蒿鱉養(yǎng)陰軟堅(jiān)方對(duì)四氯化碳所致肝纖維化的治療作用研究

1、蒿鱉養(yǎng)陰軟堅(jiān)方對(duì)四氯化碳所致肝纖維化的治療作用研究孔維涵，郝潔，方步武，張永進(jìn)，邢偉，劉潔瑩，凌寧生，張玉萍，崔志清【摘要】目的探究蒿鱉養(yǎng)陰軟堅(jiān)方治療l4等所致肝纖維化的作用。要領(lǐng)0.5ll4/100gt皮下注射16次(后15次注射用l4橄欖油=46,V/V)輔以10%乙醇為飲料制備肝纖維化模子，成模后以蒿鱉養(yǎng)陰軟堅(jiān)方治療，灌胃用藥24.48g/kg(生藥/體重)和8.16g/kg，每周6d2個(gè)月。效果8.16g/kg蒿鱉養(yǎng)陰軟堅(jiān)方能顯著低落肝纖維化大鼠肝構(gòu)造膠原卵白含量及血清透明質(zhì)酸和IV型膠原(P0.05)。結(jié)論蒿鱉養(yǎng)陰軟堅(jiān)方具有治療l4等所致肝纖維化的作用?！娟P(guān)鍵詞】四氯化碳所致肝纖維化

2、蒿鱉養(yǎng)陰軟堅(jiān)方治療作用膠原纖維羥脯氨酸透明質(zhì)酸IV型膠原TheEffetfHa-bieYangyinRuanjianPresriptininTreatingHepatiFibrsisausedbyl4Keyrds：arbntetrahlride;Hepatifibrsis;Ha-bieYangyinRuanjianPresriptin;Therapeutieffet;llagenusfiber;Hydrxyprline;Hyalurniaid;Type-IVllagen肝纖維化存在于種種慢性肝病的發(fā)病歷程中，發(fā)病率高。慢性肝病運(yùn)動(dòng)期(如慢性運(yùn)動(dòng)型肝炎、運(yùn)動(dòng)期肝硬化、慢性重癥肝炎)通常出現(xiàn)陰虛血

3、淤證型，且病情較重、治療較難。臨床盛行病學(xué)視察1效果表現(xiàn)，陰虛血淤是肝炎后肝硬化最常見的證型之一，有陰虛兼證的占47.04%(135/287)。而如今上市的抗肝纖維化藥物險(xiǎn)些均以益氣活血法為主組方，不宜用于陰虛血瘀證型。蒿鱉養(yǎng)陰軟堅(jiān)方為方步武領(lǐng)悟?溫病條辨?青蒿鱉甲湯方義、朱起貴傳授治療慢性肝病的用藥履歷和當(dāng)代藥理研究的效果等創(chuàng)制的一首方劑。該方以養(yǎng)陰活血軟堅(jiān)、涼血清熱解毒法組方，由青蒿、鱉甲、知母、生地、丹參、虎杖、白花蛇舌草等9味藥構(gòu)成，用于治療陰虛血淤、血熱毒蘊(yùn)的肝纖維化。本研究接納l4等制備肝纖維化模子，成模后以該方的粗提物治療，以明白蒿鱉養(yǎng)陰軟堅(jiān)方治療肝纖維化的作用，為其臨床應(yīng)用與進(jìn)

4、一步研發(fā)提供實(shí)行根據(jù)。1質(zhì)料與儀器1.1動(dòng)物SPF級(jí)istar大鼠46只，牝牡各半，體重220240g，由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)行動(dòng)物中心提供，動(dòng)物及格證號(hào)：SXK-軍2002-001。豢養(yǎng)于天津醫(yī)科大學(xué)實(shí)行動(dòng)物中心，自由進(jìn)食水。1.2藥品先將鱉甲煎煮2h，參加其他八味藥材，6倍量水提取1次，1h/次；將藥渣晾干，用60乙醇6倍量提取2次，0.5h/次。歸并濾液，接納乙醇，濃縮樣品液，定容至所需濃度(含生藥2g/l)。在中新藥業(yè)天津樂仁堂制藥廠和天津隆順榮制藥廠提齲1.3試劑L-羥脯氨酸，電泳純，上?？颠_(dá)氨基酸廠消費(fèi)，批號(hào)920506；對(duì)二甲氨基苯甲醛，闡發(fā)純，天津化學(xué)試劑研究所消費(fèi)，批號(hào)20020

5、322；高氯酸，優(yōu)級(jí)純，天津市化學(xué)試劑一廠消費(fèi)，批號(hào)20220229；橄欖油，化學(xué)純，北京化學(xué)試劑公司消費(fèi)，批號(hào)：69018028；四氯化碳，闡發(fā)純，天津大學(xué)科威公司消費(fèi)，批號(hào)20221028；甲醛溶液，闡發(fā)純，天津市化學(xué)試劑六廠消費(fèi)，批號(hào)20220912；透明質(zhì)酸(HA)和IV型膠原(IV-)放射免疫闡發(fā)試劑盒由天津九鼎醫(yī)門生物工程提供；III型膠原(III-)放射免疫闡發(fā)試劑盒為上海海研醫(yī)門生物技能產(chǎn)物，批號(hào)20220401；其他均為市售闡發(fā)純?cè)噭?.4儀器VIS-7220紫外可見分光光度計(jì)，北京瑞利闡發(fā)儀器公司消費(fèi)；光學(xué)顯微鏡，日本lypus公司消費(fèi)。2要領(lǐng)2.1模子制備對(duì)iyazak

6、i要領(lǐng)2略加修改：按體重隨機(jī)區(qū)組分組法，隨機(jī)取8只大鼠為正常比較組(正常組，此中1只換墊料時(shí)跑掉)，別的大鼠用于造模。造模第1次四肢皮下注射l40.5l/100g體重，以后每隔3天四肢皮下注射l4橄欖油溶液l4橄欖油=46,V/V0.5l/100g體重，共注射16次，平常以10%乙醇為唯一飲料，但注射前一天暫時(shí)改為清潔自來水為飲料，注射后再立即改為10%乙醇。造模時(shí)不消玉米面、豬油、膽固醇，而用大鼠尺度飼料。正常組大鼠不可造模處置懲罰。2.2分組與給藥造模45天后，隨機(jī)取8只造模鼠(短模組)，經(jīng)肝構(gòu)造羥脯氨酸(hydrxyprline,Hyp)含量測(cè)定與肝構(gòu)造形態(tài)學(xué)不雅察證明肝纖維化形成。對(duì)別

7、的造模鼠按體重隨機(jī)區(qū)組分組法分為3組：模子比較組(長(zhǎng)模組)、蒿鱉養(yǎng)陰軟堅(jiān)方大劑量組、蒿鱉養(yǎng)陰軟堅(jiān)方小劑量組(臨床等效劑量組)。造模樂成后開始治療用藥：蒿鱉養(yǎng)陰軟堅(jiān)方大、小劑量組別離天天灌胃24.48g/kg和8.16g/kg，體積均為13l/kg，1次/d，每周用藥6d，一連2個(gè)月。正常比較組和長(zhǎng)模組灌胃等體積蒸餾水。末了1次灌胃竣事24h后，大鼠以水合氯醛麻醉，仰臥位剖腹，腹腔靜脈取血，分散血清，-20保存。取肝構(gòu)造別離以10%中性甲醛結(jié)實(shí)及入氯仿甲醇(21,V/V)的液體中脫水脫脂。2.3指標(biāo)檢測(cè)接納Jaall法，將Hyp(g/g)乘以系數(shù)22.38(6000/507.46/40)(g/g

8、=g/g，膠原卵白/肝干粉)。III型膠原(PIIIP)、IV型膠原(IV-)、透明質(zhì)酸(HA)接納放射免疫闡發(fā)法，見試劑盒說明。通例白臘切片，HE染色和膠原染色，光鏡不雅察。肝纖維化程度分期尺度參照文獻(xiàn)3，分為0，1，2，3，4期：無，為0期；匯管區(qū)擴(kuò)大,纖維化，為1期；匯管區(qū)四周纖維化,纖維隔形成,小葉布局保存，為2期；纖維隔伴小葉布局紊亂,無肝硬化，為3期；早期肝硬化或必定的肝硬化，為4期。2.4統(tǒng)計(jì)闡發(fā)計(jì)量資料表現(xiàn)為s，接納SPSS8.0統(tǒng)計(jì)軟件，兩組間比力用t查驗(yàn)，多組間比力用單因素方差闡發(fā)，此中每?jī)山M間比力在方差齊性時(shí)用LSD查驗(yàn)而方差不齊時(shí)用Tahane查驗(yàn)。半定量資料接納Rid

9、it闡發(fā)。3效果3.1一樣平常環(huán)境正常組大鼠生長(zhǎng)精良，皮毛柔順有光芒，生動(dòng)好動(dòng)，飲食正常；模子組大鼠精力差，運(yùn)動(dòng)少，皮毛敗壞無光芒；治療組大鼠皮毛少光芒，但精力較好。3.4肝構(gòu)造病理形態(tài)變革鏡下不雅察：正常組大鼠肝構(gòu)造可見肝板以中心靜脈為中心呈條索狀向附近放射樣擺列，板間有不規(guī)矩肝竇，肝小葉內(nèi)網(wǎng)狀纖維支架布局完備，匯管區(qū)無擴(kuò)大，無纖維構(gòu)造增生和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；肝纖維化模子組大鼠肝小葉布局粉碎，纖維構(gòu)造增生顯著，將肝小葉分開成巨細(xì)不等的肝細(xì)胞團(tuán)，肝細(xì)胞變性壞死，并可見假小葉形成，匯管區(qū)擴(kuò)大，膠原沉積；治療組肝細(xì)胞的變性壞死程度及肝小葉布局粉碎程度低落，肝膠原纖維增生亦顯著減輕，纖維條索疏松變窄。模

10、子組的肝纖維化程度分期明顯高于正常組P0.01，各治療組的纖維化程度均有所減落，但未見統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。見表1及圖14。4討論4.1l4致大鼠肝纖維化模子形成通過肝構(gòu)造膠原卵白含量、血清肝纖維化標(biāo)記物(HA、IV-等)和肝構(gòu)造形態(tài)學(xué)變革等定量、定性指標(biāo)判斷，本研究所接納的l4等可致大鼠肝纖維化模子形成。本文肝構(gòu)造膠原卵白含量是通過所測(cè)定的Hyp換算出來的，Hyp是構(gòu)成機(jī)體膠原卵白的一種特有的氨基酸，除外彈性卵白含少量Hyp(約1%)，險(xiǎn)些全部Hyp均存在于膠原，因此其能定量反響肝纖維化的程度。同時(shí)造模組肝臟纖維構(gòu)造增生明顯，可見假小葉形成。與韓德五傳授的模要領(lǐng)差異的是未利用玉米面、豬油、膽固醇，而用

11、大鼠尺度塊料；僅用10%酒精為飲料，且在注射前一天下戰(zhàn)書17:00時(shí)擺布改用清潔水為飲料，注射后又立即規(guī)復(fù)用10%酒精為飲料，這些方法可低落造模大鼠的殞命率，更輕便，同樣可引起肝纖維化(雖其程度稍輕)。造模歷程中大鼠殞命4只，此中1只為天然殞命(瘦弱、纖維化程度重)，別的3只因捉拿時(shí)用力過大而死。l4是強(qiáng)力的肝毒劑，如今以為l4通過氧化應(yīng)激(產(chǎn)生自由基、引發(fā)由X介導(dǎo)的炎癥反響、導(dǎo)致肝星狀細(xì)胞活化)、加強(qiáng)細(xì)胞因子(TGF1、TNF、ILs等)活性和引起體內(nèi)相干酶系變革(ALT、AST、YP450活性升高)而引起肝損傷4，這些均為肝纖維化產(chǎn)生的緊張機(jī)制；一連利用少量乙醇可誘導(dǎo)YP450酶，該酶在l

12、4引起的肝纖維化歷程中起著緊張作用。4.2蒿鱉養(yǎng)陰軟堅(jiān)方具有治療l4所致大鼠肝纖維化的作用由于這里的造模僅用l4、酒精，未加用豬油、膽固醇、玉米面，慢性肝損傷略輕；同時(shí)接納治療給藥，一那么因?qū)嵭兄芷谳^長(zhǎng)，l4所致肝纖維化有自行汲取傾向(終究上這是以l4為重要損傷因素誘導(dǎo)肝纖維化模子的配合不敷)，二那么治療肝纖維化較之防范的難度大，但只管云云，蒿鱉養(yǎng)陰軟堅(jiān)方仍具有精良的治療l4所致大鼠肝纖維化的作用，表現(xiàn)為能顯著低落肝構(gòu)造膠原卵白含量及血清HA和IV-水同等公認(rèn)的肝纖維化指標(biāo)。也不雅察到蒿鱉養(yǎng)陰軟堅(jiān)方大劑量組(24.48g/kg)的療效不及小劑量組(8.16g/kg)，這里的小劑量即臨床等效劑量，一方面提示對(duì)慢性肝病的藥物治療要留意接納符合的劑量，另一方面說明該研究的效果對(duì)臨床用藥有緊張的引導(dǎo)意義、劑量方案是公正的，為進(jìn)一步研發(fā)奠基了精良的基矗總之，本研究所方案的l4為主并用少量乙醇的造模方案引起了明白的肝纖維化病變，蒿鱉養(yǎng)陰軟堅(jiān)方粗提物在成模后用藥具有治療l4等所致肝纖維化的作用，其作用機(jī)理有待進(jìn)一步探究?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】1張琴，張文彤，魏建軍，等.公因子和聚類闡發(fā)團(tuán)結(jié)在肝炎后肝硬化證候分類研究中的應(yīng)用J.中西醫(yī)團(tuán)結(jié)學(xué)報(bào)，2022,3(1):14.2iyazakiT,Karube,atsuzakiY,etal.Taurineinhib