分子生物學(xué)診斷技術(shù)進(jìn)展課件

1、分子生物學(xué)診斷技術(shù)進(jìn)展分子生物學(xué)診斷技術(shù)進(jìn)展主要內(nèi)容：分子生物學(xué)診斷技術(shù)在病原學(xué)檢測中的應(yīng)用簡單介紹實驗原理以PCR、熒光實時定量PCR、NASBA為例分子診斷技術(shù)在以下病原研究的應(yīng)用進(jìn)展乙型肝炎丙型肝炎結(jié)核分枝桿菌2主要內(nèi)容：分子生物學(xué)診斷技術(shù)在病原學(xué)檢測中的應(yīng)用4病原學(xué)檢測常用的實驗室技術(shù)細(xì)胞培養(yǎng)與鑒定（“金標(biāo)準(zhǔn)”）、動物實驗血清學(xué)、免疫學(xué)診斷技術(shù)電鏡技術(shù)分子生物學(xué)診斷技術(shù)3病原學(xué)檢測常用的實驗室技術(shù)細(xì)胞培養(yǎng)與鑒定（“金標(biāo)準(zhǔn)”）、動物分子生物學(xué)診斷技術(shù)方法簡介1、主體技術(shù)具體方法舉例 循環(huán)擴增PCR （聚合酶鏈反應(yīng)） Real-time PCR, RT-PCR，巢式PCR，復(fù)合PCR PC

2、R-ELISA，微孔板雜交，熒光探針標(biāo)記法LCR（連接酶鏈反應(yīng)） 恒溫NASBA（依賴核酸序列的擴增，主要用于RNA）SDA（鏈置換擴增術(shù)） CPT（環(huán)狀探針技術(shù) ）bDNA（枝鏈核酸信號放大系統(tǒng) ）雜交捕獲 （如：檢測HPV-DNA的試劑盒）4分子生物學(xué)診斷技術(shù)方法簡介1、主體技術(shù)具體方法舉例 循分子診斷技術(shù)方法簡介2、多標(biāo)靶同時檢測多重PCR毛細(xì)管電泳以測序分析為基礎(chǔ)的檢測技術(shù)5分子診斷技術(shù)方法簡介2、多標(biāo)靶同時檢測7分子診斷技術(shù)方法簡介3、核酸雜交DNA熒光原位雜交（FISH）將標(biāo)記的探針直接原位雜交到染色體或DNA纖維切片上，再用與熒光素分子偶聯(lián)的單克隆抗體與探針分子特異性結(jié)合來檢測D

3、NA序列在染色體或DNA纖維上的定位。 線性探針分析法（LiPA）雜交保護(hù)分析法（HPA）4、質(zhì)譜利用色、質(zhì)譜結(jié)合PCR技術(shù)6分子診斷技術(shù)方法簡介3、核酸雜交8分子診斷的功能及擴展病原的診斷和鑒別診斷病原分型病毒載量監(jiān)測-個體化治療的依據(jù)療效及預(yù)后標(biāo)志其他：病原感染中發(fā)生、發(fā)展各階段7分子診斷的功能及擴展9分子診斷的功能及擴展疾病分型及意義例如：HPV （30/100） 高危-16，18，31，45 低危- 6，118分子診斷的功能及擴展疾病分型及意義10分子診斷的功能及擴展病毒載量與治療 例1.-北京地壇醫(yī)院謝堯提供9分子診斷的功能及擴展病毒載量與治療 -北京地壇醫(yī)院謝堯提分子診斷的功能及擴

4、展病毒載量與治療例2. HBV-干擾素HBV100pg/mL 1/30 陰轉(zhuǎn)(HBeAg HBeAb)10分子診斷的功能及擴展病毒載量與治療12分子診斷的功能及擴展病毒載量與治療例3. HIV病毒載量與傳播15127人 流行病學(xué)調(diào)查415對伴侶30個月HIV陽轉(zhuǎn)22%（90/415）51人RNA1500copies/mL 全陰11分子診斷的功能及擴展病毒載量與治療13分子診斷的功能及擴展病毒載量與治療例4. 血漿EBV載量與鼻咽癌復(fù)發(fā)15個二年持續(xù)緩解： 0 copy/mL10個復(fù)發(fā)：32250 copies/mL17個隨訪：臨床惡化前半年病毒載量升高12分子診斷的功能及擴展病毒載量與治療14

5、耐藥病原的分子診斷WHO：人類死亡1/3是長期用藥的毒副作用HBV的YMDD變異HIV耐藥13耐藥病原的分子診斷15血制品篩查300余萬的血清陰性樣品，分子生物學(xué)復(fù)測：HBV：47HCV：10HIV-1：2 -2001年劍橋資料 HIV-1血清陰性而RNA陽性 0.2-6.6% -Am. J. Chin Athol. 200014血制品篩查300余萬的血清陰性樣品，分子生物學(xué)復(fù)測：16在基礎(chǔ)研究領(lǐng)域中的應(yīng)用；遺傳病的基因診斷和產(chǎn)前基因診斷：如血友病、地中海貧血等腫瘤基因和腫瘤標(biāo)志物表達(dá)(mRNA)的檢測；骨髓移植、器官移植供體配型選擇；法醫(yī)學(xué)、動植物學(xué)、古人類學(xué)、古生物學(xué)； 與疾病相關(guān)的各種蛋

6、白（細(xì)胞因子、酶、激素、受體）的基因表達(dá)的檢測；藥物基因組學(xué)、耐藥基因的檢測，等等分子生物學(xué)技術(shù)在其它領(lǐng)域的應(yīng)用15在基礎(chǔ)研究領(lǐng)域中的應(yīng)用；分子生物學(xué)技術(shù)在其它領(lǐng)域的應(yīng)用17簡單介紹實驗原理PCR(Polymerase Chain Reaction,聚合酶鏈反應(yīng)) 熒光實時定量PCR （real time PCR）NASBA （依賴核酸序列的擴增）16簡單介紹實驗原理PCR(Polymerase Chain PCR原理:實質(zhì)就是體外基因復(fù)制技術(shù)Mg2+dCTPdGTPdUTPdATPTaq DNA聚合酶 AmpErasePrimer靶序列加熱變性95 C靶序列引物退火55 C引物延伸72 C1

7、7PCR原理:實質(zhì)就是體外基因復(fù)制技術(shù)Mg2+dCTPdGTPPCR 循環(huán) 第一步 加熱變性靶序列靶序列從外周血白細(xì)胞或絨毛、羊水細(xì)胞提取的DNA約1ug，在含有適當(dāng)緩沖液、引物、dNTPs（dATP、dCTP、dGTP及dTTP）等的反應(yīng)混合物中，在94下熱變性1-4分鐘，使之解為單鏈。18PCR 循環(huán) 靶序列靶序列從外周血白細(xì)胞或絨毛、羊水細(xì)胞提PCR 循環(huán)第二步引物與靶序列退火靶序列靶序列Primer 1Primer 2BiotinBiotin53553533引物與解為單鏈的DNA上互補序列雜交在一起，稱之為退火。55左右19PCR 循環(huán)靶序列靶序列Primer 1Primer 2BiP

8、CR 循環(huán) 第三步 - 引物延伸靶序列靶序列Primer 1Primer 2BiotinBiotin53553533Taq DNAPolymerase在DNA聚合酶催化作用下，以dNTPs為原料（底物），從引物的3端A開始, 沿著53的方向，合成每條模板的互補鏈，此稱引物延伸。72左右20PCR 循環(huán) 靶序列靶序列Primer 1Primer 2B第1個PCR循環(huán)完成后靶序列 靶序列BiotinBiotin21第1個PCR循環(huán)完成后靶序列 靶序列BiotinBioti30次循環(huán)后靶序列擴增的數(shù)量No. ofNo. Amplicon CyclesCopies of Target122438416

9、532664201,048,576301,073,741,8241 cycle = 2 Amplicon2 cycle = 4 Amplicon3 cycle = 8 Amplicon4 cycle = 16 Amplicon5 cycle = 32 Amplicon6 cycle = 64 Amplicon7 cycle = 128 Amplicon2230次循環(huán)后靶序列擴增的數(shù)量No. ofNo. Ampli53RQ探針完整時，報告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號被淬滅基團(tuán)吸收，所以檢測不到熒光，此種現(xiàn)象稱為熒光共振能量轉(zhuǎn)移。熒光PCR原理 TaqManTM技術(shù)2353RQ探針完整時，報告基團(tuán)發(fā)射的熒光

10、信號被淬滅基團(tuán)吸收535353RQExtension Step531. Strand DisplacementTaq3QR5533QTaqR52. Cleavage3. PolymerizationComplete53QTaqR354. Detection533QTaqR5lR熒光PCR原理 TaqManTM技術(shù)24535353RQExtension Step5定量PCR測定的是擴增的指數(shù)擴增期;定性PCR測定的是擴增的終點（平臺期）定量PCR與定性PCR測定的區(qū)別25定量PCR測定的是擴增的指數(shù)擴增期;定量PCR與定性PCR測市場上常見的實時熒光PCR儀羅氏LightcyclerMJ opt

11、icon2伯樂icyclerABI7000杭州博日（原大和）linegene26市場上常見的實時熒光PCR儀羅氏LightcyclerMJ 臨床標(biāo)本核酸提取技術(shù)NASBA 擴增ECL-化學(xué)發(fā)光標(biāo)記檢測NASBA 擴增+分子燈塔檢測擴增過程中“分子燈塔” 即時同相檢測 方法 1 - NucliSens ECL方法 2 - NucliSens EasyQ加入裂解緩沖液和內(nèi)置標(biāo)準(zhǔn)NASBA測定原理27臨床標(biāo)本核酸提取技術(shù)NASBA 擴增ECL-化學(xué)發(fā)光標(biāo)記檢測NASBA擴增原理引物 1逆轉(zhuǎn)錄酶RNase H引物 2逆轉(zhuǎn)錄酶T7 RNA 聚合 酶引物 2逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄酶RNase H引物 1線性循環(huán)擴

12、增循環(huán)28NASBA擴增原理引物 1逆轉(zhuǎn)錄酶RNase H逆轉(zhuǎn)錄酶T7NASBA 和 PCR 的不同NASBA擴增目標(biāo)為RNA同溫擴增連續(xù)擴增擴增物為單鏈RNA引物次序不包含於最終產(chǎn)物中PCR擴增目標(biāo)為DNA溫度循環(huán)擴增循環(huán)擴增擴增物為雙鏈DNA引物次序包含於最終產(chǎn)物中29NASBA 和 PCR 的不同NASBAPCR31乙型肝炎檢測標(biāo)志物：HBsAg，抗-HBs,HBeAg，抗-Hbe,抗HBc (IgG,IgM),HBV-DNADane顆粒（完整的病毒）形態(tài)乙型肝炎的分子診斷30乙型肝炎檢測標(biāo)志物：Dane顆粒（完整的病毒）形態(tài)乙型肝炎的乙型肝炎的分子診斷1. 重要性全球 20億人感染慢性

13、 3.5億人中國、東南亞、非洲50肝硬化，70-90肝癌7-30攜帶者感染變異體31乙型肝炎的分子診斷332. HBV基因型與血清型關(guān)系及流行病學(xué)分布基因型與血清型不完全一致臨床突變率不同有地域分布特點乙型肝炎的分子診斷32乙型肝炎的分子診斷34表1：基因型血清學(xué)亞型基因長度(nt)臨床突變率主要流行地域PC*(G1896A)BCP*(1762/1764)Aadw2ayw132216.5（少）C185845（常）西歐、北歐、北美、中非、印度Badw2ayw1321550（常）T185816東南亞、中國、日本Cayr;adrq+;Adrq-;adr;adw2321550（常）T1858或C185

14、858（常）東南亞、中國、日本、澳洲、美國Dayw2;ayw3;ayw4318243%(常）T185812（低）地中海、俄羅斯、印度、美國33表1：基因型基因長度臨床突變率PC*BCP*Aadw232表1(續(xù)）:基因型血清學(xué)亞型基因長度(nt)臨床突變率主要流行地域PC*(G1896A)BCP*(1762/1764)Eayw4321227（中）7（低）西非Fayw4;adw2;Adw4q-321516（少）C1858未定中美、南美、波利尼西亞GAdw23248100（高）未定中美、美國、法國、德國Hadw43215未定未定中美、南美、美國PC*:前核心 BCP*:基本核心啟動子 （科華生物 2

15、004.07.21）34表1(續(xù)）:基因型基因臨床突變率PC*BCP*Eayw433. 基因型與臨床實驗室表現(xiàn)不同（表2）病情與轉(zhuǎn)歸：C較B差抗病毒治療：A優(yōu)于D B優(yōu)于C adw/ayw 20:1乙型肝炎的分子診斷35乙型肝炎的分子診斷37表2:B基因C基因HBeAg(+)少多免疫清除期短長嚴(yán)重急性加劇少多組織學(xué)活動性低高血清HBV-DNA水平低高PC1896突變率高低BCP雙突變率低高抗病毒治療應(yīng)答好差臨床轉(zhuǎn)歸（硬化、癌變）好差36表2:B基因C基因HBeAg(+)少多免疫清除期短長嚴(yán)重急性4. 一般實驗室分型方法測序PCR-RELP（限制性片斷長度多態(tài)性）PCR核酸雜交（譜線探針法）血清

16、學(xué)：單抗可區(qū)分A-F各基因型乙型肝炎的分子診斷37乙型肝炎的分子診斷395. 抗病毒治療的耐藥性問題拉米夫定耐藥性的檢測乙型肝炎的分子診斷38乙型肝炎的分子診斷40拉米夫定耐藥性的檢測耐藥性與HBV多聚酶基因YMDD氨基酸序列中的核酸變異有關(guān)I型：YMDD變異為HBV聚合酶基因(P區(qū)基因)區(qū)第741個核苷酸位,A-G置換，使第552個密碼子蛋氨酸(M)被纈氨酸(V)取代，成為YVDD變異II型：YMDD變異為P基因區(qū)743個核苷酸的G-T置換，使第55個密碼子蛋氨酸(M)被異亮氨酸(工)取代，成為YIDD變異 YMDD變異：Y（酪氨酸） M（蛋氨酸） V（纈）： YVDD變異 D（天冬氨酸）

17、I（異亮）：YIDD變異 D（天冬氨酸） 最近報道： YSDD （ATG AGT ） 應(yīng)用拉米夫定耐藥位點基因芯片檢測突變位點乙型肝炎的分子診斷39拉米夫定耐藥性的檢測乙型肝炎的分子診斷41乙型肝炎的分子診斷40乙型肝炎的分子診斷42乙型肝炎的分子診斷41乙型肝炎的分子診斷43HCV的基因型/亞型6個型，68個亞型 1a, b, c, d, e, f, g, h, i, j, k, l, m2a, b, c, d, e, f, g, h, i, k, l, m3a, b, c, d, e, f, g, h, i, k4a, c, d, e, f, g, h, k, l, m, n, o, p,

18、 q, r, s, t5a6a, b, d, f, g, h, i, j, k, l, m, n丙型肝炎的分子診斷42HCV的基因型/亞型6個型，68個亞型 1a, b, c, HCV基因分型方法測序型特異性引物PCR分型法 線性探針雜交（InnoLipa)限制性片段長度多態(tài)性分析（RFLP）TRUGENE HCV 5NC Genotyping Assay丙型肝炎的分子診斷43HCV基因分型方法測序丙型肝炎的分子診斷455UTR (5Non-Coding Region)高度保守HCV RNA診斷實驗的常用區(qū)域有一套良好的多態(tài)性特征，因此可用于基因分型 許多HCV分型商業(yè)試劑盒都采用該區(qū)進(jìn)行分型

19、TRUGENE HCV 5NC Genotyping AssayVERSANT HCV Genotyping Assay (LiPA)HCV NS5B區(qū)各亞型間基因差異較大擴增效率較低若成功擴增，序列分析可區(qū)別HCV各亞型。HCV基因分型常選用的區(qū)域丙型肝炎的分子診斷445UTR (5Non-Coding Region)HCV臨床工作目前常用的基因型檢測方法（RFLP, InnoLipa, Trugene) 通常建立在5非編碼區(qū)，因為該區(qū)序列保守，檢測靈敏度高，是HCV RNA診斷實驗的常用區(qū)域。在臨床工作中，對5UTR進(jìn)行分型的RFLP, InnoLipa, Trugene分型都可以滿足分型

20、的需要，為制定治療方案和判斷預(yù)后提供指導(dǎo)。常只需將1型和4型與其它基因型相區(qū)別，以決定抗病毒治療的療程和利巴韋林的劑量，因此上述的任何一種方法均可以采用。丙型肝炎的分子診斷45臨床工作目前常用的基因型檢測方法（RFLP, InnoLipHCV 5UTR geneSecond PCR product=257bpScheme ACleavage with BsrB,Hinfand Hae93 and 91bp Genotype 2a and 2b257bpGenotype 3b,4a and 5a127 and 91bp104,74bp160,74bp2a2b160,74bp234bp3b4a a

21、nd 5aCleavage with HaeScheme C Cleavage with Apo183,74bp257bp4a1b197bpGenotype 1a,1b and 6a166/169 and 91bp Cleavage with BstUScheme B 1a227bp5aGenotype3a6a257bp HCV 5非編碼區(qū)ABC程序復(fù)合酶切分型法流程圖 -北京大學(xué)人民醫(yī)院肝病研究所提供46HCV 5UTR geneSecond PCR produ抗HCV的確認(rèn)實驗確認(rèn)的重要性（灰區(qū)的遺漏）目的：解決血液篩查實驗（如ELISA）的非特異性問題方法：例如：PCR 活動性病毒血癥的

22、檢測是一個很好的檢測方法RIBA 3.0 抗體的確認(rèn)新流程：丙型肝炎的分子診斷47抗HCV的確認(rèn)實驗丙型肝炎的分子診斷49 抗-HCV篩查檢測報告陰性或根據(jù)S/Co比值判定為陽性所有陽性結(jié)果高S/Co比值陽性*報告低S/Co比值陽性*RIBA HCV檢測或陽性報告陰性報告不確定報告陽性陰性RIBA HCV檢測HCV RNA的NAT檢測陽性報告陰性報告不確定報告報告*以S/Co 3.8 (OCD HCV ELISA 3.0) 或 8.0 (OCD VITROS ECi/ECiQ HCV)為“界值”。CDC抗-HCV實驗室檢測結(jié)果報告導(dǎo)則48 抗-HCV篩查檢測報告陰性或根據(jù)S/Co比值判定靶序列

23、來源: a. 單抗檢出的TB抗原蛋白編碼基因b. TB特異性核酸片段克隆c. 插入序列結(jié)核分枝桿菌(TB) 的分子診斷TB 檢測實驗設(shè)計特點49靶序列來源: 結(jié)核分枝桿菌(TB) 的分子診斷TB 檢測實65KD，165bp;MPB64，240bp;IS6110，123bp;IS986，245bp; 16sDNA，584bp.舉例結(jié)核分枝桿菌(TB) 的分子診斷TB 檢測50舉例結(jié)核分枝桿菌(TB) 的分子診斷TB 檢測52 標(biāo)本處理 ：痰液化，抑制物去除 試劑質(zhì)控及靈敏度注意事項結(jié)核分枝桿菌(TB) 的分子診斷TB 檢測51 標(biāo)本處理 ：痰液化，抑制物去除注意事項結(jié)核分枝桿菌(TB 結(jié)核的PC

24、R臨床主要應(yīng)用 a.結(jié)核與其他分枝桿菌區(qū)分 b.結(jié)核耐藥基因 c.對含菌量低的標(biāo)本的分離 d.為臨床可疑者捕捉信息臨床評價結(jié)核分枝桿菌(TB) 的分子診斷TB 檢測52 結(jié)核的PCR臨床主要應(yīng)用 臨床評價結(jié)核分枝桿菌(TB) PCR方法與痰涂片及TB培養(yǎng)的比較 應(yīng)做比對研究臨床評價結(jié)核分枝桿菌(TB) 的分子診斷TB 檢測53 PCR方法與痰涂片及TB培養(yǎng)的比較臨床評價結(jié)核分枝桿菌(RFP（利福平）INH（異煙肼）SM（鏈霉素）EMB（乙胺丁醇）PZA（吡嗪酰胺）喹諾酮類已確定的耐藥的抗結(jié)核藥物結(jié)核分枝桿菌(TB) 的分子診斷耐藥監(jiān)測54RFP（利福平）已確定的耐藥的抗結(jié)核藥物結(jié)核分枝桿菌(TB)單耐藥基因檢測耐利福平：突變一般發(fā)生在RNA聚合酶B亞單位編碼基因（rpoB基因）突變位點：531位 絲氨酸亮氨酸526位 組氨酸酪氨酸突變導(dǎo)致RFP 不能與RNA聚合酶B亞單位結(jié)合耐異煙肼：與