微生物知識員工培訓(xùn)課件

1、微生物知識講座 一、 微生物 1.1 微生物基礎(chǔ)知識 1.2 微生物的營養(yǎng)和培養(yǎng)基 1.3 微生物的代謝二 、GMP相關(guān)微生物知識 2.1 什么是GMP 2.2 GMP對無菌操作方面的要求 三、ICHQ7A相關(guān)微生物知識 3.1 什么是ICHQ7A 3.2 ICHQ7A對無菌操作方面的要求 一、 微生物基礎(chǔ)知識微生物是一切肉眼看不見或看不清楚的微小生物的總稱。它們都是一些個(gè)體微?。ㄒ话?.1mm）、構(gòu)造簡單的低等生物，包括屬于原核類的細(xì)菌、放線菌、藍(lán)細(xì)菌、支原體、立克次氏體和衣原體；屬于真核類的真菌、原生動(dòng)物和顯微藻類；以及屬于非細(xì)胞類的病毒和亞病毒。微生物的分類原核生物：細(xì)菌(狹義的)、放線

2、菌、藍(lán)細(xì)菌、支原體、立克次氏體和衣原體。真核生物：真菌、顯微藻類和原生動(dòng)物等。非細(xì)胞微生物：病毒和亞病毒。原核生物細(xì)菌：細(xì)菌(bacteria)是一類細(xì)胞細(xì)短（直徑約0.5um，長約0.5um5um），結(jié)構(gòu)簡單、胞壁堅(jiān)韌、多以二分裂方式繁殖和水生性較強(qiáng)的原核生物。放線菌：放線菌(actinomycetes)是一類主要呈菌絲狀生長和以孢子繁殖的陸生性較強(qiáng)的原核生物。放線菌放線菌與人類關(guān)系極其密切，絕大多數(shù)屬有益菌。至今已報(bào)道過的近萬種抗生素中，約70由放線菌產(chǎn)生；本廠生產(chǎn)土霉素的龜裂鏈霉菌、生產(chǎn)新霉素的弗氏鏈霉菌、生產(chǎn)阿維菌素的除蟲鏈霉菌（也稱阿維鏈霉菌）都是放線菌的代謝產(chǎn)物。微生物的染色為什么

3、要染色 由于細(xì)菌細(xì)胞既微小又透明，故一般先要經(jīng)過染色才能作顯微鏡觀察。染色分類 以被染色菌染色后的狀態(tài)可以分為死菌染色和活菌染色。單染 用一種染色劑的稱單染，僅能對細(xì)菌形態(tài)觀察。 復(fù)染-革蘭氏染色 細(xì)菌先經(jīng)堿性染料結(jié)晶染色，而經(jīng)碘液媒染后，用酒精脫色，在一定條件下有的細(xì)菌此色不被脫去，有的可被脫去，因此可把細(xì)菌分為兩大類，前者叫做革蘭氏陽性菌（G+），后者為革蘭氏陰性菌（G-）。為觀察方便，脫色后再用一種紅色染料如堿性蕃紅等進(jìn)行復(fù)染。陽性菌仍帶紫色，陰性菌則被染上紅色。 1.2微生物的營養(yǎng)和培養(yǎng)基1.2.1、微生物細(xì)胞的化學(xué)組成1.2.2、六大營養(yǎng)要素及其生理功能1.2.3、培養(yǎng)基及其組成1.

4、2.1微生物細(xì)胞的化學(xué)組成微生物細(xì)胞的化學(xué)成分（干物質(zhì)）以有機(jī)物和無機(jī)物兩種狀態(tài)存在。有機(jī)物包含各種大分子，它們是蛋白質(zhì)、核酸、類脂和糖類，占細(xì)胞干重的99%。無機(jī)成分包括小分子無機(jī)物和各種離子，占細(xì)胞干重的1%。水也是微生物細(xì)胞的重要組成成分，通常微生物細(xì)胞70%是水。幾種微生物的元素組成（干重 %）元素細(xì)菌酵母霉菌C505345504063H777N12157.5 11710P230.82.60.44.5S0.210.010.240.10.5K14.5140.22.5Na0.510.010.10.020.5Ca0.011.50.10.30.11.4Mg0.10.50.10.50.10.51

5、.2.2 微生物的六大營養(yǎng)要素碳源氮源無機(jī)鹽能源生長因子水（一）、碳源（Carbon source ）定義：能提供微生物營養(yǎng)所需碳元素的營養(yǎng)物質(zhì)稱為碳源。功能：提供合成細(xì)胞物質(zhì)及代謝物的原料;并為異養(yǎng)微生物生理活動(dòng)提供所需要能源。種類: 無機(jī)含碳化合物（無機(jī)碳源）：如CO2和碳酸鹽等。 有機(jī)含碳化合物（有機(jī)碳源）：糖與糖的衍生物、脂類、醇類、有機(jī)酸、烴類、芳香族化合物以及各種含碳的化合物。微生物在元素水平上的最適碳源是：CHO型。糖類有機(jī)酸類醇類脂類單糖雙糖多糖己糖戊糖葡萄糖、果糖甘露糖、半乳糖； 純多糖雜多糖； 淀粉纖維素。微生物工業(yè)發(fā)酵中用做碳源的原料 傳統(tǒng)種類：糖類（糖蜜等）、淀粉（玉米

6、粉、山芋粉、秈米粉、野生植物淀粉等）、麩皮、米糠等。 注：糖蜜中主要的糖類物質(zhì)為蔗糖，蔗糖為非還原糖。淀粉酶配料中淀粉必須經(jīng)常淀粉酶水解方可使用。土霉素生產(chǎn)中所使用的淀粉酶為7658淀粉酶，這是一種淀粉酶，其主要作用于葡萄糖單位的1、4糖苷鍵。淀粉酶加量并非越多越好，過量使用會使料液中還原糖高，從而光長菌絲不長單位。還原糖和非還原糖能夠還原斐林(H.von Fehling)試劑的糖稱為還原糖，所有的單糖，不論醛糖、酮糖都是還原糖。大部分雙糖也是還原糖，蔗糖例外。葡萄糖效應(yīng)。當(dāng)大腸桿菌培養(yǎng)于含有葡萄糖和乳糖的培養(yǎng)基中，菌體出現(xiàn)兩次生長旺盛期，這是菌首先利用葡萄糖進(jìn)行生長繁殖，在葡萄糖耗盡后，過一

7、段時(shí)間菌體才開始利用乳糖。在上述培養(yǎng)基中即使加入乳糖酶誘導(dǎo)物，葡萄糖沒耗盡，利用乳糖的酶系也不能合成。碳分解產(chǎn)物的阻抑作用普遍存在于微生物的生化代謝中。 速效碳源與遲效碳源葡萄糖是速效碳源，加入培養(yǎng)基后，菌體迅速利用。淀粉等是遲效碳源，需要等葡萄糖消耗到一定濃度以下才開始利用。淀粉的利用方式是通過分泌到胞外的淀粉酶將淀粉水解成小分子的葡萄糖以后，才可以利用。速效碳源有利于菌體生長，遲效碳源有利于產(chǎn)物生成。在抗生素生產(chǎn)的中后期，加入過量的葡萄糖，菌體會立刻停止產(chǎn)抗生素，轉(zhuǎn)入二次生長。（二）氮源（Nitrogen source ）定義：凡用來構(gòu)成菌體物質(zhì)或代謝產(chǎn)物中氮素來源的營養(yǎng)源。種類：無機(jī)氮源

8、：銨鹽、硝酸鹽、亞硝酸鹽、氨、N2等； 有機(jī)氮源：蛋白質(zhì)及其降解產(chǎn)物（如胨、肽、尿素、氨基酸等）、牛肉膏、魚粉、花生餅粉、黃豆餅粉、玉米漿等。 功能： 1）提供合成細(xì)胞中含氮物，如蛋白質(zhì)、核酸以及含氮代謝物等的原料； 2）少數(shù)細(xì)菌可以銨鹽、硝酸鹽等氮源為能源。培養(yǎng)基中氮源的利用蛋白氮必須通過水解之后降解成胨、肽、氨基酸等才能被機(jī)體利用，這種氮源叫遲效氮源。無機(jī)氮源或以蛋白質(zhì)降解產(chǎn)物形式存在的有機(jī)氮源可以直接被菌體吸收利用，這種氮源叫做速效氮源。速效氮源，通常有利于機(jī)體的生長，遲效氮源有利于代謝產(chǎn)物的形成。玉米漿是速效氮源，利于菌體生長；花生餅粉和黃豆餅粉是遲效氮源，利于代謝產(chǎn)物積累。微生物對銨

9、鹽和硝酸鹽類氮源利用能力強(qiáng)，可直接吸收利用，是速效氮源。生理酸性鹽和生理堿性鹽銨阻遏 銨分解產(chǎn)物的調(diào)節(jié)作用指的是被菌體迅速利用的氮源（特別是銨）能阻抑某些參與含氮化合物代謝的酶的合成。 與葡萄糖效應(yīng)較為相似，在土霉素生產(chǎn)中，氨水與玉米漿的流加速度要適量，否則會影響抗生素的合成。豆粉的制作及分類發(fā)酵培養(yǎng)基中經(jīng)常會用到豆粉作為氮源，常見的如高溫豆粉，低溫豆粉等。豆子豆粉的生產(chǎn)主要如下：先將豆子壓榨出油，（根據(jù)客戶對殘留脂肪含量的要求不同），可以壓榨一次、二次甚至三次（壓榨次數(shù)越多，殘留脂肪含量就越少），再對豆餅進(jìn)行炒制，最后進(jìn)行磨粉，這些豆粉的在制作工藝上區(qū)別主要在于豆餅炒制溫度不同和達(dá)到炒制要求

10、溫度后豆餅維持溫度時(shí)間的長短差異。經(jīng)過高溫炒制等物理過程后，細(xì)胞膜上的磷脂雙分子層、ATP等大分子斷裂后，形成磷酸根形式就可以檢測出來了。（三）無機(jī)鹽（inorganic salt）定義：為微生物細(xì)胞生長提供碳、氮源以外的多種重要元素（包括大量元素和微量元素）的物質(zhì)，多以無機(jī)鹽的形式供給。大量元素：生長所需濃度在103104mol/L范圍內(nèi)。如：P、S、K、Mg、Ca、Na、Fe等。 微量元素：生長所需濃度在106108 mol/L范圍內(nèi)。如：Cu、Zn、Mn、Mo和Co、Ni、Se、Sn等。一般微生物生長所需要的無機(jī)鹽有：硫酸鹽、磷酸鹽、氯化物以及含有鈉、鉀、鎂、鐵等金屬元素的化合物。磷以土

11、霉素為例，培養(yǎng)中溶磷含量對菌體和效價(jià)單位有著相當(dāng)大的影響。在種子和發(fā)酵培養(yǎng)基中，溶磷主要存在于3種組份：玉米漿、高溫豆餅粉、磷酸二氫鉀。注：豆餅粉中的溶磷在炒制過程中，一部分分解為小分子物質(zhì)，可以被檢測出來。另一部分仍以各種有機(jī)大分子的形式存在，無法測量。培養(yǎng)基中溶磷的計(jì)算與實(shí)際測量：豆粉中磷含量=豆粉(配比g/ml)含量(ug/g) 高溫黃豆餅粉磷含量參考值：2600ug/g玉米漿磷含量=玉米漿(配比g/ml)含量(ug/g) 玉米漿干物質(zhì)磷含量的參考值：12000ug/g 磷酸二氫鉀中磷含量=227941配比(g/ml)培養(yǎng)基中磷的總量(ug/ml)=+土霉素發(fā)酵培養(yǎng)基：理論計(jì)算，溶磷11

12、6，生化測定為92.6。磷酸鹽調(diào)節(jié) 磷酸鹽不僅是菌體生長的主要限制性營養(yǎng)成分，還是調(diào)節(jié)次級代謝產(chǎn)物生物合成的重要因素。過量的磷酸鹽也象葡萄糖一樣抑制次級代謝產(chǎn)物的合成，這種抑制作用被稱為磷酸鹽調(diào)節(jié)。 在發(fā)酵生產(chǎn)過程中（以土霉素為例），補(bǔ)入磷源后，尾氣中CO2升高，活菌數(shù)升高。但補(bǔ)入過多，會使生長轉(zhuǎn)入初級代謝，從而影響效價(jià)增長。 篩選耐受高磷酸鹽的生產(chǎn)用菌株，對于生產(chǎn)會有很大的幫助作用（例如在補(bǔ)料過程）。生長因子生長因子一類微生物生命活動(dòng)過程中調(diào)節(jié)微生物正常代謝所必需、需要量不大的、但不能用簡單的碳源或氮源自身合成的有機(jī)營養(yǎng)物。廣義生長因子維生素、卟啉、堿基、氨基酸、嘌呤、嘧啶及其衍生物、C4C

13、6脂肪酸、營養(yǎng)缺陷型氨基酸狹義生長因子維生素生長因子來源酵母膏（yeast extract）、牛肉膏（beef extract）、麥芽汁（malt extract）、玉米漿（cornsteep liquor）、蔬菜汁、麩皮、米糠等。水1）溶劑和運(yùn)輸介質(zhì)，營養(yǎng)物質(zhì)吸收及代謝物分泌2）參與細(xì)胞內(nèi)的生化反應(yīng)3）維持蛋白質(zhì)、核酸穩(wěn)定天然構(gòu)象4）熱的良好導(dǎo)體，控制細(xì)胞內(nèi)溫度變化5）維持細(xì)胞自身正常形態(tài)6）控制酶、微管、鞭毛等多亞基結(jié)構(gòu)組裝和解離1.2.3 培養(yǎng)基（medium）定義：應(yīng)科研或生產(chǎn)的需要，由人工配制的、適合于不同微生物生長繁殖或積累代謝產(chǎn)物用的營養(yǎng)基質(zhì)（混合養(yǎng)料）。用途：促使微生物生長；積

14、累代謝產(chǎn)物；分離微生物菌種；鑒定微生物種類；微生物細(xì)胞計(jì)數(shù)；菌種保藏；制備微生物制品。任何培養(yǎng)基都應(yīng)具備微生物所需要的六大營養(yǎng)要素，且應(yīng)比例適當(dāng)！培養(yǎng)基一旦配成必須立即滅菌。培養(yǎng)基的選擇 培養(yǎng)基的應(yīng)用目的： 是培養(yǎng)菌體還是積累代謝產(chǎn)物？ 是實(shí)驗(yàn)室種子培養(yǎng)還是大規(guī)模發(fā)酵？ 代謝產(chǎn)物是初級代謝產(chǎn)物還是次級代謝產(chǎn)物？用于種子培養(yǎng)的培養(yǎng)基營養(yǎng)應(yīng)豐富，氮源含量宜高（碳氮比低）；用于大量生產(chǎn)代謝產(chǎn)物的培養(yǎng)基：氮源一般應(yīng)比種子培養(yǎng)基稍低（若發(fā)酵產(chǎn)物是含氮化合物時(shí)，有時(shí)還應(yīng)提高培養(yǎng)基的氮源含量）；大規(guī)模發(fā)酵用的培養(yǎng)基，應(yīng)重視培養(yǎng)基中各成份的來源和價(jià)格，應(yīng)選擇來源廣泛、價(jià)格低廉的原料，提倡以粗代精，以廢代好。

15、營養(yǎng)協(xié)調(diào)培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質(zhì)的濃度 濃度過高微生物的生長起抑制作用， 濃度過小不能滿足微生物生長的需要。各營養(yǎng)物質(zhì)之間的比例 各營養(yǎng)要素之間比例（10倍遞減規(guī)律） H20C+能源N源P、SK、Mg生長因子 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6碳氮比（C/N）:直接影響微生物生長與繁殖及代謝物的形成與積累，故常作為考察培養(yǎng)基組成時(shí)的一個(gè)重要指標(biāo)；速效性氮（或碳）源與遲效性氮（或碳）源的比例。碳氮比（C/N）培養(yǎng)基分類用于培養(yǎng)菌體種子的培養(yǎng)基營養(yǎng)應(yīng)豐富，氮源含量宜高（碳氮比低）；用于大量生產(chǎn)代謝產(chǎn)物的培養(yǎng)基其氮源一般應(yīng)比種子培養(yǎng)基稍低，（但若發(fā)酵產(chǎn)物是含氮化合物時(shí)，有時(shí)還應(yīng)提高培

16、養(yǎng)基的氮源含量）；若代謝產(chǎn)物是次級代謝產(chǎn)物時(shí)要考慮是否加入特殊元素或特定的代謝產(chǎn)物；當(dāng)所設(shè)計(jì)的是大規(guī)模發(fā)酵用的培養(yǎng)基時(shí)，應(yīng)重視培養(yǎng)基中各成份的來源和價(jià)格，應(yīng)選擇來源廣泛、價(jià)格低廉的原料，提倡以粗代精，以廢代好。影響種子質(zhì)量的因素一、原材料質(zhì)量：如四環(huán)素、土霉素生產(chǎn)中配制孢子培養(yǎng)基的麩皮、瓊脂的牌號等。 原料質(zhì)量的波動(dòng)，起主要作用的是其中的無機(jī)鹽含量的不同，如微量元素Mg、Ca、Ba能刺激孢子的形成。P含量的多少也影響種子的質(zhì)量。二、培養(yǎng)條件：溫度、pH值、濕度、培養(yǎng)時(shí)間和冷藏時(shí)間都影響種子質(zhì)量。如土霉素生產(chǎn)菌種龜裂鏈霉菌的孢子，在北方干燥地區(qū)孢子斜面長的快，在含少量水分的試管斜面培養(yǎng)基中下部孢

17、子長的好，而上部孢子稀少；氣溫高，濕度大的地區(qū)，斜面孢子長的慢，試管下部冷凝水多而不利于孢子形成。據(jù)資料記載，土霉素一般相對濕度4045時(shí)孢子數(shù)量最多，孢子顏色均勻，質(zhì)量較好。培養(yǎng)基的pH值各類微生物的最適生長pH值各不相同 細(xì) 菌：7.08.0 放線菌：7.58.5 酵母菌：3.86.0 霉 菌：4.05.8在微生物的生長和代謝過程中，由于營養(yǎng)物質(zhì)的利用和代謝產(chǎn)物的形成與積累，培養(yǎng)基的初始pH值會發(fā)生改變。 pH值調(diào)節(jié)方式內(nèi)源調(diào)節(jié)：在培養(yǎng)基里加一些緩沖劑或不溶性的碳酸鹽調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH值（最常見的如CaCO3）。外源調(diào)節(jié)：按實(shí)際需要不斷向發(fā)酵液流加酸或堿液（如土霉素生產(chǎn)中流加氨水調(diào)節(jié)pH值變

18、化）。微生物的生命活動(dòng)對環(huán)境pH值的影響配制培養(yǎng)基時(shí)應(yīng)注意的幾個(gè)問題及解決方法混濁和沉淀膠體強(qiáng)度的破壞褐色物質(zhì)的形成pH發(fā)生變化泡沫可能與培養(yǎng)基中含有2價(jià)、3價(jià)金屬離子和可溶性磷酸鹽有關(guān)（加螯合劑）pH值降到4.5以下，瓊脂固體培養(yǎng)基滅菌后，瓊脂被熱水解而不再凝固，或凝固不堅(jiān)還原糖類、蛋白質(zhì)與氨基酸在高壓、高溫下相互作用的結(jié)果，“焦化”或美拉德反應(yīng)滅菌后pH會降低（糖分在高溫下分解為小分子的酸性物質(zhì)），在培養(yǎng)基滅菌前后加以調(diào)整加入消泡劑，適當(dāng)提高滅菌溫度或延長滅菌時(shí)間美拉德反應(yīng)：即葡萄糖與氨基酸所發(fā)生的系列化學(xué)反應(yīng)而產(chǎn)生的產(chǎn)物（如氨基糖）。小知識-輕鈣與重鈣輕鈣：又稱為沉淀碳酸鈣、沉降碳酸鈣輕

19、質(zhì)超細(xì)碳酸鈣，俗稱輕鈣。是將石灰石等原料段燒生成石灰和二氧化碳，再加水消化石灰生成石灰乳（主要成分氫氧化鈣），通入二氧化碳碳化石灰乳生成碳酸鈣沉淀，經(jīng)脫水、干燥和粉碎制得。 重鈣：就是方解石粉，是“重質(zhì)碳酸鈣”的簡稱，是礦石粉天然粉碎制的。1.3 微生物的代謝1.3.1 微生物的能量代謝1.3.2 分解代謝和合成代謝的聯(lián)系1.3.3 微生物的代謝調(diào)節(jié)與發(fā)酵生產(chǎn) 代謝概論新陳代謝(metabolism)：簡稱代謝,是細(xì)胞內(nèi)發(fā)生的各種化學(xué)反應(yīng)的總稱。分解代謝合成代謝分解代謝（catabolism） 分解代謝：指細(xì)胞將大分子物質(zhì)降解成簡單的小分子物質(zhì)并產(chǎn)生能量的過程。1)多糖 單糖 丙酮酸/乙酰輔酶A CO2，H20，能量（三羧酸循環(huán)）2)蛋白質(zhì) 氨基酸3)脂類