肝細(xì)胞癌組織中Skp2的表達(dá)及與p27kip1、PCNA蛋白表達(dá)的關(guān)系

1、肝細(xì)胞癌組織中Skp2的表達(dá)及與p27kip1、PCNA蛋白表達(dá)的關(guān)系【摘要】目的：討論Skp2的表達(dá)在肝細(xì)胞癌(H)發(fā)生開(kāi)展中的作用，及其與p27kip1(p27)和PNA的關(guān)系。方法：搜集76例H及癌旁組織，l0例肝血管瘤旁肝組織的臨床病理檔案資料，l0例H及癌旁肝新穎組織，采用免疫組織化學(xué)方法及免疫印跡技術(shù)檢測(cè)Skp2、p27及PNA蛋白在這些組織中的表達(dá)。結(jié)果：免疫印跡結(jié)果顯示：Skp2在H組織中的表達(dá)明顯高于對(duì)應(yīng)的癌旁肝組織。免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示H中Skp2的陽(yáng)性率24.08顯著高于癌旁組織和正常肝組織P0.001。Skp2的表達(dá)與肝癌組織分化程度，血清AFP值及轉(zhuǎn)移有關(guān)P0.05。

2、p27在正常肝組織和癌旁組織中的表達(dá)明顯高于H組織(P0.001)。H組織中PNA蛋白的表達(dá)明顯高于癌旁和正常組織P0.01。H組織中Skp2的表達(dá)與p27呈負(fù)相關(guān)(P0.001)；與PNA呈正相關(guān)(P0.01)。結(jié)論：Skp2在H組織中表達(dá)是上調(diào)的，可能是通過(guò)作用于細(xì)胞周期調(diào)控蛋白p27，加速了對(duì)p27泛素化依賴的蛋白降解，使其表達(dá)及代謝發(fā)生異常。導(dǎo)致細(xì)胞周期失控并促進(jìn)細(xì)胞異常增殖，從而參與了H的發(fā)生和開(kāi)展?！娟P(guān)鍵詞】肝細(xì)胞癌；免疫印跡法；免疫組織化學(xué)；增殖細(xì)胞核抗原；Skp2；P2Abstratbjetive:TinvestigatetheexpressinfSkp2anditsrelat

3、inshipithexpressinsfp27andPNAprtEinsinhuanhepatellulararina(H).ethds:IunhistheialstudyfrSkp2，p27,PNAasperfredn10asesfnativelivertissueadjaentthepatiheangiaandin76asesfhepatellulararinatissuesandadjaentnnturustissues.Freshspeiensfr10asesfHandtheadjaentlivertissueerealslletedfresternbltanalysis.Result

4、s:esternbltanalysisshedthatSkp2expressinsinHashigherthanthseinadjaentlivertissue.Iunhistheistryf76HsshedarkedinreaseinSkp2andPNAexpressinsbutntp27,inHparedithnnanertissues.Skp2expressininHrrelatedithhistlgialdifferentiatin,serualpha-fetalprtEInlevelsandetastasis(P0.05).InH,inverserrelatinasfundbetee

5、nSkp2andp27(P0.01)andapsitiverrelatinasfundbeteenSkp2andPNA(P0.01).nlusins:ExpressinfSkp2isup-regulatedsignifiantlyinHparedithadjaentlivertissueandnrallivertissues，andverexpressinfSkp2reduestheprteinlevelfp27thrughubiquitin-dependentdegradatinandausesdisruptinfellylentrlandenhaneentftheprliferativea

6、tivity,indiatingSkp2playesaniprtantrleinngenesisanddevelpentfH.KeyrdsHepatellulararina；Iunbltting；Iunhistheistry；Prliferatingellnulearantigen；Skp2；P27腫瘤既是一類基因疾病，也是一類細(xì)胞周期疾玻幾乎所有癌基因的功能效應(yīng)最終都要會(huì)聚到細(xì)胞周期機(jī)制上來(lái)。細(xì)胞S期激酶相關(guān)蛋白-2(S-phasekinase-assiatedprtein2，Skp2)是SF泛素連接酶復(fù)合體的特異底物識(shí)別亞單位F-bx蛋白家族的成員之一，能特異性地作用于磷酸化細(xì)胞周期負(fù)性調(diào)

7、控因子p27，使其通過(guò)泛素-蛋白酶體途徑降解，導(dǎo)致細(xì)胞周期調(diào)節(jié)失控。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，Skp2在多種腫瘤組織中表達(dá)均增高，而p27表達(dá)減少,從而推斷Skp2表達(dá)及功能的異常有可能經(jīng)由細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的泛素化依賴的蛋白水解途徑，參與了腫瘤的發(fā)生開(kāi)展14。肝癌是全球發(fā)病率最高的惡性腫瘤之一，其中約55發(fā)生在中國(guó)5，但有關(guān)Skp2及p27和PNA在肝癌組織中，尤其是新穎組織中的表達(dá)以及與肝癌生物學(xué)特征的相關(guān)性研究較少。我們用免疫印跡和免疫組化方法檢測(cè)H組織中Skp2、p27和PNA三種蛋白的表達(dá)，旨在討論三者的相關(guān)性及與臨床病理特征的聯(lián)絡(luò)。1材料與方法1.1組織標(biāo)本及病例搜集南通大學(xué)附屬醫(yī)院肝癌手術(shù)切

8、除的10對(duì)新穎H組織及對(duì)應(yīng)的癌旁肝組織，用于提取蛋白。搜集南通大學(xué)附屬醫(yī)院及市醫(yī)院有病理資料76例H石蠟標(biāo)本用于免疫組化及臨床病理統(tǒng)計(jì)。其中H采用H的最新組織學(xué)分級(jí)和臨床分期標(biāo)準(zhǔn)6。另搜集南通大學(xué)附屬醫(yī)院10例肝血管瘤旁正常肝組織做對(duì)照。1.2主要試劑兔抗人p27kip1多克隆抗體p27：s-528，兔抗人Skp2p45：s-7164santaruz公司。鼠抗人p27kip1單抗Nearkers公司。鼠抗人PNA單抗、檸檬酸抗原修復(fù)液及DAB顯色劑北京中山生物技術(shù)。鼠抗人Skp2zyed公司，HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG、HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG、-atin單抗Siga公司。二步法免疫組化檢

9、測(cè)試劑盒GBI公司。1.3方法1.3.1蛋白質(zhì)免疫印跡檢測(cè)選擇其中6對(duì)H組織及癌旁組織，勻漿提取組織蛋白。全自動(dòng)蛋白質(zhì)核酸定量?jī)x測(cè)定蛋白含量，10%SDS凝膠電泳別離蛋白，蛋白上樣量40g，轉(zhuǎn)移槽轉(zhuǎn)移到PVDF膜。室溫封閉2h。一抗p27kip1(-19)1500,Skp2(H-435)1500，PNA11000,-atin130004過(guò)液，HRP偶聯(lián)的二抗(11000)室溫2h，EL顯色。1.3.2免疫組化染色和斷定標(biāo)準(zhǔn)操作步驟按免疫組化試劑盒說(shuō)明進(jìn)展。用的乳腺癌陽(yáng)性片作為陽(yáng)性對(duì)照，PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。DAB顯色，蘇木素復(fù)染，明膠甘油封片。光鏡下每張切片選取5個(gè)有代表性的高倍視野40

10、0，每個(gè)視野隨機(jī)計(jì)數(shù)500個(gè)腫瘤細(xì)胞，計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞百分率。每個(gè)指標(biāo)的染色結(jié)果以其標(biāo)記指數(shù)(Labelindex，LI)表示，LI陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞計(jì)數(shù)的總數(shù)。1.3.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法顯著性差異采用秩變換檢驗(yàn)、方差分析，相關(guān)性分析采用2檢驗(yàn)、Fisher準(zhǔn)確概率法及Spearan等級(jí)相關(guān)分析，全部數(shù)據(jù)采用Stata7.0統(tǒng)計(jì)分析系統(tǒng)，P0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2結(jié)果2.1esternblt檢測(cè)Skp2、p27及PNA在肝癌及癌旁組織中的表達(dá)免疫印跡結(jié)果顯示：Skp2及PNA在H中的表達(dá)均明顯高于對(duì)應(yīng)癌旁肝組織圖1。6對(duì)H組織及對(duì)應(yīng)癌旁組織中除第2對(duì)外，H組織中p27的表達(dá)低于癌旁組織圖1。2.2免疫組化

11、檢測(cè)Skp2、p27及PNA在肝癌及癌旁和血管瘤旁肝組織中的表達(dá)免疫組化結(jié)果顯示：Skp2，PNA在H中高表達(dá)，主要表達(dá)在細(xì)胞核。H中Skp2LI為24.07，PNALI為42.31；癌旁組織和肝血管瘤旁正常肝組織中Skp2LI分別2.87和1.81，PNALI為3.11和2.01。p27的表達(dá)與Skp2和PNA相反，主要在癌旁組織和正常肝組織中高表達(dá)，主要表達(dá)在胞核；其中有6例p27在H中高表達(dá)，且胞漿和胞核都有表達(dá)。H、癌旁和肝血管瘤旁正常肝組織中p27LI分別為26.50、76.20和73.58(圖2,表1。Skp2、p27、PNA在H中的表達(dá)與癌旁組織和血管瘤旁肝組織相比有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)

12、意義P0.01表1。2.3Skp2、p27及PNA蛋白的表達(dá)與H臨床病理特征的關(guān)系以Skp2、p27及PNA在H中LI的平均值分別為0.24，0.26，0.42為界，將其分為高表達(dá)組和低表達(dá)組，分析Skp2、p27及PNA的表達(dá)與臨床病理特征之間的關(guān)系。Skp2的表達(dá)強(qiáng)度與患者血清AFP程度、腫瘤病理分級(jí)以及轉(zhuǎn)移相關(guān)，P值分別為0.026，0.029，0.002，與患者的性別、年齡、腫瘤直徑、血清HBsAg及是否伴有壞死和肝硬化無(wú)關(guān)。p27與PNA在H中的表達(dá)均與AFP程度、腫瘤病理分級(jí)、轉(zhuǎn)移和壞死有關(guān)，P值分別為0.029，0.000，0.001，0.003和0.016，0.001，0.00

13、1，0.005，與其它病理學(xué)特征無(wú)關(guān)表2。2.4p27、Skp2及PNA表達(dá)的相關(guān)性通過(guò)對(duì)H中Skp2、PNA和p27蛋白表達(dá)的相關(guān)性分析，我們發(fā)現(xiàn)Skp2蛋白與p27蛋白的表達(dá)呈明顯負(fù)相關(guān)(r=-0.618，P0.01)，Skp2蛋白和PNA蛋白的表達(dá)呈正相關(guān)(r=0619，P001)。p27蛋白和PNA蛋白的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r-0.765，P0.01)轉(zhuǎn)貼于論文聯(lián)盟.ll.3討論細(xì)胞周期調(diào)控機(jī)制的紊亂，特別是G1-S期轉(zhuǎn)變過(guò)程中調(diào)節(jié)失控，是細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化的重要分子事件之一。Skp2作為SF復(fù)合體的底物識(shí)別亞基，能特異性識(shí)別磷酸化的底物并介導(dǎo)其泛素化降解，許多細(xì)胞周期調(diào)控因子都是泛素蛋白酶體

14、途徑的底物7，其中p27是SFSkp2泛素化和隨后蛋白降解的主要靶分子之一。研究發(fā)現(xiàn)，在人類一些惡性腫瘤如胃癌、腎細(xì)胞癌、皮膚鱗癌35中Skp2表達(dá)顯著增加，因此Skp2在惡性腫瘤中的表達(dá)增高及其生物學(xué)行為使之有可能成為腫瘤治療的靶點(diǎn)。有關(guān)Skp2在H中,尤其是肝癌新穎組織中表達(dá)的研究尚不多。在我們的研究中，免疫印跡結(jié)果顯示Skp2在H組織中的表達(dá)明顯高于對(duì)應(yīng)的癌旁肝組織，免疫組織化學(xué)結(jié)果也顯示Skp2在H中表達(dá)顯著高于癌旁肝組織及血管瘤旁肝組織。我們還比擬Skp2在H中的表達(dá)強(qiáng)度與患者的臨床病理因素的關(guān)系，結(jié)果說(shuō)明：Skp2的表達(dá)強(qiáng)度與患者血清AFP程度、腫瘤病理分級(jí)以及是否有轉(zhuǎn)移之間差異有

15、統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。這一系列結(jié)果提示Skp2可能在H的發(fā)生開(kāi)展過(guò)程中發(fā)揮重要的作用。p27是公認(rèn)的細(xì)胞周期負(fù)性調(diào)節(jié)蛋白，對(duì)G1-S期轉(zhuǎn)換具有顯著的抑制作用。p27的降解異?？蓪?dǎo)致細(xì)胞周期紊亂、惡性增殖。我們的研究發(fā)現(xiàn)，作為Skp2依賴性泛素蛋白酶體途徑降解的主要底物蛋白，p27和Skp2之間呈負(fù)相關(guān)，說(shuō)明p27在H組織中表達(dá)降低與Skp2過(guò)表達(dá)有關(guān)，同時(shí)兩者的表達(dá)異常與H的生物學(xué)特性相關(guān)，提示Skp2是通過(guò)泛素蛋白酶體途徑影響細(xì)胞周期蛋白p27的表達(dá)及代謝，導(dǎo)致細(xì)胞周期失控，促進(jìn)腫瘤發(fā)生和開(kāi)展。然而，我們研究的76例H中有6例(7.9,均為中低分化H)Skp2與p27蛋白均為高表達(dá)，并且

16、在這6例中p27在胞漿胞核均有陽(yáng)性信號(hào)表達(dá)，說(shuō)明除了Skp2介導(dǎo)p27的泛素化降解外，還有其他機(jī)制可能也參與了p27表達(dá)的調(diào)控，可能與p27的胞漿定位及其出核轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)812。PNA為增殖細(xì)胞核抗原，是G1/S期DNA復(fù)制的根本因子DNA聚合酶輔助蛋白，多用于檢測(cè)腫瘤細(xì)胞增殖活性，并已在臨床病理中應(yīng)用。但它在H中的表達(dá)是否與分化程度相關(guān)有不同的報(bào)道13,14。我們的研究發(fā)現(xiàn)，Skp2的表達(dá)與PNA之間呈正相關(guān)，說(shuō)明Skp2表達(dá)異?？赡芘c細(xì)胞的異常增殖有關(guān)，兩者協(xié)同參與了H的發(fā)生開(kāi)展。綜上所述，Skp2在肝癌組織中表達(dá)是上調(diào)的，可能通過(guò)特異性的作用于磷酸化的p27，加速了對(duì)p27泛素化依賴的蛋白降

17、解，使其表達(dá)及代謝發(fā)生異常，導(dǎo)致細(xì)胞周期失控并促進(jìn)細(xì)胞異常增殖，從而參與了H的發(fā)生和開(kāi)展。進(jìn)一步研究泛素蛋白酶體通路的調(diào)控紊亂可為臨床肝癌的診治提供新的思路?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】1TsvetkvL,YehKH,LeeSJ,etal.P27(Kip1)ubiquitinatinanddegradatinisregulatedbytheSF(Skp2)plexthrughphsphrylatedThr187inp27J.urrBil,1999,9(12):661-664.2asudaTA,InueH,SndaH,eta1.linia1andbilgialsignifianefs-phasekinase-a

18、ssiatedprtEin2(skp2)geneexpressiningastriarina:dulatinfalignantphentypebyskp2verexpressinpssibleviap27prtelysisJ.anerRes,2002,62(13):3819-3825.3Langner,VnR,Ratshek,eta1.Bilgialsignifianefp27andSkp2expressininrenalellarina.AsysteatianalysisfpriaryandetastatituurtissuesusingatissueirarraytehniqueJVirh

19、sArh,2022,445(6):631-636.4FernandezT,PuigL,usulenE,eta1.Prgnstisignifianefp27kip1,p45Skp2andKi67expressinprfilesinerkelellarina,extrautaneussallellarina,andutaneussquausellarinaJ.Histpathlgy,2022,46(6):614-621.5ParkinD,BrayF,FerlayJ,eta1.Glbalanerstatistis,2002J.AanerJlin,2022,55(2):74-108.6arrerJA,

20、FntanaRJ,BarratA,eta1.Prgnsisfhepatellulararina:parisnf7stagingsystesinanAerianhrtJ.Hepatlgy,2022,41(4):707-7167GanthD,BrnstEInG,KTK,etal.Theell-yleregulatryprteinKs1isrequiredfrSF(Skp2)-ediatedubiquitinylatinfp27J.NatellBil,2001,3(3):321-324.8BndarT,KalininaA,KhairL,etal.ul4AandDDB1assiateithSkp2ttargetp27Kip1frprtelysisinvlvingtheP9signalseJ.lellBil,2022,26(7):2531-2539.9AlkarainA,SlingerlandJ.Deregulatinfp27byngenisignalinganditsprgnstisignifianeinbreastanerJ.BreastanerRes,2022,6(1):13-21.10YuJ，ZhangHY，aZZ，eta1ethyl