真核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)

1、之南宮幫珍創(chuàng)作自上世紀(jì)70年代基因工程技術(shù)誕生以來，基因表達(dá)技術(shù)已滲透到 生命科學(xué)研究的各個(gè)領(lǐng)域。 并隨著人類基因組計(jì)劃實(shí)施的進(jìn)行，在技術(shù)方法上得到了很大發(fā)展，時(shí)至今日已取得令人矚目的成就。隨著人類基因組計(jì)劃的完成， 越來越多的基因被發(fā)現(xiàn)， 其中多數(shù)基因 功能不明。利用表達(dá)系統(tǒng)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)表達(dá)目的基因是研究基 因功能及其相互作用的重要手段。在各種表達(dá)系統(tǒng)中，最早被采取進(jìn)行研究的是原核表達(dá)系統(tǒng)，這也是目前掌握最為成熟的表達(dá)系統(tǒng)。該項(xiàng)技術(shù)的主要方法是將已克隆 入目的基因DNA片段的載體（一般為質(zhì)粒）轉(zhuǎn)化細(xì)菌（通常選用的是 大腸桿菌），通過IPTG誘導(dǎo)并最終純化獲得所需的目的蛋白。其優(yōu)點(diǎn)在于能夠

2、在較短時(shí)間內(nèi)獲得基因表達(dá)產(chǎn)品，而且所需的成底細(xì)對比較低廉。但與此同時(shí)原核表達(dá)系統(tǒng)還存在許多難以克服的缺點(diǎn)： 如通常使用的表達(dá)系統(tǒng)無法對表達(dá)時(shí)間及表達(dá)水平進(jìn)行調(diào)控，有些基因的持續(xù)表達(dá)可能會(huì)對宿主細(xì)胞發(fā)生毒害作用，過量表達(dá)可能導(dǎo)致非生理反應(yīng)，目的蛋白常以包涵體形式表達(dá)， 導(dǎo)致產(chǎn)品純化困難； 而且原核表達(dá)系統(tǒng)翻譯后加工修飾體系不完善，表達(dá)產(chǎn)品的生物活性較低。為克服上述缺乏，許多學(xué)者將原核基因調(diào)控系統(tǒng)引入真核基因調(diào)控 領(lǐng)域，具優(yōu)點(diǎn)是：根據(jù)原核生物蛋白與靶 DNA間作用的高度特異性設(shè)計(jì)，而靶 DNA 與真核基因調(diào)控序列基本無同源性，故不存在基因的非特異性激活或抑制；能誘導(dǎo)基因高效表達(dá)，可達(dá) 105倍，為

3、其他系統(tǒng)所不及；能嚴(yán)格調(diào)控基因表達(dá)， 即不但可控制基因表達(dá)的“開關(guān)”，還可人為地調(diào)控基因表達(dá)量。因此，利用真核表達(dá)系統(tǒng)來表達(dá)目的蛋白越來越受到重視。目前，基因工程研究中經(jīng)常使用的真核表達(dá)系統(tǒng)有酵母表達(dá)系統(tǒng)、昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)和哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)。1、酵母表達(dá)系統(tǒng)最早應(yīng)用于基因工程的酵母是釀酒酵母，后來人們又相繼開發(fā)了裂殖酵母、克魯維酸酵母、甲醇酵母等，其中，甲醇酵母表達(dá)系統(tǒng)是目前應(yīng)用最廣泛的酵母表達(dá)系統(tǒng)。目前甲醇酵母主要有HPolymorpha , Candida Bodini , Pichia Pastris3 種。以 Pichia Pastoris 應(yīng)用最多。甲醇酵母的表達(dá)載體為整合型質(zhì)粒

4、，載體中含有與酵母染色體中同源的序列，因而比較容易整合入酵母染色體中。大部分甲醇酵母的表達(dá)載體中都含有甲醇酵母醇氧化酶基因一1(A0 x1),在該基因的啟動(dòng)子(PAXOI)作用下，外源基因得以表達(dá)。PAXOI是一個(gè)強(qiáng)啟動(dòng)子，在以葡萄糖或甘油為碳源時(shí)。甲醇酵母中AOx1基因的表達(dá)受到抑制，而在以甲醇為唯一碳源時(shí)PAXOI可被誘導(dǎo)激活，因而外源基因可在其控制下表達(dá)，將目的基因多拷貝整合入酵母染色體后可 以提高外源蛋白的表達(dá)水平及產(chǎn)量。此外甲醇酵母的表達(dá)載體都為E.coli /Pichia Pastoris的穿梭載體，其中含有 E.coli 復(fù)制起點(diǎn)和篩選標(biāo)記，可在獲得克隆后采取E.coli細(xì)胞大量

5、擴(kuò)增.目前，將質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)入酵母菌的方法主要有原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法、電擊法及氯化鋰法等。甲醇酵母一般先在含甘油的培養(yǎng)基中生長。培養(yǎng)至高濃度。再以甲醇為碳源。誘導(dǎo)表達(dá)外源蛋白。這樣可以大大提高表達(dá) 產(chǎn)量。利用甲醇酵母表達(dá)外源性蛋白質(zhì)其產(chǎn)量往往可達(dá)克級(jí)。與釀酒酵母相比其翻譯后的加工更接近哺乳動(dòng)物細(xì)胞，不會(huì)發(fā)生超糖基化。利用PAXOI表達(dá)外源蛋白時(shí)，一般需很長時(shí)間才干達(dá)到峰值水平， 而甲醇是高毒性、高危險(xiǎn)性化工產(chǎn)品。使得實(shí)驗(yàn)操縱過程中存在不 小的危害性。且不宜于食品等蛋白生產(chǎn)。 因此那些不需要甲醇誘導(dǎo) 的啟動(dòng)子受到青睞包含 GAR FLD1、PEX8 YPTI等多種。利用三磷 酸甘油醛脫氫酶（GAP）啟動(dòng)子

6、代替 PAXOI不需要甲醇誘導(dǎo)。培養(yǎng) 過程中無需更換碳源， 操縱更為簡便，可縮短外源蛋白到達(dá)峰值水 平的時(shí)間。酵母表達(dá)系統(tǒng)作為一種后起的外源蛋白表達(dá)系統(tǒng)，由于兼具原核以及真核表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)，正在基因工程領(lǐng)域中得到日益廣泛的應(yīng) 用。2、昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)是目前應(yīng)用最廣的昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)，該系統(tǒng)通常采取目宿銀紋夜蛾桿狀病毒 （AcNPV）作為表達(dá)載體。在 AcNPW 染昆蟲細(xì)胞的后期，核多角體基因可編碼發(fā)生多角體蛋白， 該蛋白 包裹病毒顆粒可形成包涵體。 核多角體基因啟動(dòng)子具有極強(qiáng)的啟動(dòng)蛋白表達(dá)能力，故常被用來構(gòu)建桿狀病毒傳遞質(zhì)粒?？寺∪胪庠椿虻膫鬟f質(zhì)粒與野生型 AcNPV共轉(zhuǎn)染昆

7、蟲細(xì)胞后可發(fā)生同源重組，重組后多角體基因被破壞，因而在感染細(xì)胞中不克不及形成包涵體，利用這一特點(diǎn)可挑選出含重組桿狀病毒的昆蟲細(xì)胞但效率比較低，且載體構(gòu)建時(shí)間長，一般需要46周。止匕外，昆蟲細(xì)胞不克不及表達(dá)帶有完整N聯(lián)聚糖的真核糖蛋白。在病毒感染晚期，由于大量外源蛋白的表達(dá)引起昆蟲細(xì)胞的裂解，胞質(zhì)內(nèi)的物質(zhì)釋放出來， 與目的蛋白混在一起， 從而使蛋白的純化工作變得很困難，另外水解酶的釋放會(huì)降解重組蛋白。為了克服以上這些困難，科學(xué)工作者先后測驗(yàn)考試用絲蛾肌動(dòng)蛋白基因啟動(dòng)子或桿狀病毒ie-1基因啟動(dòng)子表達(dá)外源蛋白，但效果都不明顯。Farrel等介紹了一種新型的鱗翅目昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)，該系統(tǒng)主要包含3個(gè)

8、調(diào)節(jié)外源蛋白表達(dá)序列：Bombyx mori的肌動(dòng)蛋白基因啟動(dòng)子；Bombyx mori的核型多角體病毒(BmNPV的立早基因ie-1(編碼俄IE-1蛋白，該蛋白是種轉(zhuǎn)錄激活因子，可在體外激活肌動(dòng)蛋白基因啟動(dòng)子)；BmNPV勺同源重復(fù)序列3(HR3)可作為肌動(dòng)蛋白基因啟動(dòng)子的增強(qiáng)子。三者協(xié)同作用，可使轉(zhuǎn)錄活性提高1000倍以上，從而大大地提高外源蛋白的表達(dá)水平。另外目前還有一種新型的宿主范圍廣的雜合核多角體病毒(HyNPVX應(yīng)用于昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建，該病毒 由AcNPVM BniqP 發(fā)展而來。一般情況下桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)所能表達(dá)的外源蛋白只有少部分是分泌性的，大部分為非分泌性。為了解決這個(gè)

9、問題將Hsp70（熱休克蛋白70）與外源蛋白共表達(dá)可明顯提高重組蛋白的分泌水平，這 是因?yàn)榉置谛远嚯谋环g后必須到達(dá)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)進(jìn)行加工才干被分泌 至胞外。如果到達(dá)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)前，前體多肽就伸展開來，流露出疏水殘 基，殘基間的相互作用可引起多肽的凝聚，這對最終的表達(dá)水平有很大影響。而Hsp70是一種分子伴侶，能夠與新翻譯的多肽結(jié)合， 抑制前體肽的凝聚使前體肽順利到達(dá)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)進(jìn)行加工，從而提高蛋白的分泌水平。最近，人們又構(gòu)建了桿狀病毒-S2表達(dá)系統(tǒng)，該系統(tǒng)能將重組桿狀 病毒轉(zhuǎn)染果蠅S2細(xì)胞，以前人們認(rèn)為桿狀病毒僅能在鱗翅目昆蟲 細(xì)胞（如sf9、sf21）中復(fù)制，不克不及在其他昆蟲細(xì)胞（如果蠅細(xì)胞）中復(fù)制，然而

10、目前研究標(biāo)明在一定條件下，桿狀病毒也能感染 果蠅細(xì)胞。在果蠅細(xì)胞中，桿狀病毒的多角體基因啟動(dòng)子幾乎不發(fā) 生作用。桿狀病毒-S2表達(dá)系統(tǒng)的表達(dá)載體利用的是果蠅啟動(dòng)子如 Hsp70啟動(dòng)子、肌動(dòng)蛋白 5c啟動(dòng)子、金屬硫蛋白基因啟動(dòng)子等，其中，Hsp70啟動(dòng)子的作用最強(qiáng)。重組桿狀病毒感染S2細(xì)胞后不會(huì)引起宿主細(xì)胞的裂解，且蛋白表達(dá)水平與鱗翅目細(xì)胞相似，因此,桿狀病毒-S2系統(tǒng)是一個(gè)很有應(yīng)用前景的昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)。昆蟲 細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)，特別是桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)由于其操縱平安，表達(dá)量高，目前與酵母表達(dá)系統(tǒng)一樣被廣泛應(yīng)用于基因工程的各個(gè)領(lǐng)域3、哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)由哺乳動(dòng)物細(xì)胞翻譯后再加工修飾發(fā)生的外源蛋白質(zhì)，

11、在活性方面遠(yuǎn)勝于原核表達(dá)系統(tǒng)及酵母、昆蟲細(xì)胞等真核表達(dá)系統(tǒng)，更接近于 天然蛋白質(zhì)。哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體包含原核序列、啟動(dòng)子、增強(qiáng) 子、選擇標(biāo)識(shí)表記標(biāo)幟基因、終止子和多聚核甘酸信號(hào)等。將外源基因?qū)氩溉閯?dòng)物細(xì)胞主要通過2類方法：一是感染性病毒顆粒感染宿主細(xì)胞，二是通過脂質(zhì)體法、顯微注射法、磷酸鈣共沉淀法及DEAE 一葡聚糖法等非病毒載體的方式將基因?qū)氲郊?xì)胞 中。外源基因的體外表達(dá)一般采取質(zhì)粒表達(dá)載體，如將重組質(zhì)粒導(dǎo)入CHC胞可建立高效穩(wěn)定的表達(dá)系統(tǒng)， 而利用COS胞可建立瞬 時(shí)表達(dá)系統(tǒng)。目前，病毒載體已成為動(dòng)物體內(nèi)表達(dá)外源基因的有力 工具，在臨床基因治療的探索中也發(fā)揮了重要作用。痘苗病毒由于其

12、基因的分子量相當(dāng)大（約187kb）,利用它作為載體可同時(shí)拔出幾 種外源基因，從而構(gòu)建多價(jià)疫苗。另外，逆轉(zhuǎn)錄病毒感染效率高， 某些難轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系也可通過其導(dǎo)入外源基因，但要注意的是逆轉(zhuǎn)錄病毒可整合入宿主細(xì)胞染色體，具有潛在的危險(xiǎn)性。由于腺病毒易于培養(yǎng)、純化，宿主范圍廣，故采取該類病毒構(gòu)建的 載體被廣泛應(yīng)用腺病毒載體的構(gòu)建依賴于腺病毒穿梭質(zhì)粒和包裝 載體之間的同源重組。但是哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)的這種同源重組效率很 低，利用細(xì)菌內(nèi)同源重組法構(gòu)建重組體效率會(huì)大大提高，即將外源基因拔出到腺病毒穿梭質(zhì)粒中，形成轉(zhuǎn)移質(zhì)粒，將其線性化后與腺病毒包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化大腸埃希菌另一種方法是通過 病毒包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化大腸埃希菌另

13、一種方法是通過 CrelaxP系統(tǒng)構(gòu)建重組腺病毒載體，在轉(zhuǎn)移質(zhì)粒和包裝質(zhì)粒中都拔出laxP位點(diǎn)，然后將兩個(gè)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染表達(dá) Cre重組酶的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，通過 Cre 介導(dǎo)兩個(gè)laxP位點(diǎn)之間的DNAt生重組，可獲得重組腺病毒，這 種重組效率比一般的細(xì)胞內(nèi)同源效率高30倍。最近，人們在桿狀病毒中拔出巨細(xì)胞病毒的啟動(dòng)子建立了高效的基因轉(zhuǎn)移載體。由于桿狀病毒是昆蟲病毒，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中不會(huì)引起病毒基因的表 達(dá)，而且載體的構(gòu)建容易，因而利用桿狀病毒進(jìn)行基因轉(zhuǎn)移為我們 提供了很好的途徑。利用哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)外源基因時(shí)，大多數(shù)情況下不需要誘導(dǎo)， 但當(dāng)表達(dá)產(chǎn)品對細(xì)胞有毒性時(shí)應(yīng)采納誘導(dǎo)，這樣可防止表達(dá)產(chǎn)品發(fā)生早

14、期就對細(xì)胞發(fā)生影響。哺乳動(dòng)物細(xì)胞中用到的誘導(dǎo)型載體主要與 啟動(dòng)子有關(guān)如熱休克蛋白啟動(dòng)子可在高溫下被誘導(dǎo)，還有重金屬、 糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的啟動(dòng)子。但這些系統(tǒng)存在一些共同的缺陷，如誘 導(dǎo)表達(dá)特異性差；當(dāng)系統(tǒng)處于關(guān)閉狀態(tài)時(shí)表達(dá)有泄漏誘導(dǎo)劑自己有 毒性，常對細(xì)胞造成損傷等。為此，Gossen等構(gòu)建了受四環(huán)素負(fù)調(diào)節(jié)的 Tet-on基因表達(dá)系統(tǒng)， 該系統(tǒng)由調(diào)節(jié)質(zhì)粒和反應(yīng)質(zhì)粒組成。調(diào)節(jié)質(zhì)粒中具有編碼轉(zhuǎn)錄激活因子(fIA)的序列，在沒有四環(huán)素或強(qiáng)力毒素存在的情況下tTA可引起下游目的基因表達(dá)。隨后Gossen等又對tTA的氨基酸序列進(jìn)行了改造，構(gòu)建了受四環(huán)素正調(diào)節(jié)的Tet-on基因表達(dá)系統(tǒng)，該系統(tǒng)在沒有四環(huán)素的

15、情況下啟動(dòng)子不被激活，而在加入四環(huán)素或強(qiáng)力毒素后目的基因高效表達(dá)。 四環(huán)素誘導(dǎo)的基因表達(dá)系統(tǒng)是目前應(yīng)用最廣泛的哺乳動(dòng)物細(xì)胞誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)，該系統(tǒng)具有嚴(yán)密、高效可控制性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)。外源蛋白的表達(dá)會(huì)對哺乳動(dòng)物細(xì)胞發(fā)生晦氣影響，因此利用哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)外源基因時(shí)，一個(gè)主要問題即是外源基因不克不及持久 穩(wěn)定地表達(dá)。Mielke等構(gòu)建了一種能夠在哺乳動(dòng)物中穩(wěn)定表達(dá)異 二聚體蛋白的載體系統(tǒng)，在這個(gè)系統(tǒng)中，編碼抗體重鏈和輕鏈的 cDNA及喋吟霉素抗性基因被轉(zhuǎn)錄成三順反子mRNA內(nèi)部的順反子通過內(nèi)核糖體進(jìn)入位點(diǎn)（IREs）介導(dǎo)進(jìn)行翻譯，通過持續(xù)選擇壓力， 無需繁瑣的篩選過程，即可獲得持久、穩(wěn)定表達(dá)抗體分子的重組體

16、。 哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)經(jīng)常使用的宿主細(xì)胞有CHO COS BHK SP2/0、NIH3T3等，分歧的宿主細(xì)胞對蛋白表達(dá)水平和蛋白質(zhì)的糖基 化有分歧的影響，因此在選擇宿主細(xì)胞時(shí)應(yīng)根據(jù)具體情況而定。利用基因工程技術(shù)表達(dá)外源蛋白。其產(chǎn)量還不高，難以滿足大規(guī)模的實(shí)際應(yīng)用。通過轉(zhuǎn)基因動(dòng)物或轉(zhuǎn)基因植物技術(shù)可從動(dòng)物的乳汁或 植物的葉組織中很方便地獲得大量較純的生物活性物質(zhì)，但目前這項(xiàng)技術(shù)還不很成熟，有待進(jìn)一步研究。4、結(jié)語目前已經(jīng)建立了多種誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)， 但它們都有其優(yōu)點(diǎn)和缺乏， 這 就需要我們根據(jù)自己的要求選用適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)系統(tǒng)。 一般來說，一個(gè) 理想的可誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)需要符合下述幾個(gè)方面的要求。特異性：該系

17、統(tǒng)不受其他內(nèi)源因素的影響，僅能被外源的非毒性藥物所活化 非干擾性：該系統(tǒng)成分不克不及對細(xì)胞通路有干擾?？烧T導(dǎo)性：該系統(tǒng)在非活化狀態(tài)下本底活性最低，而在活化狀態(tài)下能快速發(fā)生高水平的基因表達(dá)。誘導(dǎo)劑的生物利用率： 調(diào)節(jié)分子能快速滲透人各組織，能通過胎盤屏障及血腦屏障?？赡嫘裕赫T導(dǎo)劑能快速被各組織清除使該系統(tǒng)很快恢復(fù)非活化狀O劑量依賴性：該系統(tǒng)的反應(yīng)與誘導(dǎo)劑的濃度成正比，以便進(jìn)行定性定量分析?？傊鞣N表達(dá)系統(tǒng)各有其優(yōu)缺點(diǎn)，酵母和昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)蛋白表達(dá)水平高，生產(chǎn)成本低，但它們的加工修飾體系與哺乳動(dòng)物細(xì)胞 不完全相同；哺乳動(dòng)物細(xì)胞發(fā)生的蛋白質(zhì)更接近于天然蛋白質(zhì)，但其表達(dá)量低、操縱繁瑣。各種表達(dá)系統(tǒng)

18、由于翻譯后的加工不完全相 同，因而發(fā)生的重組蛋白的生物學(xué)活性和免疫原性有時(shí)會(huì)有不同。Van der Geld 等利用分歧的表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)了蛋白激酶（PR30）,并對它們的抗原性進(jìn)行了比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)的PR3具有與抗PR3抗體結(jié)合的所有表位，在昆蟲細(xì)胞中表達(dá)的PR3具有大部分表位，而在甲醇酵母中表達(dá)的PR3只具有少數(shù)幾個(gè)表位。因此，選擇表達(dá)系統(tǒng)時(shí)，必須充分考慮各種因素，如所需表達(dá) 的蛋白質(zhì)性質(zhì)、實(shí)驗(yàn)條件、生產(chǎn)成本、表達(dá)水平、平安性等，權(quán)衡 利弊后再選擇相應(yīng)的表達(dá)系統(tǒng)。隨著人類基因組計(jì)劃的完成 ，越來越多的基因被發(fā)現(xiàn)，其中多數(shù)基因功能不明。利用表達(dá)系統(tǒng)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)表達(dá)目的基因

19、是研究基因功能及其相互作用的重要手段，但由于通常使用的表達(dá)系統(tǒng)無法對表達(dá)時(shí)間及表達(dá)水平進(jìn)行調(diào)控，有些基因的持續(xù)表達(dá)可能會(huì)對 宿主細(xì)胞發(fā)生毒害作用，過量表達(dá)可能導(dǎo)致非生理反應(yīng)，因此，組成型表達(dá)系統(tǒng)的應(yīng)用受到一定限制。轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展使我們可以在體內(nèi)更有效地研究基因的功能，由于大部分基因在體內(nèi)都是在特定 組織或特定發(fā)育階段表達(dá)的，要想有效研究這些特定基因的作用，就需要在特定的時(shí)間以適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)水平實(shí)現(xiàn)目的基因的表達(dá)。誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)可以在時(shí)空上控制目的基因的表達(dá)，這對認(rèn)識(shí)基因在生長發(fā)育、生理活動(dòng)及其病理過程中的作用具有重要意義。較早的誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)通常采取哺乳動(dòng)物自己的基因表達(dá)調(diào)控元件，雖然用誘導(dǎo)劑可以控

20、制目的基因的表達(dá)，但由于誘導(dǎo)劑在細(xì)胞內(nèi)還控制其他的靶基因，這可能會(huì)嚴(yán)重干擾對目的基因的研究 ，發(fā)生假陽性或 假陰性實(shí)驗(yàn)結(jié)果。為了解決這一問題，一些生物學(xué)家利用非哺乳動(dòng)物的基因表達(dá)調(diào)控元件或不再對響應(yīng)內(nèi)源誘導(dǎo)劑的突變型內(nèi)源表 達(dá)調(diào)控元件建立了一些可誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)。目前比較成熟的誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)主要有 4種：四環(huán)素誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)，蛻皮激素(ecdysone)誘導(dǎo) 表達(dá)系統(tǒng)，他克莫司(tacrolimus,FK506)/ 雷帕霉素(rapamycin)誘 導(dǎo)系統(tǒng)和RU486誘導(dǎo)系統(tǒng)。1、四環(huán)素誘導(dǎo)系統(tǒng)四環(huán)素誘導(dǎo)系統(tǒng)(tetracycline inducible system)是由 Gossen 及Bujar

21、d首先建立的，該系統(tǒng)采取細(xì)菌的四環(huán)素抗性把持子，因?yàn)樗耆莵碓从谠思?xì)胞，因此有較好的特異性。此系統(tǒng)的作用依賴 于四環(huán)素調(diào)控的反式作用因子(tTA/rtTA)和反式作用因子依賴的啟動(dòng)子兩個(gè)成分。四環(huán)素反式激活蛋白(tTA)是一個(gè)包含大腸桿菌TN10四環(huán)素耐藥把持子阻遏物和單純皰疹病毒p16蛋白(VP16)C端部分的融合蛋白，tTA依賴啟動(dòng)子由融合有 RNA聚合酶II啟動(dòng)子的 四環(huán)素把持子(tetO)基因序列構(gòu)成，這種融合使真核細(xì)胞中的tet阻遏物成為很強(qiáng)的翻譯激活物。在缺乏四環(huán)素及其衍生物的條件下tTA與tetO序列結(jié)合，使tTA依賴啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄過程被激活；而在 存在四環(huán)素及其衍生物的條件下

22、，tTA無法與其靶位點(diǎn)相互作用，轉(zhuǎn) 錄也就無法進(jìn)行;tet系統(tǒng)中tTA的作用稱為tet-OFF。后來Gos-sen 等又構(gòu)建了反式tTA(rtTA),它是一種突變形式的tTA,包含突變形 式的蛋白tetR。與tTA作用相反，這種rt-TA只有在四環(huán)素及其衍 生物的作用下才干與 DNA結(jié)合并激活轉(zhuǎn)錄。如果沒有藥物刺激，就 不表達(dá)目的基因，因此rt-TA的作用稱tet-ON。這兩種蛋白在組織 培養(yǎng)、果蠅及轉(zhuǎn)基因小鼠中都被證明能有效調(diào)控外源基因的表達(dá)。Parrado等成功的應(yīng)用tet-OFF系統(tǒng)證實(shí)PLZF(早幼粒細(xì)胞白血病 鋅指)基因在淋巴細(xì)胞中表達(dá)具有抗凋亡作用。Rhoades等應(yīng)用四環(huán)素可誘導(dǎo)

23、系統(tǒng)成功建立了轉(zhuǎn)基因小鼠模型，為研究 AML1-ETO在白血病發(fā)生中的作用奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。四環(huán)素誘導(dǎo)系統(tǒng)在細(xì)胞水平和轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中被廣泛用來研究基因 的功能，但它有一個(gè)顯著的缺點(diǎn)，即只有篩選大量的克隆或動(dòng)物才干得到有較低表達(dá)布景而目的基因能顯著激活的理想克隆或轉(zhuǎn)基 因品系。解決這一問題的一個(gè)戰(zhàn)略是把此系統(tǒng)的各元件構(gòu)建到同一個(gè)載體上，這樣只需一次轉(zhuǎn)染就可以使基因的轉(zhuǎn)錄得到調(diào)控。逆轉(zhuǎn) 錄病毒把基因轉(zhuǎn)移到細(xì)胞內(nèi)的能力比質(zhì)粒轉(zhuǎn)染有效得多，Bohl等7就通過使用簡化的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體取得了理想的結(jié)果。針對rtTA有本底表達(dá)的缺陷又發(fā)生了幾種改進(jìn)的系統(tǒng)。tTR是一種改進(jìn)的tetO的抑制物，當(dāng)它與rtTA共同

24、表達(dá)時(shí)，若無四環(huán)素及其 衍生物就與tetO結(jié)合從而抑制rt-TA的本底表達(dá)，而在四環(huán)素等的 作用下，tTR不克不及與DNA吉合而由rtTA占據(jù)tetO位點(diǎn)，因此目 的基因的表達(dá)被高效激活。2、蛻皮激素誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)蛻皮激素誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)是基于昆蟲蛻皮激素通過蛻皮激素受體激活基因表達(dá)的能力而設(shè)計(jì)的。該系統(tǒng)使用蛻皮激素受體與果蠅超螺旋蛋白(ultraspiracleprotein,USP) 的異源二聚體，加入蛻皮激素 或合成的類似物幕黎留酮 A(muristeroneA)后，蛻皮激素與其受體結(jié)合，蛻皮激素受體就與 US磔生相互作用，進(jìn)而與DNA!的反 應(yīng)元件結(jié)合，最終啟動(dòng)下游目的基因的轉(zhuǎn)錄。由于哺乳動(dòng)

25、物細(xì)胞對 蛻皮激素(或幕黎爸酮A)沒有反應(yīng)性，也不含蛻皮激素受體，所以本 底轉(zhuǎn)錄水平非常低。這種誘導(dǎo)系統(tǒng)在幕黎留酮A作用下可得到100150倍的高表達(dá)。后來又發(fā)展為一種改進(jìn)的蛻皮激素系統(tǒng)，這一系統(tǒng)把蛻皮激素受體突變體含依托泊昔(VP16)的反式激活結(jié)構(gòu) 域與USP的哺乳動(dòng)物類似物-類視黃醇X(RXR)融合在一起。由于蛻皮激素受體的 DNA吉合位點(diǎn)也可以被人類受體（類法尼醇X受 體）識(shí)別，上述系統(tǒng)改變了 DNA結(jié)合位點(diǎn)的序列，使它只能被突變的 蛻皮激素受體識(shí)別，這就防止了內(nèi)在激素的影響，極大地降低了本底表達(dá)，在培養(yǎng)的細(xì)胞系中甚至可得到比本底高10000倍的誘導(dǎo)水平。在小鼠腹膜內(nèi)注射幕黎留酮A16

26、h后，也檢測到基因得到相當(dāng)高水平的表達(dá)。幕黎留酮 A沒有毒性也沒有致畸性，而且和蛻皮激素 一樣可在注射后20h以內(nèi)完全排泄，因此這一系統(tǒng)是進(jìn)行轉(zhuǎn)基因動(dòng) 物實(shí)驗(yàn)的一個(gè)理想工具，在基因治療方面也很有前景。若在這一系 統(tǒng)上用一個(gè)組織特異的啟動(dòng)子代替CMVS動(dòng)子，就可使目的基因只能在特定的組織或細(xì)胞中誘導(dǎo)表達(dá)，這對在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的特定組織中研究靶基因的功能非常有用。Xiao等就用骨骼肌的 -肌動(dòng)蛋白 啟動(dòng)子代替了 CMV動(dòng)子，他們用改造的可誘導(dǎo)系統(tǒng)建立穩(wěn)定細(xì)胞 株，研究發(fā)現(xiàn)在分化成熟的肌細(xì)胞中可誘導(dǎo)報(bào)導(dǎo)基因的表達(dá)，而在未分化的肌細(xì)胞中則沒有表達(dá)。Stolarov 等13通過蛻皮激素可誘導(dǎo)系統(tǒng)證實(shí)PTEN

27、K抑制PI3K通路，從而說明了 PTEN卬制腫瘤的 機(jī)制。3、他克莫司（FK506）/雷帕霉素（rapamycin）誘導(dǎo)系統(tǒng) 環(huán)抱素A受體和親免素（FKBP12-rapamycin相關(guān)蛋白，F(xiàn)RAP）蛋白家 族以及他克莫司（tacrolimus,FK506）-結(jié)合蛋白（FKBPs）都含有化學(xué)結(jié)合結(jié)構(gòu)域，此結(jié)構(gòu)能與DNA吉合結(jié)構(gòu)域和反式激活結(jié)構(gòu)域相融 合。而免疫抑制劑FK506、雷帕霉素和環(huán)抱素A（CsA）等小分子化學(xué) 誘導(dǎo)物可以誘導(dǎo)這些嵌合轉(zhuǎn)錄因子的二聚化，從而強(qiáng)烈刺激陳述基因的表達(dá)。因此在不影響正常細(xì)胞生理過程的情況下,就可以通過因的表達(dá)。因此在不影響正常細(xì)胞生理過程的情況下,就可以通過誘導(dǎo)

28、二聚體的小分子藥物的濃度以劑量應(yīng)答的方式調(diào)控靶基因的 表達(dá)水平。為了能用于基因治療，又對這一系統(tǒng)進(jìn)行了一系列人源化的改進(jìn)，如轉(zhuǎn)錄激活因子的非人源部分用一般認(rèn)為無免疫性的成分取代,GAL4部分則由嵌合的DNA吉合結(jié)構(gòu)域ZFHDt代,VP16激活結(jié)構(gòu) 域可以用NF-kBp65的激活結(jié)構(gòu)域代替，最后親環(huán)蛋白由FKBP12雷 帕霉素結(jié)合結(jié)構(gòu)域（FRB）取代，而不必人源的FKBP12看帕霉素結(jié)合 蛋白激酶（FRAP）。FRB-FKBP12的異源二聚體可以被雷帕霉素（比FKCsA更有效）高效誘導(dǎo)，從而形成有功能的完整轉(zhuǎn)錄因子 ，最終啟 動(dòng)轉(zhuǎn)錄。這一系統(tǒng)在體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中布景表達(dá)都比較低，而在雷帕霉素的刺激

29、下有高水平的表達(dá)。雷帕霉素可以與FRAPa酶2合， 而FRAP可以介導(dǎo)免疫抑制效應(yīng)，因此雷帕霉素有一定的增殖和免 疫抑制活性，這成為該系統(tǒng)應(yīng)用的一個(gè)潛在限制。這一問題通過選 用雷帕霉素的類似物得到了解決，此類似物與野生型FRAP激酶的結(jié)合能力較差，因此不會(huì)發(fā)生免疫抑制，在體外實(shí)驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)此類 似物也不抑制細(xì)胞的增殖。最近，利用雷帕霉素誘導(dǎo)的人源化系統(tǒng) （rapamycin-in-duciblehumanizedsystem,RIHS）,通過腺相關(guān)病毒（adeno-associatedvirus,AAV）轉(zhuǎn)染小鼠和非人靈長類動(dòng)物來表達(dá)鼠紅細(xì)胞生成素，實(shí)驗(yàn)標(biāo)明可以通過控制雷帕霉素的劑量調(diào)控體內(nèi) 轉(zhuǎn)基因的表達(dá)。4、RU486誘導(dǎo)系統(tǒng)這一系統(tǒng)采取截短的黃體酮受體的突變體，這種突變體不克不及和黃體酮或其他內(nèi)源類固醇激素結(jié)合，但卻能被黃體酮的拮抗劑RU486a活。這種突變的類固醇結(jié)合結(jié)構(gòu)域融合到酵母GAL4DN砧合結(jié)構(gòu)域和皰疹病毒 VP16