(上海生生物工程程技術(shù)服服務(wù)有限限公司)、 隨隨機(jī)引物物DNAA標(biāo)記試試劑盒(TaKKaRaa Biioteechnnoloogy Co.Ltdd.)。 1.1.3 實(shí)實(shí)驗(yàn)用引引物:由由賽百盛盛公司合合成，序序列如下下：A11: 55-AACAGGA GGCACCA； APGG: 55-AAAGCCT TTTTTTT TTTTTTT TTG；AAPC: 5-AAAGCTT TTTTTTT TTTTTTT TCC；APPA: 5-AAGGCT TTTTTT TTTTTT TA。1.2 方法1.2.1 總RNN

22、A提取取 實(shí)驗(yàn)驗(yàn)用雄性性小鼠斷斷頸處死死，撕去去頭部皮皮膚，打打開頭蓋蓋骨，取取出腦組組織。切切取大腦腦左前部部1/22約300mg,放入玻玻璃研磨磨器中，加入裂裂解液后后研磨，按RNNeassy mminii Kiit操作作方法提提取總RRNA。經(jīng)無RRNA酶酶的DNNA酶處處理后備備用。1.2.2 RRNA逆逆轉(zhuǎn)錄 在PCCR管中中加入22l總RRNA（約1g）、10XX RTT buuffeer 44l、2.55mM dNTTP 11.6l、33引物 2l、RRNA酶酶抑制劑劑(400iu/l) 0.5ll、加水水至199l。665 5 miin，44210 minn、加入入M-MMuL

23、VV 逆轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)錄酶11l (2000iuu),337 500 miin、775 5 minn。 1.2.3 逆轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物物的PCCR擴(kuò)增增 反應(yīng)應(yīng)體系為為逆轉(zhuǎn)錄錄產(chǎn)物22l、110X Buffferr 2l、25mmM MMgCll2 2l 、2.55mM dNTTP 11.6l、55引物（2MM）2ll、3引物(22M) 2l、Taqq DNNA聚合合酶(55iu/l) 0.4ll、-322P-dCCTP (100Cii/ll) 0.5ll、加水水至200l。PPCR反反應(yīng)參數(shù)數(shù)為94410 minn；9441 mmin,402 mmin，721 mmin，40個(gè)個(gè)循環(huán)；725 mmin。1.

24、2.4 6%尿尿素變性性聚丙烯烯酰胺凝凝膠電泳泳及差異異條帶的的回收再再擴(kuò)增 將11.2.3擴(kuò)增增產(chǎn)物經(jīng)經(jīng)6%尿尿素變性性聚丙烯烯酰胺凝凝膠電泳泳后，XX光片壓壓片，20曝光772小時(shí)時(shí)后顯影影，找出出差異性性條帶。從凝膠膠上切取取差異條條帶，加加入1000ll雙蒸水水，室溫溫浸泡110 mmin，煮沸115 mmin。離心取取上清，加入33M乙酸酸鈉（PPH5.2）110ll，糖原原（200mg/ml）2.55l, 無水水乙醇4450l，20過夜。4離心110 mmin，沉淀用用冰預(yù)冷冷的855%乙醇醇洗滌后后溶于110ll雙蒸水水中。再再擴(kuò)增反反應(yīng)體系系為回收收產(chǎn)物44l、110 Buuf

25、feer 44l、25mmM MggCl22 4l 、2.55mM dNTTP 33.2l、55引物（2MM）4l、33引物(22M) 4l、Taqq DNNA聚合合酶(55iu/l) 0.8ll、加水水至400l。PPCR反反應(yīng)參數(shù)數(shù)為944 100 miin；994 1 minn,400 2 minn，722 1 minn，200個(gè)循環(huán)環(huán)；722 5 minn；944 100 miin；994 1 minn,400 2 minn，722 1 minn，200個(gè)循環(huán)環(huán)；722 5 minn。1.2.5 再再擴(kuò)增產(chǎn)產(chǎn)物的鑒鑒定及純純化 取取部分再再擴(kuò)增產(chǎn)產(chǎn)物用11.2%瓊脂糖糖凝膠電電泳鑒定定

26、，其余余部分用用Wizzardd PCCR PPrepps DDNA 純化系系統(tǒng)進(jìn)行行純化。1.2.6 純純化產(chǎn)物物的連接接及轉(zhuǎn)化化 將純純化產(chǎn)物物連入ppGEMM-T Eassy 載載體。轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化感受受態(tài)DHH5大腸桿桿菌。加加SOCC培養(yǎng)基基37，1550轉(zhuǎn)/ miin，培培養(yǎng)1.5小時(shí)時(shí)。LBB/ampp/IPPTG/X-GGal平平板涂布布，377培養(yǎng)116小時(shí)時(shí)。挑取取單個(gè)白白色菌落落，接種種LB/ampp培養(yǎng)基基37,1550轉(zhuǎn)/ miin培養(yǎng)養(yǎng)過夜。1.2.7 質(zhì)粒粒提取及及鑒定 取單菌菌落過夜夜培養(yǎng)物物按UlltraaPurreTMM質(zhì)粒DDNA小小量提取取試劑盒盒使用說說明提取

27、取質(zhì)粒DDNA。進(jìn)行PPCR擴(kuò)擴(kuò)增，11.2%瓊脂糖糖凝膠電電泳鑒定定。PCCR反應(yīng)應(yīng)體系為為提取質(zhì)質(zhì)粒2l、110X BBufffer 2ll、25mmM MMgCll2 2l 、2.55mM dNTTP 11.6l、55引物（2MM）2ll、3引物(22M) 2l、Taqq DNNA聚合合酶(55iu/l) 0.4ll、加水水至200l。PPCR反反應(yīng)參數(shù)數(shù)為94410 minn；9441 mmin,402 mmin，721 mmin，30個(gè)個(gè)循環(huán)；725 mmin。1.2.8 測序序及GeenBaank檢檢索分析析 測序序交由上上海生工工和上海海博亞進(jìn)進(jìn)行。測測序結(jié)果果通過GGenBBa

28、nkk檢索進(jìn)進(jìn)行同源源性比較較分析。1.2.9 差差異表達(dá)達(dá)片段的的Virrtuaal NNorttherrn BBlott驗(yàn)證 總RNNA按BBD MMaraathoonTMM cDDNA 擴(kuò)增試試劑盒使使用說明明進(jìn)行逆逆轉(zhuǎn)錄并并擴(kuò)增后后電泳。按Saambrrookk和Russselll(220011)介紹紹的方法法經(jīng)轉(zhuǎn)膜膜后進(jìn)行行雜交。2 結(jié) 果使用DDDRT-PCRR方法，我們比比較了同同品系不不同鼠齡齡SAMM小鼠（SAMMP8/Ta 鼠齡分分別為 2, 3.55, 111個(gè)月月； SSAMPP10/Ta鼠鼠齡分別別為2, 4, 122, 118.55個(gè)月；SAMMR1TTA鼠齡齡分別

29、為為2, 4, 12, 188個(gè)月）腦組織織的基因因表達(dá)情情況，找找到了44個(gè)差異異表達(dá)片片段，分分別屬于于4月齡齡與122月齡的的SAMMP100/Taa 和22月齡與與11月月齡的SSAMPP8/TTa。對(duì)對(duì)不同品品系SAAM小鼠鼠腦組織織的基因因表達(dá)情情況比較較共發(fā)現(xiàn)現(xiàn)了422個(gè)差異異性條帶帶。圖11,2顯顯示部分分DDRRT-PPCR結(jié)結(jié)果。圖1.不不同鼠齡齡SAMMP100/Taa腦組織織DDRRT-PPCR結(jié)結(jié)果Fig 1. Ressultts oof tthe DDRRT-PPCR forr thhe ccereeball tiissuues off diiffeerennt a

30、age SAMMP100/Taa 箭頭所示示為差異異性表達(dá)達(dá)條帶。圖下數(shù)數(shù)字表示示如下：1、22為2月月齡SAAMP110/TTa，33、4為為4月齡齡SAMMP100/Taa，5、6為112月齡齡 SAAMP110/TTa，77、8為為18月月齡 SSAMPP10/Ta。The arrrowhheadd shhowss thhe ddifffereentiial dissplaay bbandds. Thee nuumbeers bellow thee fiigurre ppressentt ass foolloows: 1 andd 2 sammplees ffromm 2 monnth

31、SAMMP100/Taa, 3 aand 4 ssamppless frrom 4 mmontth SSAMPP10/Ta, 55 annd 66 samppless frrom 12 monnth SAMMP100/Taa, aand 7annd 88 Saamplles froom 118 mmontth SSAMPP10/Ta.圖2 不不同品系系SAMM小鼠腦腦組織DDDRTT-PCCR結(jié)果果Fig. 2 Reesullts of thee DDDRT-PCRR foor ccereeball tiissuue oof ddifffereent SAMM sttraiins箭頭所示示為差

32、異異性表達(dá)達(dá)條帶。圖下數(shù)數(shù)字表示示：1、2為22月齡SSAMPP8/TTa，33、4為為4月齡齡SAMMP8/Ta，5、66為111月齡SSAMPP8/TTa，77、8為為2月齡齡SAMMR1TTA，99、100為4月月齡 SSAMRR1TAA，111、122為111.5月月齡SAAMR11TA，13、14為為18月月齡SAAMR11TA。The arrrowhheadd shhowss thhe ddifffereentiial dissplaay bbandds. Thee nuumbeers bellow thee fiigurre ppressentt thhe ssamppless

33、frrom as folllowws: 1 aand 2 SSAMPP8/TTa oof 22 moonthh, 33 annd 44 SAAMP88/Taa off 4 monnth, 5 andd 6 SAMMP8/Ta of 11 monnth, 7 andd 8 SAMMR1TTA oof 22 moonthh, 9 aand 10 SAMMR1TTA oof 44 moonthh, 111 aand 12 SAMMR1TTA oof 111.55 moonthh, aand 13 andd 144 SAAMR11TA of 18 monnth.在所獲得得的這些些條帶中中，200個(gè)己成

34、成功再擴(kuò)擴(kuò)增，并并經(jīng)連接接轉(zhuǎn)化后后進(jìn)行了了測序分分析。經(jīng)經(jīng)NCBBI-BBLASST同源源性檢索索，其結(jié)結(jié)果見表表1。表1 差差異表達(dá)達(dá)片段NNCBII-BLLASTT檢索結(jié)結(jié)果Tablle 11 FFeatturees oof SSequuencced Cloone andd Reesullts of BLAAST Seaarchh序號(hào) 大大小(bbp)* 同源序序列(BBLASST) 登陸號(hào)號(hào) 同源源性 比較大大小No. Siize (bpp) Seequeencee hoomollogyy(BLLASTT) Acccesssioon NNo. ideentiity/% Oveerlaap

35、1*1200 bpp小家鼠鼠(Muus mmuscculuus)熱熱休克識(shí)識(shí)別蛋白白70 mRNNABC00067722.199%1044Mus musscullus heaat sshocck ccognnatee prroteein 70 mRNNA21332 bp小家鼠鼠(Muus mmuscculuus) mRNNA，類類似于釀釀灑酵母母BC0049779694%1422(S.ccereevissiaee)的varr1, 3抑制制蛋白-1Mus musscullus，simmilaar tto ssupppresssorr off vaar1, 3-likke 11(S.ccereev

36、issiaee) mmRNAA31666 bp小家鼠鼠(Muus mmuscculuus) X染色色體克隆隆RP223-3334CC3 DDNA AL66720057.81000%1322MMus musscullus DNAA seequeencee frrom cloone RP223-3334CC3 oonchroomossomee X41881 bp小家鼠鼠(Muus mmuscculuus) Dlleu22 mRRNAAF3380442398%1911MMus musscullus Dleeu2 mRNNA7 2566 bp小家鼠鼠(Muus mmuscculuus) 還原型型輔酶Q

37、Q-細(xì)胞胞色素cc還原酶酶BC00245518.199%2633復(fù)合物77.2kkD亞單單位mRRNAMMus musscullus mRNNA, Simmilaar tto uubiqquinnol-cyttochhromme ccrreduuctaase commpleex (7.22 kDD)12 2277 bp小家鼠鼠(Muus mmuscculuus) 60SS核糖體體蛋白LL21mmRNAAXM_19334088.199%2355MMus musscullus mRNNA, simmilaar tto 660S ribbosoomall prroteein L21113 1988

38、bp小家鼠鼠(Muus mmuscculuus) FIIS ccDNAAAK00038875.11000%2066MMus musscullus siimillar to FISS cDDNA14 1988 bp小家鼠鼠(Muus mmuscculuus) FIIS ccDNAAAK00038875.11000%2066MMus musscullus simmilaar tto FFIS cDNNA16 1355 bp小家鼠鼠(Muus mmuscculuus)苯苯基烷胺胺拮抗物物(emmopaamill) CCa2+BC00047703.11000%1433離子結(jié)合合蛋白mmRNAA Mus

39、 musscullus pheenyllalkkyl-amiine Ca22+ aantaagonnistt (emoopammil) binndinng pprotteinn mRRNA 19 1322 bp小家鼠鼠(Muus mmuscculuus)巖巖藻糖基基轉(zhuǎn)移酶酶cDNNAAK00476650.194%1366Mus musscullus fuccosyyl-ttrannsfeerasse 99 cDDNA20 1033 bp小家鼠鼠(Muus mmuscculuus)膠膠質(zhì)細(xì)胞胞源性神神經(jīng)營養(yǎng)養(yǎng)因子mmRNAABC00402251.11000% 73MMus musscullus,

40、 Siimillar to gliial celll llinee deerivvedneurrotrrophhic facctorr faamillyreecepptorr allphaa 1 mRNNA24 2555 bp小家鼠鼠(Muus mmuscculuus) 還原型型輔酶QQ-細(xì)胞胞色素cc還原酶酶BC00245518.199%2633復(fù)合物77.2kkD亞單單位mRRNAMus musscullus mRNNA, Simmilaar tto uubiqquinnol-cyttochhromme ccreduuctaase commpleex (7.2 kkD)25 1122 bp

41、小家鼠鼠(Muus mmuscculuus)核核酸內(nèi)切切酶/逆逆轉(zhuǎn)錄酶酶mRNNAXM_20771188.294%1211Mus musscullus mRNNA, simmilaar tto eendoonuccle- asse/rreveersee traansccripptasse27 1111 bp小家鼠鼠(Muus mmuscculuus) cDNNA,產(chǎn)產(chǎn)物與大大家鼠(RatttussAK00509919.197%1222norvvegiicuss)上視視交叉核核的PEER1相相互作用用蛋白同同源Mus musscullus, PEER1 intteraactiing proote

42、iin oof tthesuprrachhiammatiic nnuclleuss hommoloog Ratttuss noorveegiccus29 1088 bp大家鼠鼠(Raattuus norrveggicuus)中中心體蛋蛋白CGG-NAAP mmRNAAAB00713391.191%1166 Ratttuss noorveegiccus mRNNA ffor cenntroosommal prooteiin CCG-NNAP32 98 bp 小家家鼠(MMus musscullus)60SS核糖體體蛋白LL21mmRNAAXM_12225011.11000%1055MMus mu

43、sscullus mRNNA simmilaar tto 60SS riibossomaal prooteiin LL2133 98 bp小家鼠鼠(Muus mmuscculuus)60SS核糖體體蛋白LL21mmRNAAXM_12225011.199%1055MMus musscullus mRNNA ssimiilarr too 60SS riibossomaal prooteiin LL2136 1777 bp小家鼠鼠(Muus mmuscculuus)鐵鐵蛋白重重鏈基因因cDNNAM6001700.11000%1844MMus musscullus ferrrittin heaavy

44、chaain genne ccDNAA 40 1844 bp小家鼠鼠(Muus mmuscculuus)巢巢蛋白-2基因因外元119-221AJ44285512.199%1955Mus musscullus parrtiaal NNID-2 ggenee foor nnidoogenn-2, exxonss 199-21141 1455 bp小家鼠鼠(Muus mmuscculuus)DDNA依依賴性蛋蛋白激酶酶催化亞亞單AB00307754.193%48位PRKKDC cDNNAMus musscullus prkkdc genne ffor DNAA-deepenndennt pprott

45、einn kinaase cattalyyticc suubunnit * 大小小不包含含引物序序列。 * 片片段來源源. 同系不不同鼠齡齡比較: 11： 來來自 112月齡齡SAMMP100/Taa.。2：來自自11月齡齡 SAAMP88/Taa。3：來自自2月齡 SSAMPP8/TTa。 4：來自自4月齡 SSAMPP10/Ta。 品品系間比比較：77：來自自SAMMR1TTA。12：來自自SAMMP100/Taa。13：來自自SAMMR1TTA。14：來自自SAMMP8/Ta。 166：來自自SAMMR1TTA。19：來自自SAMMP8/Ta。 200：來自自SAMMP100/Taa。2

46、4：來自自 SAAMP88/Taa。 255：來自自SAMMP100/Taa。27：來自自SAMMP8/Ta。29：來自自 SAAMP88/Taa。 322：來自自SAMMR1TTA。33：來自自SAMMP8/Ta。36：來自自SAMMR1TTA。40：來自自SAMMR1TTA。 41：來自自SAMMR1TTA。*Thee prrimeer ssequuencces aree noot iinclludeed iin tthe sizze.*Soourcce oof tthe fraagmeentss. Ageeingg sppeciificc exxpreessiion fraagmeent

47、ss: NNo.11 SAAMP110/TTa oof 112 mmontth, No.2 SSAMPP8/TTa oof 111 mmontth,No.33 SAAMP88/Taa off 2 monnth, Noo. 44 SAAMP110/TTa oof 44 moonthh. SStraain speeciffic exppresssioon ffraggmennts: Noo. 77 SAAMR11TA, Noo. 112 SSAMPP10/Ta, Noo.133 SAAMR11TA, Noo.144 SAAMP88/Taa, NNo.116 SSAMRR1TAA, NNo. 19

48、SAMMP8/Ta, Noo. 220 SSAMPP10/Ta, Noo. 224 SSAMPP8/TTa, No. 255 SAAMP110/TTa, No. 277 SAAMP88/Taa, NNo. 29 SAMMP8/Ta, Noo. 332 SSAMRR1TAA, NNo. 33 SAMMP8/Ta, Noo.366 SAAMR11TA, Noo.400 SAAMR11TA, Noo.411 SAAMR11TA. 為為驗(yàn)證所所得的這這些差異異片段表表達(dá)的特特異性，我們進(jìn)進(jìn)行了VVirttuall Noorthhernn Bllot分分析(HHungg ett all., 19999)

49、。部分結(jié)結(jié)果見圖圖3。圖3 部分片片段的VVirttuall Noorthhernn Bllot驗(yàn)驗(yàn)證結(jié)果果Fig33. VVirttuall noorthhernn bllot ressultts oof pparttiall frragmmenttsM為DLL20000maarkeer，PP10來來自SAAMP110，RR1來自自SAMMR1，P8來來自SAAMP88。M iss DLL20000 MMarkker. PP10 Sammplees ccomee frrom SAMMP100/Taa. R1 Sammplees ccomee frrom SAMMR1TTA. P88 Saam

50、plles comme ffromm SAAMP88/Taa.3 討論論 應(yīng)用DDDRTT-PCCR方法法對(duì)不同同鼠齡和和不同品品系的SSAM小小鼠腦組組織基因因表達(dá)情情況研究究，我們們從中找找出了442個(gè)差差異性表表達(dá)條帶帶，并從從中鑒定定出了220個(gè)基基因片段段。其中中4個(gè), 對(duì)同同系不同同齡,為為鼠齡特特異性表表達(dá)；另另外166個(gè),對(duì)對(duì)異系而而言,為為系特異異性表達(dá)達(dá)。 4個(gè)鼠鼠齡特異異性表達(dá)達(dá)基因分分別與下下列基因因同源：熱休克克識(shí)別蛋蛋白-770、AATP依依賴性線線粒體RRNA螺螺旋酶、Dleeu2 mRNNA、小小鼠X染染色體RRP233-3334C33克隆DDNA序序列。熱熱休

51、克識(shí)識(shí)別蛋白白系統(tǒng)是是應(yīng)激誘誘導(dǎo)表達(dá)達(dá)并在基基礎(chǔ)條件件下組成成型表達(dá)達(dá)的細(xì)胞胞防衛(wèi)和和維持其其完整性性所必需需。是機(jī)機(jī)體抵抗抗內(nèi)源性性及外源源性損害害應(yīng)激、細(xì)胞生生存和損損害修復(fù)復(fù)的關(guān)鍵鍵因子(Sotti eet aal., 20000)。Heeydaari et al.(19994)研究顯顯示，老老年動(dòng)物物的誘導(dǎo)導(dǎo)性熱休休克蛋白白表達(dá)較較年青動(dòng)動(dòng)物降低低50%。其降降低主要要發(fā)生在在轉(zhuǎn)錄水水平，由由于熱休休克蛋白白的轉(zhuǎn)錄錄因子缺缺乏所致致。老年年動(dòng)物熱熱休克反反應(yīng)性的的降低可可能是衰衰老過程程中有害害蛋白積積聚和細(xì)細(xì)胞異常常死亡的的重要因因素。輕輕度的重重復(fù)性熱熱休克反反應(yīng)對(duì)細(xì)細(xì)胞和機(jī)機(jī)體具

52、有有抗衰老老激素樣樣作用(Verrbekke eet aal.,20001)。Maiielllo eet aal. (19998)研究認(rèn)認(rèn)為，在在年青和和年老動(dòng)動(dòng)物中，非誘導(dǎo)導(dǎo)基礎(chǔ)表表達(dá)HSSP的機(jī)機(jī)制是不不同的。我們的的研究結(jié)結(jié)果顯示示，在112月齡齡的SAAMP110/TTa小鼠鼠腦組織織中，HHSC770的表表達(dá)水平平較其它它幾個(gè)鼠鼠年齡的的表達(dá)水水平高。推測其其可能與與衰老過過程中異異常蛋白白在細(xì)胞胞中積聚聚從而誘誘導(dǎo)HSSP表達(dá)達(dá)，導(dǎo)致致HSPP轉(zhuǎn)錄增增加。但但隨著鼠鼠齡進(jìn)一一步增長長，其表表達(dá)的水水平因其其可誘導(dǎo)導(dǎo)性降低低而又逐逐漸下降降。 線線粒體基基因表達(dá)達(dá)在很大大程度上上受核

53、基基因組所所控制。在酵母母中，核核基因VVAR11產(chǎn)物是是線粒體體37ss核糖體體亞單位位裝配所所必須。SUVV311編碼AATP-依賴的的線粒體體RNAA螺旋酶酶調(diào)控VVAR11 RNNA轉(zhuǎn)錄錄和轉(zhuǎn)錄錄后代謝謝，進(jìn)而而提高細(xì)細(xì)胞色素素b和CCOX I mmRNAA 的轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)錄效率率(Coonraad-WWebbb ett all.,119900; SSteppienn ett all.,119922)。細(xì)細(xì)胞色素素b和COXX是線粒粒體電子子傳遞鏈鏈的關(guān)鍵鍵組成部部分，在在衰老過過程中SSUV33-1可可能通過過影響電電子傳遞遞鏈相關(guān)關(guān)的自由由基的產(chǎn)產(chǎn)生而發(fā)發(fā)揮作用用。 CCalllejaa

54、ett all. (19993)研研究顯示示，在果果蠅中線線粒體轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)錄水平平隨年齡齡增長而而降低。本研究究發(fā)現(xiàn)，SUVV3-11 mRRNA在在11月月齡的SSAMPP8/TTa表達(dá)達(dá)水平較較2月齡齡和4月月齡高，顯示其其可能是是老齡動(dòng)動(dòng)物維持持線粒體體轉(zhuǎn)錄水水平所必必需的。FIS是是一個(gè)多多向性代代謝調(diào)節(jié)節(jié)物,屬于小小分子DDNA結(jié)結(jié)合蛋白白成員。FISS降低DDNA螺螺旋酶的的活性并并全面抵抵消DNNA超螺螺旋密度度的增加加。Muuskhheliishvvilii ett all. (20003)體體外研究究結(jié)果顯顯示，F(xiàn)FIS結(jié)結(jié)合于超超螺旋DDNA導(dǎo)導(dǎo)致分支支結(jié)構(gòu)形形成并使使頂端環(huán)環(huán)狀

55、結(jié)構(gòu)構(gòu)增加。 而結(jié)合合于穩(wěn)定定的RNNA啟動(dòng)動(dòng)子上游游時(shí)FIIS在拓拓?fù)鋵W(xué)上上起著穩(wěn)穩(wěn)定局部部高水平平超螺旋旋密度的的作用，是啟起起動(dòng)子活活性所必必需。并并認(rèn)為FFIS通通過調(diào)節(jié)節(jié)整體與與局部負(fù)負(fù)超螺旋旋的自由由能至特特異性基基因表達(dá)達(dá)位點(diǎn)起起作用。在原核核生物中中，F(xiàn)IIS參與與Hinn介導(dǎo)的的位點(diǎn)特特異性重重組的核核蛋白體體的裝配配(Paaulll ett all.,119944), rRNNA和ttRNAA的轉(zhuǎn)錄錄激活，抑制其其自身的的合成及及orii-C 起始的的DNAA復(fù)制(Finnkell ett all.,119922)。在在植物，F(xiàn)ISS是一個(gè)個(gè)印跡基基因，參參與種子子發(fā)育過過

56、程中細(xì)細(xì)胞生長長和增殖殖的調(diào)控控(Baarouux eet aal., 20002)，F(xiàn)IIS通過過染色質(zhì)質(zhì)重塑抑抑制下游游種子發(fā)發(fā)育基因因表達(dá)(Chaaudhhuryy ett all., 20001)。在哺乳乳動(dòng)物體體，F(xiàn)IIS與高高遷移組組分蛋白白HMGG1和HMGG2相互互作用促促進(jìn)DNNA可塑塑性(PPaulll eet aal., 19993)。本研研究結(jié)果果顯示，其在SSAMPP10/Ta的的表達(dá)明明顯降低低，顯示示其在衰衰老過程程中也起起著重要要作用。 苯苯基烷基基胺Caa2+拮抗抗物結(jié)合合蛋白是是哺乳動(dòng)動(dòng)物內(nèi)質(zhì)質(zhì)網(wǎng)定位位膜蛋白白，催化化8-甾醇轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化為7-甾甾醇，8-7甾醇醇

57、異構(gòu)酶酶是真核核生物甾甾醇合成成途徑中中的必需需酶(SSilvve eet aal., 19996)。顯性性X染色色體連鎖鎖的斑狀狀軟骨發(fā)發(fā)育異常常(CDDPX22)是由由編碼8, 7甾甾醇異構(gòu)構(gòu)酶的eemoppamiil結(jié)合合蛋白(EBPP)基因因突變所所致。CCDPXX2患者者顯示皮皮膚損害害包括：皮膚線線狀或螺螺旋狀萎萎縮、色色素沉著著異常、條紋狀狀角化過過度、毛毛發(fā)粗糙糙無光、禿頂、白內(nèi)障障。骨骼骼異常包包括：身身材短小小、四肢肢肢根性性縮短、骨骺點(diǎn)點(diǎn)狀損害害和顱面面骨缺陷陷(Deerryy ett all.,119999)。SSAMPP小鼠的的病理表表型與其其中某些些癥狀相相一致，如

58、被毛毛稀少、粗糙無無光、脊脊柱前凸凸、白內(nèi)內(nèi)障、皮皮膚粗糙糙和不同同程度的的皮膚損損害(TTakeeda et al.,19981)。本研研究顯示示苯基烷烷基胺CCa2+拮抗物物(Emmopaamill)結(jié)合合蛋白在在SAMMP較SSAMRR低，提提示其與與SAMMP的病病理表型型相關(guān)，可能也也是其壽壽命縮短短的因素素之一。 巖藻糖基基轉(zhuǎn)移酶酶-9(FUTT9)優(yōu)優(yōu)先在聚聚乳糖胺胺的的遠(yuǎn)遠(yuǎn)端GllcNAAc殘基基進(jìn)行巖巖藻糖基基化而在在Lewwis x糖類類表位抗抗原LLe(xx);CCD155;階段段特異性性胚胎抗抗原(SSSEAA-1)合成成中起重重要作用用(Niishiiharra ee

59、t aal.,19999)。Maii ett all. (19992, 19999)認(rèn)認(rèn)為，中中央聽覺覺系統(tǒng)CCD155的瞬時(shí)時(shí)表達(dá)與與其功能能狀態(tài)的的可塑性性相關(guān)，其起始始表達(dá)預(yù)預(yù)示著形形成不穩(wěn)穩(wěn)定性突突觸接觸觸的出現(xiàn)現(xiàn)。Oggisoo等(119955)研究究顯示，含Leewiss x的的新乳糖糖系列糖糖脂在老老年性白白內(nèi)障進(jìn)進(jìn)程中積積聚。CCD155水平反反映了發(fā)發(fā)育過程程中視網(wǎng)網(wǎng)膜膝膝狀彎曲曲的相互互作用程程度的差差異，CCD155在神經(jīng)經(jīng)纖維網(wǎng)網(wǎng)的表達(dá)達(dá)在建立立成熟的的經(jīng)驗(yàn)依依賴性相相互聯(lián)系系階段的的消失可可能預(yù)示示著與學(xué)學(xué)習(xí)記憶憶相關(guān)的的可塑性性的喪失失。本研研究顯示示FUTT 9在

60、在SAMMR1TTA 的的表達(dá)低低于SAAMP88/Taa,顯示示其與SSAMPP8/TTa的老老年性病病理表型型-學(xué)習(xí)習(xí)和識(shí)別別功能障障礙相關(guān)關(guān)。膠質(zhì)細(xì)胞胞源性神神經(jīng)營養(yǎng)養(yǎng)因子家家族受體體1 (GGFR1),是一種種膠質(zhì)細(xì)細(xì)胞源性性神經(jīng)營營養(yǎng)因子子（GDDNF）的糖基基磷脂酰酰肌醇錨錨受體，在副神神經(jīng)和發(fā)發(fā)育中的的外周感感覺神經(jīng)經(jīng)及交感感神經(jīng)元元表達(dá)為為膜結(jié)合合型和分分泌型。GDNNF是多多種類型型神經(jīng)元元的有效效存活因因子，GGDNFF與高親親和力GGFR1結(jié)合合。該受受體在腦腦的不同同區(qū)域表表達(dá)，包包括腦海海馬和齒齒狀回。Sarrabii等(220000)對(duì)GGFR-1表表達(dá)分布布研究后