促黑曲霉產(chǎn)糠醛和五-羥甲基糠醛的誘導子篩選及優(yōu)化

1、PAGE PAGE - 15 -促黑曲霉產(chǎn)糠醛和五-羥甲基糠醛的誘導子篩選及優(yōu)化摘要：本試驗利用10種生物誘導子和6種非生物誘導子提高黑曲霉（Aspergillusniger）xj發(fā)酵液中糠醛和5-羥甲基糠醛（5-HMF）的產(chǎn)量。先采用單因素試驗篩選誘導子及誘導條件，再設計Box-Behnken試驗并結合響應面法優(yōu)化得到最佳的誘導條件。結果表明：將黑曲霉xj的種子液與誘導子一同接入發(fā)酵培養(yǎng)基，加入0.675%還原糖濃度為10g/mL的金葡萄球菌代謝產(chǎn)物誘導子，誘導8.6h，此時發(fā)酵液中糠醛的產(chǎn)量為50.49g/mL，相較優(yōu)化之前糠醛的含量提高了37%;而在此條件下發(fā)酵液中5-HMF的產(chǎn)量為41

2、.12g/mL，提高了31%。該試驗結果可為后續(xù)黑曲霉發(fā)酵產(chǎn)糠醛和5-HMF提供參考。關鍵詞：糠醛;5-羥甲基糠醛;黑曲霉;誘導子;響應面優(yōu)化中圖分類號：Q939文獻標識碼：A文章編號：1008-0457（2022）03-0034-08國際DOI編碼：10.15958/ki.sdnyswxb.2022.03.005糠醛（Furfural）是一種重要的生物質(zhì)平臺化合物，其分子結構中含有呋喃環(huán)和醛基，化學性質(zhì)活潑，可作為多種化學產(chǎn)品的起始原料，廣泛應用于醫(yī)學、食品、化工、能源等領域1-3。張素等4、趙妗頤等5試驗發(fā)現(xiàn)黑曲霉xj菌株粗提物中對齊整小核菌和鏈格孢菌具有拮抗作用的物質(zhì)可能是糠醛，說明糠醛

3、可能具有抑菌作用。目前生產(chǎn)糠醛主要是酸水解法，戊糖經(jīng)酸催化環(huán)化脫水形成，而大多含有戊糖的物質(zhì)都可作為原材料生產(chǎn)糠醛6。五-羥甲基糠醛（5-Hydorxymethylfurfural，簡寫為5-HMF），因其具有呋喃環(huán)、醛基及羥基，所以穩(wěn)定性差、性質(zhì)活潑，是一種重要的平臺化學物?？赏ㄟ^縮合反應、氧化反應、氫化反應和縮醛等反應，合成多種具有高附加價值的衍生物如2，5-二呋喃甲醛（DFF）、五-?；匪幔℉MFCA）等。5-HMF的眾多衍生物可作為有機導體、生物燃料，在醫(yī)藥方面具有抗癌細胞增值活性，降血糖等藥理作用7-10。馬明超等11展示了許多制備5-HMF的方法，其中葡萄糖轉化制備5-HMF的方

4、法達到72%的產(chǎn)率。雖然目前生產(chǎn)糠醛和5-HMF的方法眾多，但仍存在產(chǎn)率較低、生產(chǎn)資源浪費等情況。黑曲霉（Aspergillusniger）屬于半知菌亞門、絲孢綱、絲孢目、叢梗孢科，是絲狀真菌中一個常見真菌12-13。具有生長旺盛、發(fā)酵周期短、不產(chǎn)生毒素等特點，屬于GRAS菌種，是應用于食品工業(yè)上發(fā)酵和生產(chǎn)酶制劑的主要菌種14。黑曲霉的基因組中發(fā)現(xiàn)了大量與次級代謝有關的基因簇，可以產(chǎn)生多種次級代謝產(chǎn)物15，關麗萍等16在海洋真菌Aspergillusniger2HL-M-8的發(fā)酵液中發(fā)現(xiàn)11個黑曲霉的次級代謝產(chǎn)物。因其具有高產(chǎn)、高分泌、高安全性等優(yōu)點而被廣泛地應用于發(fā)酵工業(yè)中，其中黑曲霉已被用

5、于規(guī)模化大量發(fā)酵生產(chǎn)檸檬酸。目前提高次級代謝產(chǎn)量的方法主要有菌株選育、發(fā)酵優(yōu)化、微生物共培養(yǎng)17-19。誘變選育菌株17包含化學誘變、物理誘變以及復合誘變。在誘變選育中常使用2種以上的誘變方法復合誘變提高誘變效應;發(fā)酵優(yōu)化18為發(fā)酵培養(yǎng)基成分的優(yōu)化和培養(yǎng)條件的優(yōu)化;而微生物共培養(yǎng)發(fā)酵19可以使活性粗提取物增加、促進次級代謝產(chǎn)量的提高以及誘導新的次級代謝物的合成，還可誘發(fā)原次級代謝物的類似物的共同途徑。除以上三種提高次級代謝產(chǎn)物的方法外，目前誘導子也廣泛應用于提高次級代謝產(chǎn)量。誘導子（Elicitor）最初定義為可誘導植物細胞產(chǎn)生和積累植保素的化學物質(zhì)20，但隨著誘導子的應用領域擴大，發(fā)現(xiàn)誘導子

6、是一類可以特異激活植物或微生物產(chǎn)生次生代謝產(chǎn)物的活性物質(zhì)21-22。目前誘導子已廣泛應用于提高植物中次級代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量且誘導機制較成熟透徹23-25。而誘導子在微生物方面的應用主要是關于促進納他霉素的產(chǎn)量，試驗發(fā)現(xiàn)產(chǎn)黃青霉代謝產(chǎn)物誘導子和黑曲霉代謝產(chǎn)物誘導子對產(chǎn)納他霉具有較好的促進作用26-27。目前將誘導子用于提高黑曲霉次級代謝產(chǎn)量的研究很少見，本試驗主要利用誘導子來提高黑曲霉產(chǎn)生次生代謝產(chǎn)物糠醛和5-HMF的產(chǎn)量，以便為后續(xù)的黑曲霉發(fā)酵產(chǎn)糠醛和5-HMF提供參考。1材料與方法1.1材料1.1.1主要試驗菌種黑曲霉（Aspergillusniger）xj，由貴州大學真菌資源研究所分離5，現(xiàn)于

7、中國典型培養(yǎng)物保藏中心保存（CCTCCNo：M206021）。1.1.2培養(yǎng)基及試劑馬鈴薯液體培養(yǎng)基（PDB）;馬鈴薯固體培養(yǎng)基（PDA）;LB培養(yǎng)基;0.1%吐溫-80溶液。1.2試驗方法1.2.1誘導子的制備1.2.1.1誘導子類型本次試驗以10種生物誘導子（表1）和6種非生物誘導子CuSO4、苯甲酸鈉、氨基寡糖素、抗壞血酸、苯丙氨酸、色氨酸為篩選目標。1.2.1.2非生物誘導子的制備參考聶麗28的試驗方法，將上述非生物誘導子配成濃度為10g/mL的溶液，經(jīng)0.45m濾膜后得到的溶液即為非生物誘導子。1.2.1.3生物誘導子的制備采用凍融研磨法制備生物誘導子。除微生物的培養(yǎng)方式不同外，其余

8、步驟與聶麗28相同，改動如下。真菌誘導子：用打孔器分別將鏈格孢菌（Alternariaalternata）、煙草疫霉（Phytophthoranictotianae）、齊整小核菌（Sclerotiumrolfsis）制成菌餅后，分別接種到PDB培養(yǎng)基（100mL/250mL）中，于28，180r/min培養(yǎng)7d，其中齊整小核菌28靜止培養(yǎng)7d，過濾收集菌體。將收集的菌體參照聶麗28的凍融研磨法制備誘導子，后置于4冰箱中備用。細菌誘導子：分別將青枯雷爾氏菌（Ralstoniasolanacearum）、根癌農(nóng)桿菌（Agrobacteriumtumefaciens）、巨大芽孢桿菌（Bacillus

9、megaterium）、胡蘿卜軟腐歐文氏菌（Erwiniacarotovora）接種到LB培養(yǎng)基（100mL/250mL）中30，150r/min培養(yǎng)2d;大腸桿菌（Escherichiacoli）、枯草芽孢桿菌（Bacillussubtilis）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）接種到LB培養(yǎng)基中，于37，180r/min培養(yǎng)2d，10000r/min離心10min收集菌體。收集到的菌體同真菌誘導子制備方法一致。1.2.1.4生物誘導子還原糖含量的測定以還原糖含量作為生物誘導子質(zhì)量濃度的指標，采用3，5一二硝基水楊酸（DNS）比色法測定其還原糖含量。參照趙凱等29試

10、驗利用DNS比色法測定還原糖濃度，選取DNS試劑2在波長為550nm處測定。1.2.2黑曲霉種子液的生長曲線將活化的黑曲霉接種于PDA培養(yǎng)基中，于26、150r/min恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5d，用適量的0.1%吐溫-80無菌溶液洗下孢子。參照袁洪威等30的試驗方法用分光光度計測定黑曲霉孢子懸浮液濃度。制備濃度為107CFU/mL孢子懸浮液，以6%的接種量加入種子培養(yǎng)基（50mL/250mL）中。培養(yǎng)8d，每24h取樣測定菌體干重。1.2.3發(fā)酵液中糠醛和5-HMF含量的測定1.2.3.1建立糠醛和5-HMF標準曲線模型試驗方法參照彭秋菊等31和張素等32用HPLC法測定黑曲霉發(fā)酵液中五-羥甲基糠醛

11、和糠醛的含量，建立糠醛和5-HMF的標準曲線。1.2.3.2發(fā)酵液中糠醛和5-HMF含量的測定參照彭秋菊等31和張素等32用HPLC法測定黑曲霉發(fā)酵液中糠醛和5-HMF的含量。稍有改動，改動如下：將斜面培養(yǎng)基中的黑曲霉活化，制成107CFU/mL孢子懸浮液，將孢子懸液以8%12%（V/V）接種于發(fā)酵瓶中培養(yǎng)7d。發(fā)酵液處理方法以及色譜條件與彭秋菊等31試驗一致。1.2.4誘導子篩選及優(yōu)化主要以發(fā)酵液中糠醛含量為評價指標，將處于對數(shù)生長末期的種子液按6%的接種量加入發(fā)酵培養(yǎng)基（50mL/250mL）中，在此基礎上進行單因素試驗設計。1.2.4.1誘導子種類及最佳添加時間的篩選將濃度為10g/mL

12、的氨基寡糖素、抗壞血酸、苯丙氨酸、色氨酸和濃度為10mol/mL的CuSO4和苯甲酸鈉，還原糖濃度為10g/mL的生物誘導子以1%的添加量，在誘導時間為72h的條件下，添加時間設為0d、3d、5d，測糠醛和5-HMF的含量。以糠醛含量為指標，篩選最佳誘導子及最佳添加時間。以不添加誘導子為空白對照。1.2.4.2誘導子添加量的篩選在誘導子為10g/mLSAE，添加時間為0d，誘導時間為72h的條件下，添加量設為1%、2%、4%、6%、8%、10%，測糠醛和5-HMF含量。1.2.4.3誘導子誘導時間的篩選在添加量為1%的10g/mLSAE，添加時間為0d的條件下，誘導時間設為12h、24h、36

13、h、48h、60h、72h，測糠醛和5-HMF含量（誘導時間從誘導子加入后開始計算，而發(fā)酵時間針對空白對照，包含添加時間）。1.2.5響應面優(yōu)化發(fā)酵條件根據(jù)單因素試驗結果，選取最佳條件作為0因素水平，設計三因素三水平的Box-Behnken試驗（表2）。利用Design-Expert軟件設計Box-Behnken試驗方案，以黑曲霉發(fā)酵液中的糠醛產(chǎn)量為響應指標進行響應面分析，預測誘導子在黑曲霉發(fā)酵體系中的最佳誘導條件。（因為最佳添加時間為0d，左邊已是極值，故選用1d為0水平）2結果與分析2.1還原糖的標準曲線利用DNS法測定還原糖濃度（即生物誘導子質(zhì)量濃度）。以葡萄糖含量（mg）為橫坐標，OD

14、值為縱坐標繪制葡萄糖標準曲線，其線性回歸方程為y=0.4957x-0.0088（R2=0.998），葡萄糖含量在01.2mg之間，具有良好線性關系。2.2黑曲霉在種子培養(yǎng)基中的的生長曲線將濃度為107CFU/mL孢子懸浮液以6%的接種量接入種子培養(yǎng)基，裝液量為50mL/250mL。由圖1可知，經(jīng)過3d培養(yǎng)后菌種生物量最大，即將進入穩(wěn)定期，可將對數(shù)生長期末期（3d）的培養(yǎng)液作為種子液，進行發(fā)酵試驗。2.3糠醛和五羥甲基糠醛的標準曲線利用HPLC法測定糠醛和5-HMF的標準曲線，其中糠醛的標準曲線線性回歸方程為y=57.582x+195.82（R2=0.999）。5-HMF的標準曲線線性回歸方程為

15、y=72.107x-11.357（R2=0.999）。兩個方程在060g/mL濃度范圍具有良好線性關系。2.4誘導子種類及誘導時間篩選分別向已培養(yǎng)0d、3d、5d的發(fā)酵培養(yǎng)液中添加10種生物誘導子及6種非生物誘導子。其中非生物誘導子對于黑曲霉的作用效果不明顯，但生物誘導子有較明顯的作用效果。綜合圖2-4來看，相比于CK培養(yǎng)基液中的糠醛產(chǎn)量，0d添加的ATFE、SAE、AAE、PNE具有促進作用。其中SAE的誘導效果最佳，其余誘導子對糠醛產(chǎn)量均表現(xiàn)為抑制作用，其中PNE對菌體的生長也具有抑制作用;在3d時添加誘導子均表現(xiàn)為促進作用;在5d時添加誘導子較0d糠醛的產(chǎn)量減少?？芍?d添加SAE效果顯

16、著優(yōu)越，糠醛含量達47.44g/mL，較空白對照（CK）提升了19.18g/mL;5-HMF含量達38.59g/mL，較空白對照提高了16.50g/mL。故選擇最佳誘導子為SAE，最佳添加時間為0d。2.5誘導子最佳添加量的篩選在誘導子為10g/mLSAE，添加時間為0d，誘導時間為72h的條件下，添加量按1%、2%、4%、6%、8%、10%與黑曲霉種子液一起加入發(fā)酵液中，測定糠醛和5-HMF的含量。由圖5可知，1%的添加量產(chǎn)生糠醛含量較高，其余濃度對產(chǎn)糠醛影響不大，故選取1%為最佳添加量。2.6誘導子最佳誘導時間的篩選在添加量為1%的10g/mLSAE，添加時間為0d的條件下，誘導培養(yǎng)12h

17、、24h、36h、48h、60h、72h（從加入誘導子時間開始計算）。由圖6可知，誘導子時間為12h對促進黑曲霉產(chǎn)生糠醛含量最大達到53.22g/mL;5-HMF含量達42.46g/mL。故最佳誘導時間為12h。2.7響應面法優(yōu)化誘導條件2.7.1響應面的模型建立與統(tǒng)計分析確定單因素的最佳值后，進行Box-Behnken試驗，以發(fā)酵液中的糠醛（Y）的產(chǎn)量為響應值，誘導子的添加時間（A）、添加量（B）以及誘導時間（C）為變量，進行響應面優(yōu)化試驗，結果如表3所示。根據(jù)表3的試驗結果，利用DesignExpert8對數(shù)據(jù)進行回歸分析，得到糠醛的回歸方程：Y1=42.71-13.2A-0.15B-1.

18、09C+0.47AB+1.01AC+0.59BC-5.66A2-1.02B2-7.73C2。由表4可知，添加時間（A）的一次項和誘導時間的二次項（C2）對發(fā)酵液中糠醛的產(chǎn)量影響具有極顯著性（P0.05）。根據(jù)=0.05的顯著水平除去不顯著因素后，將回歸方程簡化為Y1=42.71-13.2A-5.66A2-7.73C2。該回歸方程的變量與因變量之間的線性關系顯著（R2=0.9467），模型調(diào)整復相關系數(shù)為R2Adj=0.8782，說明該模型可以解釋87.82%響應值的變化，擬合程度較好33。2.7.2響應面分析及優(yōu)化利用DesignExpert根據(jù)回歸方程進行響應面分析，尋找糠醛產(chǎn)量最大的誘導條

19、件。響應面的陡峭程度可以表明變量對因變量的影響程度，響應面越陡峭說明相關因素影響效果越明顯。由圖7可知，三個因素對黑曲霉產(chǎn)糠醛的影響表現(xiàn)為：添加時間（A）誘導時間（C）添加量（B）。對模型進行分析，得到最優(yōu)的培養(yǎng)條件：添加時間為0d、添加量為0.675%、誘導時間為8.6h，此條件下的糠醛含量理論值為50.52g/mL。根據(jù)給出的最佳培養(yǎng)條件設計試驗進行驗證（設置三組平行試驗）得出發(fā)酵液中糠醛的實際含量分別為50.51、50.47、50.48g/mL，與預測值較為接近，說明此模型可以較好地預測誘導條件下的糠醛產(chǎn)量。而在糠醛的最佳誘導條件下發(fā)酵液中5-HMF的實際產(chǎn)量也達到了41.12g/mL。

20、3結論與討論用誘導子提高微生物次級代謝的產(chǎn)量，不僅與黑曲霉自身的發(fā)酵特性有關，還跟誘導子的種類、誘導子的含量、添加時間和誘導時間有密切的關系。聶麗28，34等試驗表明細菌誘導子內(nèi)的活性成分主要是多糖類物質(zhì)和蛋白質(zhì)，并且在誘導鏈霉菌合成農(nóng)抗702時也是細菌誘導子具有較好的誘導效果。結果顯示，對黑曲霉發(fā)酵作用最好的誘導子為金葡萄球菌代謝產(chǎn)物，是一種細菌代謝產(chǎn)物誘導子，說明細菌代謝產(chǎn)物誘導子對微生物產(chǎn)次生代謝產(chǎn)物具有一定的作用效果，但對于SAE內(nèi)的具體有效物質(zhì)還是未知的。在確定最佳誘導子后，觀察誘導子的含量、添加時間和誘導時間對其誘導效果的影響。本試驗在添加濃度為1%時產(chǎn)糠醛量最大，但隨著誘導子的含

21、量增加，出現(xiàn)產(chǎn)糠醛含量較高的添加量。有人將誘導子含量與次生代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量的關系概括為飽和型和最適型35，最適型可以解釋本試驗的情況。本試驗的最佳添加時間是將種子液與金葡萄球菌代謝產(chǎn)物誘導子一同接入發(fā)酵培養(yǎng)基，即為0d，表明在對數(shù)生長期末期時加入誘導子，次生代謝產(chǎn)物產(chǎn)量較多。在邊猛36試驗中利用Bacillussp.代謝產(chǎn)物誘導子作用于海洋真菌，結果表明將真菌培養(yǎng)至對數(shù)生長期末期加入誘導子，產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物含量最高，這與本試驗的結果一致。關于誘導子最佳添加時間出現(xiàn)的情況，可能是由于在真菌培養(yǎng)早期合成糠醛和5-HMF的關鍵酶前體物質(zhì)不足，導致早期加入誘導子無法激活關鍵酶的活性，而在對數(shù)生長期末期

22、關鍵酶前體物質(zhì)充足，受到誘導子的刺激導致關鍵酶活性增強，次生代謝產(chǎn)物含量增多。對于不同的誘導時間，在1248h內(nèi)誘導子具有明顯的促進效應，說明在發(fā)酵初期誘導子的作用效果較明顯。但是隨著誘導子的誘導時間推移，糠醛產(chǎn)量降低，誘導子的作用效果不顯著。而在64h后出現(xiàn)空白對照的含量高于樣品組，可能是由于前期發(fā)酵大量消耗了培養(yǎng)基中的成分，導致添加誘導子的樣品后期次生代謝產(chǎn)物較空白組少。響應面優(yōu)化法優(yōu)化發(fā)酵條件具有優(yōu)化速度快，預測結果偏差小等優(yōu)點37。目前，已有報道將響應面優(yōu)化法應用于發(fā)酵條件的優(yōu)化以及誘導子篩選等方面。如彭秋菊等31用響應面優(yōu)化黑曲霉產(chǎn)糠醛的培養(yǎng)基條件較優(yōu)化前糠醛產(chǎn)量提高了20.2%;魏

23、寶東等33利用響應面法優(yōu)化促進納他霉素合成的誘導子誘導條件，經(jīng)優(yōu)化后納他霉素產(chǎn)量提高了1.68倍。以上試驗說明響應面優(yōu)化法對于發(fā)酵具有較好的優(yōu)化效果。本試驗利用經(jīng)單因素試驗確定了誘導子的種類、誘導子添加時間、誘導量及誘導時間的范圍后，利用Box-Behnken試驗并結合響應面優(yōu)化篩選出黑曲霉產(chǎn)糠醛最佳條件為：糠醛的添加時間為0d、添加量0.675%，誘導時間8.6h。在此條件下培養(yǎng)黑曲霉發(fā)酵液中糠醛含量為50.49g/mL，較空白對照（36.84g/mL）提高了37%;5-HMF的含量為41.12g/mL，較空白對照（32.08g/mL）提高了31%。參考文獻：1余先純，李湘蘇，龔錚午.黑曲霉

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29、藥用植物中的應用J.中草藥，2022，43（8）：1647-1651.24趙鴻蓮，于榮敏.誘導子在植物細胞培養(yǎng)中的應用研究進展J.沈陽藥科大學學報，2000（2）：77-81.25何夢玲，李磊，梁威，等.茉莉酸甲酯和水楊酸對廣藿香懸浮細胞中百秋李醇積累的影響J.時珍國醫(yī)國藥，2022，29（11）：2597-2600.26史強，陶文沂.真菌代謝產(chǎn)物中促進納他霉素合成的誘導子的研究J.食品與發(fā)酵工業(yè)，2022，36（10）：15-18.27王亞洲，古紹彬，劉勝男，等.真菌誘導子對納他霉素生物合成的影響J.中國食品添加劑，2022（2）：63-68.28聶麗.誘導子對鏈霉菌702合成農(nóng)抗702的影

30、響D.南昌：江西農(nóng)業(yè)大學，2022.29趙凱，許鵬舉，谷廣燁.3，5-二硝基水楊酸比色法測定還原糖含量的研究J.食品科學，2022（8）：534-536.30袁洪威，陳湖芳，高東民，等.分光光度法測定黑曲霉孢子濃度的研究J.中國釀造，2022，36（4）：122-126.31彭秋菊，趙姍，孫冉，等.黑曲霉產(chǎn)糠醛的培養(yǎng)條件優(yōu)化J.生物學雜志，2022，39（2）：74-79.32張素，吉玉玉，肖洋，等.HPLC法檢測黑曲霉發(fā)酵液中5-羥甲基糠醛的研究J.中國釀造，2022，37（3）：154-156.33魏寶東，潘婭慧，王亞男，等.促進納他霉素合成的真菌誘導子篩選及誘導條件優(yōu)化J.食品科學，20

31、22，34（7）：196-200.34聶麗，游思遠，樊聰靜，等.高效誘導子的制備方法及誘導成分研究J.江蘇農(nóng)業(yè)科學，2022，46（4）：90-93.35趙俊云.棉花植保素與桔梗皂甙的誘導生成研究D.武漢：華中師范大學，2022.36邊猛.海洋真菌產(chǎn)生物堿代謝調(diào)節(jié)的研究D.青島：青島科技大學，2022.37李歡歡.優(yōu)化試驗設計方法的比較研究J.內(nèi)蒙古科技與經(jīng)濟，2022（4）：63-65.ScreeningandOptimizationofElicitorsforFurfuraland5-HydroxymethylFurfuralProductionbyAspergillusnigerDingXuan，LiuJianrui，YangQingqing，