醫(yī)學資料溶血檢驗

1、節(jié)溶血性貧血的實驗室檢測11 溶血性貧血（hemolytic anemia）是由于各種原因?qū)е录t細胞生存時間縮短、破壞增多或加速，而骨髓造血功能不能相應代償而發(fā)生的一類貧血。2溶血性貧血的分類：31.按先天性、獲得性和發(fā)病機理分類：先天性膜缺陷遺傳性球形紅細胞增多癥酶缺乏葡萄糖-6-磷酸脫氫酶缺乏癥，丙酮酸激酶缺乏癥 珠蛋白合成障礙異常血紅蛋白病 獲得性免疫因素自身免疫性溶血性貧血膜的因素PNH物理因素微血管病性溶血性貧血化學因素鉛中毒其它脾功能亢進42.按溶血發(fā)生的部位分類：血管內(nèi)溶血：為紅細胞在血管內(nèi)（血液循環(huán)）中直接破壞，釋放出血紅蛋白到血漿中形成血紅蛋白血癥。多為獲得性，常急性發(fā)作。血

2、管外溶血：為紅細胞在血管外，即脾臟等單核-吞噬細胞系統(tǒng)被吞噬破壞，之后血紅蛋白就地分解代謝。多為先天性，呈慢性發(fā)作?；颊叱Ｓ衅⒋?。53.按溶血發(fā)生的急慢分類 急性溶血：起病急，有發(fā)熱及全身癥狀。重者可發(fā)生休克、急性腎功能衰竭。紅細胞及血紅蛋白急劇下降，出現(xiàn)血紅蛋白血癥和血紅蛋白尿癥。發(fā)作12小時后可發(fā)生黃疸。慢性溶血：起病緩慢。除可代償者無明顯表現(xiàn)外，常出現(xiàn)貧血、黃疸和脾腫大。6一、溶血性貧血的篩查試驗：（一）血漿游離血紅蛋白測定參考值50mg/L(1-5mg/dL)臨床意義血管內(nèi)溶血時血漿游離血紅蛋白明顯升高。血管外溶血時正常。自身免疫性溶血性貧血、珠蛋白生成障礙性貧血可輕度升高。7一、溶血

3、性貧血的篩查試驗：（二）血漿結(jié)合珠蛋白：（Hp）參考值0.7-1.5g/L(70-150mg/dL)臨床意義減低：見于各種溶血時，以血管內(nèi)溶血減低為顯著。肝臟疾病、傳單、先天性無結(jié)合珠蛋白血癥。增高：見于感染、創(chuàng)傷、惡性腫瘤、SLE、糖皮質(zhì)激素、口服避孕藥、肝外阻塞性黃疸。8一、溶血性貧血的篩查試驗（三）血漿高鐵血紅素清蛋白測定正常值 陰性臨床意義 陽性表示為嚴重血管內(nèi)溶血（四）紅細胞壽命測定用51Cr標記紅細胞檢測紅細胞半衰期。正常紅細胞半衰期為25-32天。溶血性貧血時常小于15天。這是確定溶血性貧血的可靠方法。9一、溶血性貧血的篩查試驗（五）尿含鐵血黃素試驗（Rous試驗）原理鐵離子在酸

4、化的低鐵氰化鉀溶液中生成藍色的鐵氰化鉀，即普魯士蘭反應。如尿液中脫落的腎小管上皮細胞有含鐵血黃素，顯微鏡下觀察可有深藍色物質(zhì)出現(xiàn)，即為陽性。正常值 陰性臨床意義 慢性血管內(nèi)溶血可呈陽性，并持續(xù)數(shù)周。常見于PNH。在溶血初期可呈陰性。10二、紅細胞膜缺陷的檢測（一）紅細胞滲透脆性試驗原理 紅細胞在低滲氯化鈉溶液中細胞逐漸膨脹甚至破裂而溶血。該試驗是測定紅細胞對不同濃度低滲氯化鈉溶血的抵抗力，即紅細胞滲透脆性。將患者的紅細胞加至按比例配置的不同濃度低滲氯化鈉溶液中觀察其溶血的情況，結(jié)果以被檢紅細胞最小抵抗力（開始溶血時氯化鈉溶液的濃度）和最大抵抗力（完全溶血時氯化鈉溶液的濃度）來表示。參考值 開始

5、溶血：0.42-0.46%（4.2-4.6g/L）NaCl溶液 完全溶血： 0.28-0.34%（2.8-3.4g/L）NaCl溶液臨床意義脆性增高：見于遺傳性球形細胞增多癥，溫抗體型自身免疫溶血性貧血、遺傳性橢圓型細胞增多癥脆性減低：見于海洋性貧血、缺鐵性貧血、某些肝硬化和阻塞性黃疸等。11二、紅細胞膜缺陷的檢測（二）紅細胞孵育滲透脆性試驗原理 紅細胞孵育過程中，葡萄糖的消耗增加，儲備的ATP減少，導致紅細胞膜對陽離子的主動傳遞受阻，鈉離子在紅細胞內(nèi)集聚，細胞膨脹，滲透脆性增加。參考值未孵育：50%溶血為4.00-4.45g/LNaCl37孵育24小時：50%溶血為4.65-5.9g/LNa

6、Cl臨床意義常用于輕型遺傳性球形細胞增多癥、遺傳性非球形細胞溶血性貧血的診斷和鑒別診斷。脆性增高：見于遺傳性球形細胞增多癥、遺傳性橢圓形細胞增多癥、遺傳性非球形細胞溶血性貧血。脆性減低：見于珠蛋白生成障礙性貧血、缺鐵性貧血、廉狀細胞貧血、脾切除術后。12二、紅細胞膜缺陷的檢測（三）自身溶血試驗及其糾正試驗原理先天性非球形細胞溶血性貧血患者，由于紅細胞內(nèi)酶缺陷，葡萄糖酵解障礙，不能提供足量ATP,以維持紅細胞內(nèi)的鈉泵作用?；颊呒t細胞無菌條件下在自身血漿中溫育48小時，使ATP儲備減少，鈉泵作用減弱，導致溶血增強。在孵育過程中，分別加入葡萄糖及加入ATP作為糾正物，并以氯化鈉溶液為對照，觀察溶血是

7、否能被糾正。參考值正常人紅細胞經(jīng)孵育48h后，僅輕微溶血、溶血度3.5%;加入葡萄糖及ATP孵育，溶血明顯糾正，溶血度均75%; 高鐵血紅蛋白 0.3-1.3g/L臨床意義減低：蠶豆病和伯氨喹型藥物溶血性貧血患者由于G6PD缺陷，高鐵血紅蛋白還原率明顯下降。14三、紅細胞酶缺陷的檢測（二）氰化物-抗壞血酸試驗 原理抗壞血酸與HbO2反應，氰化鈉能抑制過氧化氫酶以使H2O2不受影響，從而使H2O2與還原型谷胱甘肽（GSH)發(fā)生反應，產(chǎn)生氧化型谷胱甘肽（GSSG)，后者需要NADPH使其再還原為GSH。如紅細胞中催化NADPH形成的酶（如G6PD)缺乏，則GSH產(chǎn)生減少，使H2O2蓄積， HbO2

8、 被氧化成為棕色的高鐵血紅蛋白。如紅細胞不缺乏G6PD則GSH活性正常， HbO2即被還原失效， HbO2仍呈鮮紅色。臨床意義正常血液要在幾小時以后才變成暗色。純合子G6PD缺乏的血液變成棕色（巧克力色），在2h內(nèi)即變色，雜合子者要3-4h變色。15三、紅細胞酶缺陷的檢測（三）變形珠蛋白小體生成試驗原理 G6PD缺乏可致紅細胞內(nèi)的還原型谷胱甘肽含量減少，隨之出現(xiàn)高鐵血紅蛋白增高。最后形成變性珠蛋白小體（Heinz bodies)。取G6PD缺陷者血液，然后加乙酰苯肼于被檢血樣及對照標本中，37溫育2-4h，推薄血片，用1%煌焦油藍染色。計算含5個或更多珠蛋白小體的紅細胞比率。參考值 參考值30

9、%臨床意義G6PD缺陷癥，不穩(wěn)定Hb、HbH病等常高于45%16三、紅細胞酶缺陷的檢測（四）葡萄糖-6-磷酸脫氫酶熒光斑點試驗和活性測定原理在G6PD和NADP存在下，G6PD能使NADP還原成NADPH，后者在紫外線照射下會發(fā)出熒光。NADPH的吸收峰在波長340nm處，可通過單位時間生成NADPH的量來測定G6PD活性。參考值 正常人有甚強熒光。正常人酶活性為（4.971.43）U/gHb臨床意義G6PD缺陷癥熒光很弱或無熒光；雜合子或某些G6PD變異體則可能有輕到中度熒光。17三、紅細胞酶缺陷的檢測（五）丙酮酸激酶熒光篩選試驗和活性測定原理 在二磷酸腺苷（ADP）存在條件下，丙酮酸激酶催

10、化烯醇式磷酸丙酮酸變?yōu)楸幔谳o酶還原型（NADH）存在情況下，丙酮酸被乳酸脫氫酶作用轉(zhuǎn)變成乳酸，若熒光標記于NADH上此時有熒光的NADH變?yōu)闊o熒光的NAD。參考值 正常丙酮酸激酶（PK）活性熒光在20分鐘內(nèi)消失。酶活性（15.14.99）U/gHb臨床意義PK嚴重缺乏（純合子）熒光60分鐘不消失；雜合子者熒光25-60分鐘消失。18四、珠蛋白生成異常的檢測(一)血紅蛋白電泳原理 基本原理與血清蛋白電泳相同。參考值正常人的電泳圖譜顯示4條區(qū)帶，最靠陽極端的為量多的HbA, 其后為量少的HbA2,再后兩條量更少的紅細胞內(nèi)的非血紅蛋白成分（NH1和NH2）。 臨床意義 HBA2增高：是診斷輕型

11、地中海貧血的重要依據(jù)。 HBA2減低：見于缺鐵性貧血及鐵粒幼細胞貧血。1920四、珠蛋白生成異常的檢測（二）胎兒血紅蛋白酸洗脫試驗原理 HbF抗酸能力較HbA強。因此，經(jīng)固定后的血片，置酸性緩沖液中保濕一定時間，只有含HbF的紅細胞不被洗脫，再用伊紅染色而呈鮮紅色。參考值臍帶血、新生兒、嬰兒陽性，成人1%。臨床意義地中海貧血患者輕型者（雜合子）僅少數(shù)紅細胞呈陽性，重型者陽性紅細胞明顯增多。21四、珠蛋白生成異常的檢測（三）胎兒血紅蛋白測定或HbF堿變性試驗原理 在堿性溶液中， HbF不易變性沉淀，其他Hb在堿性溶液中可變性被沉淀。測定其濾液中Hb含量，即HbF含量。參考值成人2%。新生兒55-

12、85%，1歲左右同成人。臨床意義增高：地中海貧血明顯增高，重型者高達80-90%。急性白血病、再生障礙性貧血、紅白血病、淋巴瘤等也可輕度增高。22四、珠蛋白生成異常的檢測（四）HbA2定量測定參考值1.1-3.2%。臨床意義 同血紅蛋白電泳。（五）限制性內(nèi)切酶譜分析根據(jù)患者DNA限制性內(nèi)切酶圖譜的變化或限制性內(nèi)切酶降解DNA片段長度的多態(tài)性，來分析是否存在珠蛋白基因的突變、缺失等缺陷，為Hb病的基因診斷。 此外，還有其他檢測方法：異丙醇試驗、熱變性試驗、血紅蛋白H 包涵體檢查、紅細胞鐮變(HbS) 試驗、HbS 溶解度試驗、血紅蛋白C 試驗等。23五、自身免疫性溶血性貧血檢測 自身免疫性溶血性

13、貧血（autoimmune hemolytic anemia,AIHA）系體內(nèi)免疫反應發(fā)生變異，產(chǎn)生自身抗體或（和）補體，結(jié)合在紅細胞膜上，使紅細胞破壞加速而引起的一組溶血性貧血。24五、自身免疫性溶血性貧血檢測（一）抗人球蛋白試驗（Coombs test)原理不完全抗體無法架接兩個相鄰的紅細胞，而只能和一個紅細胞表面抗原結(jié)合。抗人球蛋白抗體是完全抗體，可與多個不完全抗體的Fc段結(jié)合，導致紅細胞產(chǎn)生凝集，稱為抗人球蛋白試驗陽性。直接抗人球蛋白試驗陽性說明病人紅細胞表面上包被有不完全抗體，而間接抗人球蛋白試驗陽性說明患者血清中含有不完全抗體?！緟⒖贾怠恐苯?、間接法均呈陰性反應。2526五、自身免

14、疫性溶血性貧血檢測（一）抗人球蛋白試驗（Coombs test)臨床意義1、陽性 見于新生兒溶血病、AIHA、SLE、RF、惡性淋巴瘤、甲基多巴等藥物性溶血反應。2、AIHA大多屬于溫抗體型（即于37條件下作用最強，主要為IgG),但也有小部分屬冷抗體型（IgM）,必要時應用于4 條件下進行試驗，排除假陰性反應。3、AIHA大多為IgG型抗體，也有少數(shù)IgG亞型、IgA、IgM型，應使用廣譜的抗人球蛋白血清進行試驗，以提高檢出陽性率。4、間接Coombs 試驗 主要用于Rh或ABO妊娠免疫性新生兒溶血病母體血清中不完全抗體的檢測。很少用于AIHA診斷。27五、自身免疫性溶血性貧血檢測（二）冷凝

15、集素試驗原理 冷凝集素是一種可逆性抗體，在低溫時可與自身紅細胞、“O”型紅細胞或與患者同型紅細胞發(fā)生凝集，當溫度增高時，凝集塊又復消失。參考值效價1:40,反應最適溫度為4。臨床意義某些AIHA患者的冷凝集素效價很高，有的可達64000或更高。28五、自身免疫性溶血性貧血檢測（三）冷熱雙相溶血試驗原理 陣發(fā)性寒冷性血紅蛋白尿癥（PCH）患者的血清中有雙相溶血素，在0-4 時，溶血素與紅細胞結(jié)合，并吸附補體，但不溶血；當升溫至30-37 則發(fā)生溶血。參考值陰性。臨床意義陽性見于PCH。某些病毒感染如麻疹、流行性腮腺炎、水痘、傳染性單核細胞增多癥也可有陽性反應。29六、陣發(fā)性睡眠型血紅蛋白尿檢測P

16、NH為獲得性紅細胞膜缺陷引起的慢性血管內(nèi)溶血，常在睡眠時加重，可伴發(fā)作性血紅蛋白尿和全血細胞減少癥。（一）酸化溶血試驗原理又稱Ham試驗。PNH患者的紅細胞對補體敏感性增高，在酸化的血清中（pH6.6-6.8），經(jīng)37 孵育，易溶血。參考值陰性臨床意義陽性見于PNH, 某些AIHA發(fā)作時也可陽性。30六、陣發(fā)性睡眠型血紅蛋白尿檢測（二）蔗糖溶血試驗原理蔗糖溶液離子濃度低，經(jīng)孵育可加強補體與紅細胞膜的結(jié)合，使PNH患者的紅細胞膜上形成小孔，遂使蔗糖進入紅細胞而導致溶血。參考值陰性臨床意義PNH常為陽性。也可見于巨幼細胞貧血、AA、AIHA和遺傳性球形細胞增多癥?？勺鳛镻NH的篩選試驗，陰性可排除

17、PNH, 陽性應再做Ham試驗。（三）蛇毒因子溶血試驗蛇毒因子是以眼鏡蛇毒中提取的一種分子量為144000蛋白質(zhì)，能直接激活血清中的補體C3，通過旁路途徑激活補體系統(tǒng)，進攻PNH紅細胞，造成溶血。本試驗為特異性PNH試驗。CD55和CD59陰性的紅細胞和中性粒細胞檢測31溶血性貧血的實驗診斷步驟確定是否為溶血病史貧血？黃疸？網(wǎng)織紅細胞計數(shù)？查找溶血原因年齡、種族、職業(yè)、飲食、藥物史、家族遺傳史等32第四節(jié) 血型鑒定與交叉配血試驗33血型（blood group）是人體血液的一種遺傳性狀，各種血液成分包括紅細胞、白細胞、血小板及某些血漿蛋白在個體之間均具有抗原成分的差異，受獨立的遺傳基因控制。由

18、若干個相互關聯(lián)的抗原抗體組成的血型體系，稱為血型系統(tǒng)。血型血清學的研究尤其在輸血、器官移植、骨髓移植等臨床實踐中發(fā)揮著重要作用。34一、紅細胞血型系統(tǒng)已經(jīng)發(fā)現(xiàn)并為國際輸血協(xié)會承認的血型系統(tǒng)有30種，包括超過400種抗原，其中大部分都非常罕見，最重要的兩種為“ABO血型系統(tǒng)”和“Rh血型系統(tǒng)”。血型系統(tǒng)對輸血具有重要意義，以不相容的血型輸血可能導致溶血反應的發(fā)生，造成溶血性貧血、腎衰竭、休克以至死亡。35血型分類的依據(jù)是紅細胞表面是否存在某些可遺傳的抗原物質(zhì)。紅細胞凝集Agglutination：血型不相容的血液混合后，其中的紅細胞聚集成簇并溶血。3637造成凝集的機制是抗原-抗體反應紅細胞表面

19、上含有的特異性糖蛋白抗原物質(zhì)統(tǒng)稱為 凝集原Agglutinogen。在血漿中則含有與之相應的特異性抗 體，稱為凝集素Agglutinin。38（一）ABO血型系統(tǒng)1901年Landsteiner首先發(fā)現(xiàn)1、血型系統(tǒng)的抗原和抗體：根據(jù)紅細胞表面是否具有A或B抗原，血清中是否存在抗A或B抗體，將ABO血型系統(tǒng)分為四型血型紅細胞表面抗原血清中的抗體（凝集原）（凝集素）AA抗BBB抗AABA+B無O無抗A+抗B3940（一）ABO血型系統(tǒng)2、ABO血型的亞型ABO血型系統(tǒng)中重要的亞型是A亞型A亞型：主要有A1和A2。A1亞型的紅細胞上具有A1和A2抗原，其血清中含有抗B抗體。A2亞型的紅細胞上只有A抗

20、原，其血清中除含有抗B抗體外，可有少量的抗A1抗體。B亞型：不多見，抗原性很弱，臨床意義不大。41（一）ABO血型系統(tǒng)3、ABO血型鑒定和交叉配血試驗（1）ABO血型鑒定ABO血型抗體能在生理鹽水中與相應紅細胞抗原結(jié)合而發(fā)生凝集反應。采用標準的抗A及抗B血清以鑒定被檢者紅細胞上的抗原（Beth-Vincent 直接試驗），同時用標準的A型及B紅細胞鑒定被檢者血清中的抗體（Simonin 反轉(zhuǎn)試驗）。只有被檢者紅細胞上的抗原鑒定和血清中的抗體鑒定所得結(jié)果完全相符時才能肯定其血型類別。42用標準血清及標準紅細胞鑒定ABO血型結(jié)果標準血清+被檢者紅細胞標準紅細胞+被檢者血清被鑒定血的血型抗A血清抗B

21、血清抗AB血清A型紅細胞B型紅細胞O型紅細胞(O型血清）A型B型AB型O型43（一）ABO血型系統(tǒng)（2）交叉配血試驗采用試管法。主試驗：受血者血清供血者紅細胞懸液副試驗：供血者血清受血者紅細胞懸液結(jié)果判斷：同型血之間作交叉配血時，主側(cè)管均無凝集反應，表示配血完全相合。44（一）ABO血型系統(tǒng)4、ABO血型系統(tǒng)的臨床意義溶血性輸血反應誤輸ABO血型不合的血:嚴重的溶血反應，危及生命。O型血作為“萬能血”輸入：緊急情況下才考慮。AB型病人輸入非同型血：也可引起溶血反應。A1B型：抗O抗體A2B型：抗A1抗體新生兒溶血癥: 母子血型不符。O型母親發(fā)病率高，可能與其在受到A或B型抗原物質(zhì)免疫后產(chǎn)生的免

22、疫性抗體效價較高有關。ABO血型與器官移植 血型不符易失敗 腎46%其他：用于親緣鑒定，某些疾病相關性的調(diào)查等。45附：血型的遺傳規(guī)律46（一）ABO血型系統(tǒng)（二）Rh血型系統(tǒng)Rh血型系統(tǒng)是將恒河猴(Rhesus monkey)的紅細胞免疫豚鼠和家兔,所得到抗血清能與人的紅細胞發(fā)生凝集反應,證明人與恒河猴紅細胞具有同一抗原,取Rhesus頭兩字母稱Rh血型系統(tǒng)。漢人約99%、白人約85Rh陽性。臨床意義：溶血性輸血反應 Rh- 受血者 + Rh+ 供血者,第二次受血溶血新生兒溶血癥 母Rh- + 子Rh+, 溶血47Rh血型的臨床意義新生兒溶血48分娩后72h內(nèi)進行Rh抗體被動免疫胎兒紅細胞進入母體即被破壞 （不能誘導母親抗Rh免疫反應）Rh+Rh初孕 健康新生兒 健康新生兒Rh再孕Rh+新生兒溶血的預防49二、其他血型系統(tǒng)1白細胞抗原系統(tǒng)： WBC自身特有的抗原、HLA抗原HLA抗原：人類白細胞抗原 組織相容性抗原 臨床應用：1）器官移植前的HLA檢測：提高成功率。 2）親子鑒定：父母各一個單倍體 型構(gòu)成子代基因型。2血小板抗原及抗體： （1）血小板抗原 （2）血小板抗體 原發(fā)：ITP 繼發(fā)：輸血、輸BPC、妊娠時。3血清