293T熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)

1、293T熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)在研究轉(zhuǎn)錄因子和啟動(dòng)子的實(shí)驗(yàn)中，你是否想確定結(jié)合位點(diǎn)的序列？這些問(wèn)題都可以用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)來(lái)嘗試解決。雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)介紹 基于熒光素酶(luciferase )的發(fā)光原理，科學(xué)家發(fā)明了雙熒光素酶報(bào)告基因檢 測(cè)系統(tǒng)。該系統(tǒng)包括螢火蟲(chóng)熒光素酶(Firefly luciferase )和海腎熒光素酶(Renilla luciferase )。兩者可催化各自的底物發(fā)生氧化作用產(chǎn)生生物熒光， 產(chǎn)生的熒光數(shù)值大小即表示了兩種酶的表達(dá)量多少。Firefly luciferase和 Renilla luciferase之所以被稱為報(bào)告基因，是因?yàn)樵诨虮磉_(dá)調(diào)

2、控研究時(shí)，利用兩者表達(dá)產(chǎn)生的熒光比值可以監(jiān)控、證實(shí)微觀層面上的分子間的相互作用。具體做法是：將靶基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件或5啟動(dòng)子區(qū)克隆在Firefly luciferase基因的上游，或把3 -UTR區(qū)或IncRNA結(jié)合序列克隆在Firefly luciferase基因的下游，以研究啟動(dòng)子的強(qiáng)弱和轉(zhuǎn)錄因子對(duì)啟動(dòng)子的作 用或miRNA對(duì)目的基因或lncRNA的調(diào)控作用(見(jiàn)圖2)。與此同時(shí)，引入 包含Renilla luciferase基因的TK載體作為內(nèi)參，以便消除細(xì)胞轉(zhuǎn)染等因素帶來(lái)的組間誤差。雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)中的luciferase來(lái)源于細(xì)菌、螢火蟲(chóng)、發(fā)光海洋 生物等，可以在哺乳細(xì)胞中直

3、接表達(dá)，無(wú)需表達(dá)后修飾，直接具備完全酶活性。與綠色熒光蛋白（GFP ）不同，它們的發(fā)光檢測(cè)不需要激發(fā)光激發(fā)，且發(fā) 光穿透力更強(qiáng)，這使其具備可定、高靈敏度及低背景等特點(diǎn)。雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)的應(yīng)用下面從實(shí)驗(yàn)方案設(shè)計(jì)、實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理及結(jié)果分析幾個(gè)方面介紹幾個(gè)案例，供大1、利用雙報(bào)告檢測(cè)系統(tǒng)研究miRNA與3 UTR的相互作用實(shí)驗(yàn)?zāi)康模候?yàn)證大鼠miR-1與靶基因ATG13 3 UTR是否發(fā)生作用，并進(jìn) 步確定miR-1與ATG13 3 UTR的作用位點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)方案：構(gòu)建luc-3 -UTR-WT載體和luc-3 -UTR-mut載體，將其與海 腎載體及miRNA mimics共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，轉(zhuǎn)染2

4、4-48h后使用雙熒光素酶 報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)（翊圣產(chǎn)品貨號(hào)：11402ES ）檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)分組：實(shí)驗(yàn)結(jié)果:Luc-3 UTR-WT + mimics-NCLuc-3 UTR-WT + mimics-miR-1Luc-3 UTR-mut + mimics-NCLuc-3 UTR-mut + mimics-miR-1實(shí)驗(yàn)分組Luc值（均值）Ren值（均值）Luc-NC + mimics-Nuc-NC + mimics-miR-117457730016Luc-3 UTR-WT + mimics-Nuc-3 UTR-WT + mimics-miR-13

5、577330233Ratio （均值）5.7985.8545.8201.202Luc-3 UTR-mut + mimics-Nuc-3 UTR-mut + mimics-miR-1188393325505.7575.821293T3UTR相互作用的分析（*表示p0.001）實(shí)驗(yàn)結(jié)論:ATG13 3 UTR 為 miR-1 靶序列。2、利用雙報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)研究轉(zhuǎn)錄因子與啟動(dòng)子的相互作用實(shí)驗(yàn)?zāi)康模候?yàn)證轉(zhuǎn)錄因子IRF3對(duì)IFN-P啟動(dòng)子的調(diào)控作用。實(shí)驗(yàn)方案：構(gòu)建Luc-IFN-p啟動(dòng)子載體和IRF3的過(guò)表達(dá)載體。共轉(zhuǎn)染后，使用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)（翊圣產(chǎn)品貨號(hào)：11

6、402ES ）檢測(cè)分析熒光值差異。實(shí)驗(yàn)分組：對(duì)照組為L(zhǎng)uc-IFN-p和pTK-RL，實(shí)驗(yàn)組為L(zhǎng)uc-IFN-久 pTK-RL和IRF3的過(guò)表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染。實(shí)驗(yàn)結(jié)果：Ti.KdiFMi-iHr實(shí)驗(yàn)分組Luc值（均值）Ren值（均值）Ratio （均值）對(duì)照組695764569790.15實(shí)驗(yàn)組4627901624828.48圖4. IRF3對(duì)IFN-p啟動(dòng)子的調(diào)實(shí)驗(yàn)結(jié)論：轉(zhuǎn)錄因子IRF3對(duì)IFN-P啟動(dòng)子起正調(diào)控作用。作為報(bào)告基因檢測(cè)試劑研發(fā)的廠家，我們?yōu)榇蠹铱偨Y(jié)了獲取好數(shù)據(jù)的方法，避免大家掉坑：坑1：檢測(cè)數(shù)值太低正常表達(dá)水平下，熒光值的數(shù)量級(jí)應(yīng)在104-107數(shù)量級(jí)左右，導(dǎo)致數(shù)值低主要 有以

7、下幾個(gè)原因：?jiǎn)?dòng)子活性、轉(zhuǎn)染效率低、裂解不充分、底物失效、操作不 規(guī)范等原因，具體的原因需要實(shí)驗(yàn)者進(jìn)行排查。相應(yīng)的解決方案如下表：實(shí)驗(yàn)解決方案問(wèn)題1、確保細(xì)胞狀態(tài)是良好的，通常選擇指數(shù)分裂期的細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染；2、可以選擇過(guò)表轉(zhuǎn)染達(dá)的熒光蛋白質(zhì)粒作為陽(yáng)性對(duì)照；3、轉(zhuǎn)染試劑的選擇也至關(guān)重要，比如在做miRNA效率研究的實(shí)驗(yàn)中，如果Lipo2000或Lipo3000的轉(zhuǎn)染效率不能滿足的話，可以選擇更換 其它轉(zhuǎn)染試劑。裂解1、細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)，最好不超過(guò)36h，培養(yǎng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)的話，細(xì)胞難裂解2、裂不充底物失效操作解液的量要足以充分裂解細(xì)胞3、實(shí)驗(yàn)對(duì)象為煙草葉片時(shí)，可在EP管中加入液氮和預(yù)冷的小鋼珠對(duì)葉片進(jìn)行研磨，使裂解更充分1、底物保存的時(shí)候要避光低溫保存，尤其是腔腸素，推薦-80C保存。2、反應(yīng)工作液建議現(xiàn)配現(xiàn)用。熒光素酶的半衰期一般約30min，加完底物后可立即檢測(cè)，盡量在30min內(nèi)完成。不當(dāng)坑2.復(fù)孔差異大雙報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)較為靈敏，檢測(cè)結(jié)果受多種因素的影響，因此，一般設(shè)置 3個(gè)或3個(gè)以上的復(fù)孔，復(fù)孔之間有差