基因工程第三組核算的提取

1、基因工程第三組核算的提取第1頁，共54頁，2022年，5月20日，12點6分，星期二提綱前言DNA提取DNA提取的原則DNA提取的方法RNA提取RNA提取相關(guān)知識RNA提取方法及注意事項DNA 和RNA提取常見問題分析核酸提取方法在不同材料中的改進第2頁，共54頁，2022年，5月20日，12點6分，星期二前言核酸包括DNA、RNA兩種分子，在細胞中都以與蛋白質(zhì)結(jié)合的狀態(tài)存在。真核生物的染色體DNA為雙鏈線性分子，原核生物的染色體DNA、質(zhì)粒及真核細胞器DNA為雙鏈環(huán)狀分子；有些噬菌體DNA為單鏈環(huán)狀分子；大多數(shù)生物體內(nèi)RNA分子均為單鏈線性分子并具有不同的結(jié)構(gòu)特點，如真核生物mRNA分子多數(shù)

2、在3端帶有polyA結(jié)構(gòu)。第3頁，共54頁，2022年，5月20日，12點6分，星期二DNA提取DNA提取的原則保證DNA一級結(jié)構(gòu)的完整性 完整的一級結(jié)構(gòu)是保證核酸結(jié)構(gòu)與功能研究的最基本要求 排除其它分子的污染 RNA、蛋白質(zhì)、多糖等第4頁，共54頁，2022年，5月20日，12點6分，星期二DNA純化要求核酸樣品中不存在對酶有抑制作用的有機溶劑和過高濃度的金屬離子；其它生物大分子如蛋白質(zhì)、多糖和脂類分子的污染應(yīng)降到最低程度； 排除其它核酸分子的污染，如提取DNA分子時應(yīng)去除RNA，反之亦然.第5頁，共54頁，2022年，5月20日，12點6分，星期二DNA提取的方法基因組DNA的提取CTAB

3、法SDS法質(zhì)粒DNA的提取堿裂解法煮沸法線粒體、葉綠體DNA的提取差速離心結(jié)合SDS裂解法第6頁，共54頁，2022年，5月20日，12點6分，星期二基因組DNA提取主要方法CTAB法 適用于植物組織，真菌等SDS法 適用于動物組織，血液，細胞，細菌，酵母等第7頁，共54頁，2022年，5月20日，12點6分，星期二CTAB法(植物DNA提取經(jīng)典法)原理CTAB（hexadecyltrimethylammoniumbromide，十六烷基三甲基溴化銨），是一種陽離子去污劑，可溶解細胞膜，并與核酸形成復(fù)合物。該復(fù)合物在高鹽溶液中（0.7mol/L NaCl）是可溶 的，通過有機溶劑抽提，去除蛋白

4、、多糖、酚類等 雜質(zhì)后加入乙醇沉淀即可使核酸分離出來。注：CTAB溶液在低于15 時會形成沉淀析出，因此在將其加入冰冷的植物材料之前必須預(yù)熱，且離心時溫度不要低于15。第8頁，共54頁，2022年，5月20日，12點6分，星期二基因組DNA CTAB法TrisHC（pH8.0）提供一個緩沖環(huán)境，防止核酸被破壞；EDTA螯合Mg 2+ 或Mn 2+ 離子抑制DNase活性；NaCl 提供一個高鹽環(huán)境使DNP充分溶解，存在于液相中；CTAB溶解細胞膜，并結(jié)合核酸，使核酸便于分離；巰基乙醇是抗氧化劑，有效地防止酚氧化成醌，避免褐變，使酚容易去除組份TrisHCl（pH8.0）EDTA（pH8.0）N

5、aClCTAB巰基乙醇終濃度100 mM20 mM1.4M2%(W/V)0.1%（V/V）使用前加入CTAB提取緩沖液的經(jīng)典配方第9頁，共54頁，2022年，5月20日，12點6分，星期二基因組DNA CTAB法CTAB提取緩沖液的改進配方組份TrisHCl（pH8.0）EDTA（pH8.0）NaClCTABPVP40巰基乙醇終濃度100 mM20 mM1.4M2%(W/V)5%(W/V)0.1%（V/V）使用前加入PVP（聚乙烯吡咯烷酮）是酚的絡(luò)合物，能與多酚形成種不溶的絡(luò)合物質(zhì)，有效去除多酚，減少DNA中酚的污染；同時它也能和多糖結(jié)合，有效去除多糖。第10頁，共54頁，2022年，5月20

6、日，12點6分，星期二CTAB法流程圖植物材料液氮研磨細胞裂解裂解液抽提上層溶液酒精沉淀離心洗滌干燥溶解DNA溶 液第11頁，共54頁，2022年，5月20日，12點6分，星期二SDS法原理 SDS 陰離子去垢劑核酸本身帶負電荷，結(jié)合帶正電荷的蛋白質(zhì)。用于核酸提取的去垢劑，一般都是陰離子去垢劑。 溶解膜蛋白及脂肪，使細胞膜破裂；溶解核糖體上面的蛋白質(zhì)，使其解聚，將核酸釋放出來；對DNase、RNase有一定的抑制作用。高鹽(KAc或NH4Ac) 或降低溫度（冰?。┦沟鞍踪|(zhì)及多糖雜質(zhì)沉淀上清液中的DNA用酚/氯仿抽提乙醇沉淀水相中的DNA第12頁，共54頁，2022年，5月20日，12點6分，星

7、期二SDS提取緩沖液的配方組份TrisHCl（pH8.0）EDTA（pH8.0）NaClSDS終濃度100 mM20 mM1.4M2%(W/V)TrisHCl（pH8.0）提供一個緩沖環(huán)境，防止核酸被破壞； EDTA螯合Mg 2+ 或Mn 2+ 離子，抑制DNase活性；NaCl 提供一個高鹽環(huán)境，使DNP充分溶解，存在于液相中；SDS 裂解細胞，使蛋白變性，染色體離析；第13頁，共54頁，2022年，5月20日，12點6分，星期二SDS法流程圖動物組織細胞組織勻漿細胞裂解裂解液抽提上層溶液酒精沉淀離心洗滌干燥溶解DNA溶 液第14頁，共54頁，2022年，5月20日，12點6分，星期二基因組

8、DNA其它裂解方法根據(jù)細胞裂解方式的不同有：物理方式：玻璃珠、超聲波、研磨、凍融化學方式：異硫氰酸胍、堿裂解生物方式：酶法第15頁，共54頁，2022年，5月20日，12點6分，星期二基因組DNA純化的方法吸附材料結(jié)合法：吸附材料純化原理硅質(zhì)材料高鹽低pH值結(jié)合核酸低鹽高pH值洗脫陰離子交換樹脂低鹽高pH值結(jié)合核酸高鹽低pH值洗脫磁珠磁性微粒掛上不同基團可吸附不同的目的物，從而達到分離目的第16頁，共54頁，2022年，5月20日，12點6分，星期二質(zhì)粒DNA提取堿裂解法 煮沸法第17頁，共54頁，2022年，5月20日，12點6分，星期二堿裂解法原理染色體DNA比質(zhì)粒DNA分子大得多，且染色

9、體DNA為線狀分子，而質(zhì)粒DNA為共價閉合環(huán)狀分子當用堿處理DNA溶液時，線狀染色體DNA容易發(fā)生變性，共價閉環(huán)的質(zhì)粒DNA在回到中性pH時即恢復(fù)其天然構(gòu)象；變性染色體DNA片段與變性蛋白質(zhì)和細胞碎片結(jié)合形成沉淀，而復(fù)性的超螺旋質(zhì)粒DNA分子則以溶解狀態(tài)存在液相中，從而可通過離心將兩者分開。第18頁，共54頁，2022年，5月20日，12點6分，星期二堿裂解法流程圖對數(shù)期菌體溶液I充分重懸溶液II裂解上清液抽提上層溶液酒精沉淀離心洗滌干燥溶解DNA溶 液溶液III中和第19頁，共54頁，2022年，5月20日，12點6分，星期二細胞器D NA提 取線粒體葉綠體差速離心法原理是利用物質(zhì)比重的不同

10、分離混合物的一種方法。將待分離物質(zhì)置于均勻介質(zhì)（蔗糖）中，以一定的轉(zhuǎn)速進行離心，比重大的物質(zhì)優(yōu)先沉降，比重小的卻處于上層，從而得以分離。第20頁，共54頁，2022年，5月20日，12點6分，星期二DNA提取基本步驟 基因組DNA 新鮮材料，低溫保存 血液基因組DNA提 取選擇有核細胞 細胞培養(yǎng)時間不能過長 含病毒的液體材料提取前先富集 質(zhì)粒DNA 對數(shù)期的菌體 培養(yǎng)時應(yīng)加入篩選壓力 低拷貝或大質(zhì)粒，應(yīng)加大菌體用量 菌株不要頻繁轉(zhuǎn)接（質(zhì)粒丟失）材料準備細胞裂解核酸分離純化核酸溶解保存核酸沉淀第21頁，共54頁，2022年，5月20日，12點6分，星期二基因組DNA 材料過多影響裂解，導(dǎo)致DNA

11、量 少，純度低 針對不同材料，選擇適當?shù)牧呀忸A(yù)處理方式： 植物材料液氮研磨 動物組織勻漿或液氮研磨 組培細胞蛋白酶K 細 菌溶菌酶破壁 酵 母破壁酶或玻璃珠質(zhì)粒DNA 菌體量適當，除凈培養(yǎng)基 變性的時間不要過長（5分鐘） 控制復(fù)性時間，避免基因組D NA的 污染 G菌、酵母細胞酶或機械處理材料準備細胞裂解核酸分離純化核酸溶解保存DNA提取基本步驟核酸沉淀第22頁，共54頁，2022年，5月20日，12點6分，星期二DNA提取基本步驟 采用吸附材料吸附分離DNA， 應(yīng)提供相應(yīng)的緩沖體系 采用有機溶劑（酚/氯 仿）抽提時應(yīng)充分而輕柔的混勻 離心分離兩相時，應(yīng)保證一定的轉(zhuǎn)速和時間 針對不同材料的特點

12、，在提取過程中輔以相應(yīng)的去雜質(zhì)的方法材料準備細胞裂解核酸分離純化核酸溶解保存核酸沉淀第23頁，共54頁，2022年，5月20日，12點6分，星期二DNA提取基本步驟 蛋白質(zhì)的去除： 酚/氯仿抽提 使用變性劑（SDS、 異硫氰酸胍等） 蛋白酶處理材料準備細胞裂解核酸分離純化核酸溶解保存核酸沉淀第24頁，共54頁，2022年，5月20日，12點6分，星期二DNA提取基本步驟 多糖的去除： 多糖水解酶 在提取緩沖液中加1/2體 積氯苯，氯苯可以與多糖的羥基作用，從而去除多糖 。 用PEG8000代 替乙醇沉淀DNA： 在500 LDNA液 中加入200l 20%PEG8000 (含1.2MNaCl)

13、 ，冰浴20min。材料準備細胞裂解核酸分離純化核酸溶解保存核酸沉淀第25頁，共54頁，2022年，5月20日，12點6分，星期二DNA提取基本步驟 多酚的去除： 加入還原劑：巰 基乙醇、抗壞血酸、半胱氨酸、二硫蘇糖醇等 加入易與酚類結(jié)合的試劑：如PVP、PEG， 可防止酚類與DNA的 結(jié)合 鹽離子的去除： 70的乙醇洗滌材料準備細胞裂解核酸分離純化核酸沉淀核酸溶解保存第26頁，共54頁，2022年，5月20日，12點6分，星期二DNA提取基本步驟 預(yù)冷的乙醇或異丙醇更充分沉淀 加入1/10體 積的NaAc（pH5.2，3M）更 充分沉淀 晾干DNA，讓乙醇充分揮發(fā)材料準備細胞裂解核酸分離純化

14、核酸溶解保存若長期儲存建議使用T E緩沖液溶解pH值為8.0，可防止DNA發(fā)生酸解核酸沉淀第27頁，共54頁，2022年，5月20日，12點6分，星期二分離核酸注意事項溫度不要過高，高溫如長時間煮沸，除水沸騰帶來的剪切力外，高溫本身對核酸分子中的有些化學鍵也有破壞作用。 控制PH范圍（PH4到10）保持一定離子強度減少物理因素對核酸的機械剪切力防止核酸的生物降解細胞內(nèi)或外來的各種核酸酶消化核酸鏈中的磷酸二酯鍵，直接破壞核酸的一級結(jié)構(gòu)所用器械和一些試劑需要高溫滅菌，提取緩沖液中需加入核酸酶抑制劑第28頁，共54頁，2022年，5月20日，12點6分，星期二RNA提取及常見問題分析第29頁，共54

15、頁，2022年，5月20日，12點6分，星期二RNA提取及常見問題分析 RNA提取相關(guān)知識 RNA提取方法及注意事項 RNA提取常見問題分析第30頁，共54頁，2022年，5月20日，12點6分，星期二細胞中RNA的含量 107個細胞 10g 30mg動物組織 30100mg植物組織rRNA占80-85%mRNA占15%第31頁，共54頁，2022年，5月20日，12點6分，星期二mRNA的應(yīng)用RTPCR,Northern雜交,cDNA文庫構(gòu)建mRNA末端快速擴增(RACE),差異表達(DDRTPCR),引物延伸反應(yīng),體外轉(zhuǎn)錄RNA標記,RNA酶保護試驗,RNA微注射(RNAMicroinje

16、ction)第32頁，共54頁，2022年，5月20日，12點6分，星期二RNA的不穩(wěn)定性內(nèi)因:核糖殘基的2和3位置帶有羥基,易 被水解外因:內(nèi)源、外源RNA酶含量豐富,加熱后仍 能夠正確折疊恢復(fù)活性,不易失活第33頁，共54頁，2022年，5月20日，12點6分，星期二提取RNA的注意事項經(jīng)常更換新手套。皮膚和實驗室用品上可能有RNase,會導(dǎo)致RNase污染塑料器皿可用0.1%DEPC水浸泡410小時,再滅菌玻璃器皿可在180烘烤4小時塑料制品和槍頭避免交叉污染第34頁，共54頁，2022年，5月20日，12點6分，星期二常用的RNA酶抑制劑焦碳酸二乙酯(DEPC) 與RNA酶的活性基團組

17、氨酸的咪唑環(huán)結(jié)合使蛋白質(zhì)變性,強烈但不徹底的RNA酶抑制劑異硫氰酸胍 目前是最有效的RNA酶抑制劑,裂解組織的同時也使RNA酶失活。第35頁，共54頁，2022年，5月20日，12點6分，星期二常用的RNA酶抑制劑RNasin 從大鼠肝或人胎盤中提取得來的酸性糖蛋白?？梢院投喾NRNA酶結(jié)合,使其失活氧釩核糖核苷復(fù)合物 由氧化釩離子和核苷形成的復(fù)合物,它和RNA酶結(jié)合形成過渡態(tài)類物質(zhì),幾乎能完全抑制RNA酶的活性SDS、尿素、硅藻土等第36頁，共54頁，2022年，5月20日，12點6分，星期二RNA提取流程示意圖 研磨或勻漿動植物材料細胞裂解加入裂解液(TRNzol)氯仿離心水相有機相PH 5

18、.7RNA基因組DNA純化第37頁，共54頁，2022年，5月20日，12點6分，星期二RNA提取流程示意圖等體積異丙醇沉淀 70%乙醇洗滌沉淀 晾干溶解RNA吸附柱 去蛋白液 漂洗 洗脫傳統(tǒng)方法:有機溶劑抽提,得率高柱純化法:純度高,無有機溶劑水相RNA第38頁，共54頁，2022年，5月20日，12點6分，星期二RNA提取基本步驟材料準備TRNzol裂解細胞加入氯仿抽提RNA沉淀柱純化RNA溶解 保存植物組織選取雜質(zhì)少生長較快的幼 嫩部培養(yǎng)細胞除盡培養(yǎng)液消化系統(tǒng)的組織選取雜質(zhì)少的部位細菌和酵母需要破壁處理樣品切成小塊投入液氮或?qū)ｉT的 RNA樣品儲存液中保存液氮研磨時不要使液氮揮發(fā)凈第39頁

19、，共54頁，2022年，5月20日，12點6分，星期二RNA提取基本步驟異硫氰酸胍、酚(TRNzol)裂解細胞滅活RNaseTRNzol要與細胞組織充分接觸裂解盡量充分材料準備TRNzol裂解細胞加入氯仿抽提RNA沉淀柱純化RNA溶解 保存第40頁，共54頁，2022年，5月20日，12點6分，星期二RNA提取基本步驟材料準備TRNzol裂解細胞加入氯仿抽提RNA沉淀柱純化RNA溶解 保存氯仿抽提時充分混勻離心分離兩相,保證一定的轉(zhuǎn)速和時 間,使蛋白質(zhì)、多糖和DNA分布到有 機相和中間層,RNA留在水相中注意避免吸入中間層不慎吸入再次用有機溶劑抽提第41頁，共54頁，2022年，5月20日，1

20、2點6分，星期二RNA提取基本步驟材料準備TRNzol裂解細胞加入氯仿抽提RNA沉淀柱純化RNA溶解 保存異丙醇低溫沉淀RNA高鹽低pH值,核酸與硅膠膜結(jié)合70%乙醇洗滌,晾干用經(jīng)DEPC處理過的水或?qū)ｉT的試 劑來洗脫或溶解RNA-70分裝保存或加入RNase抑 制劑(RNAsafe)第42頁，共54頁，2022年，5月20日，12點6分，星期二DNA 和RNA提取常見問題及注意事項第43頁，共54頁，2022年，5月20日，12點6分，星期二問題一：DNA降解1. 材料不新鮮、反復(fù)凍融或細胞衰老2. 提取操作過于劇烈，DNA被打斷3. 外源核酸酶污染1.低溫保存，避免反復(fù)凍融。2.液氮研磨或

21、勻漿組織，應(yīng)在解凍前加入裂解緩沖液3. 增加裂解液中螯合劑的含量4. 細胞裂解后操作應(yīng)盡量輕柔5. 試劑用無菌水配制，耗材經(jīng)高溫滅菌6. DNA分 裝保存于緩沖液，避免反復(fù)凍融第44頁，共54頁，2022年，5月20日，12點6分，星期二問題二： DNA樣品不純1. DNA中含有蛋白、多糖、多酚類雜質(zhì)2. DNA在溶解前，有酒精殘留，酒精抑制后續(xù)酶解反應(yīng)3. DNA中殘留有金屬離子1. 重新純化DNA，去除蛋白、多糖、多酚等雜質(zhì)（具體方法見前）2. 重新沉淀DNA，讓酒精充分揮發(fā)3. 增加70 乙醇洗滌的次數(shù)（2 -3次）第45頁，共54頁，2022年，5月20日，12點6分，星期二問題三：D

22、NA提 取量少1.實驗材料不佳或量少2.破壁或裂解不充分3.沉淀不完全4. 洗滌時DNA丟 失1. 盡量選用新鮮（幼嫩）的材料2. 動植物要勻漿研磨充分；G菌、酵母裂解前先用生物酶或機械方式破壁3. 高溫裂解時，時間適當延長（對于動物細胞、細菌可增加PK的用量）4. 低溫沉淀，延長沉淀時間5. 加輔助物，促進沉淀6. 洗滌時，最好用槍頭將洗滌液吸出，勿傾倒第46頁，共54頁，2022年，5月20日，12點6分，星期二RNA提取常見問題一：樣品不純1. 蛋白2. 多糖多酚3. DNA4. 離子1. 保證徹底的裂解和一定轉(zhuǎn)數(shù)一定時間的離心2. 增加有機溶劑抽提的次數(shù)，用吸附柱純化3. 減少處理樣品

23、的量4. 加入不含RNase的DNase處理；再次純化第47頁，共54頁，2022年，5月20日，12點6分，星期二RNA提取常見問題二：得率低1.樣品太多或太少2.RNA在柱子上未洗出3.洗出液中有酒精1.減少或增加樣品使用量2.加入RNaseFree,放置幾分鐘再離心3.漂洗后再次離心第48頁，共54頁，2022年，5月20日，12點6分，星期二RNA提取常見問題三：降解1. 樣品不新鮮或保存不當2. RNase污染3. RNA溶液儲存不當1. 取新鮮的樣品；取樣后立即放入液氮或儲存液保存2. 研磨樣品及時補充液氮3. 嚴格處理相應(yīng)的器具和試劑4. 70凍存，分裝使用第49頁，共54頁，2

24、022年，5月20日，12點6分，星期二核酸提取方法在不同材料中的改進第50頁，共54頁，2022年，5月20日，12點6分，星期二核酸提取方法在不同材料中的改進 對于不同的材料相對應(yīng)的改進方法不同 ，我們簡要為大家介紹幾種：可以采用不同氯化鈉濃度比差別法來抽提DNA蛋白,得到一個較為理想的氯化鈉濃度（不同植物所需濃度不同）;用SDS處理材料后再用氯仿-異戊醇抽提除去蛋白質(zhì)，并且用十二烷基硫酸鈉代替十二烷基磺酸鈉配制SDS能夠更方便、易配；加入乙醇脫水析出DNA時，則通過用旋轉(zhuǎn)法作順時針搖動析出DNA代替用滴泵反復(fù)吸乙醇析出的DNA,使脫水析出的絲狀DNA能順著勢能相互纏繞成團析出,確保絲狀DNA分子不被人為斷裂。 第51