與氮素同化相關(guān)酶以及測(cè)定方法

1、關(guān)于與氮素同化相關(guān)酶及測(cè)定方法第1頁，共29頁，2022年，5月20日，15點(diǎn)36分，星期四自 然 界 中 N 素 循 環(huán) 第2頁，共29頁，2022年，5月20日，15點(diǎn)36分，星期四一、植物體內(nèi)氮的含量與分布 含量：占植物干重的0.35。植物種類：豆科植物非豆科植物品種：高產(chǎn)品種低產(chǎn)品種器官：種子葉根莖稈第3頁，共29頁，2022年，5月20日，15點(diǎn)36分，星期四二、氮的生理功能氮是蛋白質(zhì)的重要成分（蛋白質(zhì)含氮1618）2. 氮是核酸和核蛋白的成分（核酸中的氮約占植株全氮的7）3. 氮是酶的成分4.氮是葉綠素（葉綠素a:C55H72O5N4Mg)的成分（葉綠體含蛋白質(zhì)4560）第4頁，共

2、29頁，2022年，5月20日，15點(diǎn)36分，星期四5. 氮是多種維生素的成分:如維生素B1 (C12H17ON3S)、B2 (C17H18O6N4 )、B6(C6H11O3N) 6. 氮是一些植物激素的成分（如IAA、CTK）7. 氮也是生物堿的組分（如煙堿、茶堿、可可堿、咖啡堿、膽堿卵磷脂(磷脂酰膽堿）氮素通常被稱為生命元素第5頁，共29頁，2022年，5月20日，15點(diǎn)36分，星期四三、植物對(duì)氮的吸收(adsorption)與同化 (assimilation)吸收的形態(tài)無機(jī)態(tài)： NO3-N、NH4+N （主要）有機(jī)態(tài)：NH2 N、氨基酸、 核酸等（少量） 植物從外界環(huán)境獲得N主要是通過

3、3條途徑, 通過NO3- 還原把無機(jī)氮轉(zhuǎn)化為生命體可用的有機(jī)氮, 通過固氮菌對(duì) N2的固定, 直接吸收土壤中的銨或有機(jī)氮。 植物的氮源主要是銨鹽和硝酸鹽，占土壤含氮的1%-2%。第6頁，共29頁，2022年，5月20日，15點(diǎn)36分，星期四（一）植物對(duì)硝態(tài)氮的吸收與同化1. 吸收：旱地作物吸收NO3-N為主，主動(dòng)吸收第7頁，共29頁，2022年，5月20日，15點(diǎn)36分，星期四2. 同化(1) NO3-N的還原作用(nitrate reduction)過程：NO3- NO2- NH3NR：硝酸還原酶(nitrate reductase)NiR：亞硝酸還原酶(nitrite reductase)

4、 NR，Mo NiR，F(xiàn)e、Mn 根、葉細(xì)胞質(zhì) 根、葉綠體 第8頁，共29頁，2022年，5月20日，15點(diǎn)36分，星期四氨的同化 植物吸收銨鹽以后，或當(dāng)植物所吸收的硝酸鹽被還原成氨后，氨必須立即被同化成氨基酸，否則就會(huì)毒害植物。因?yàn)榘笨赡芤种坪粑^程中的電子傳遞系統(tǒng)。 氨的同化方式為：進(jìn)入谷氨酸合成酶循環(huán)。 作用酶類： GOGAT:谷氨酸合成酶；存在于葉綠體。 GS:谷氨酰胺合成酶；存在于葉綠體和細(xì)胞質(zhì)中。 GDH:谷氨酸脫氫酶；存在于線粒體中。第9頁，共29頁，2022年，5月20日，15點(diǎn)36分，星期四過程（1）GDH（谷氨酸脫氫酶）途徑酮戊二酸氨谷氨酸各種新的氨基酸酮酸酰胺氨谷氨酸脫氫

5、酶轉(zhuǎn)氨基作用第10頁，共29頁，2022年，5月20日，15點(diǎn)36分，星期四（2）GS-GOGAT途徑（谷氨酰胺合成酶谷氨酸合成酶）是高等植物同化氨的主要途徑第11頁，共29頁，2022年，5月20日，15點(diǎn)36分，星期四谷氨酰胺合成酶COOHCHNH2CH2CH2CONH2COOHCHNH2CH2CH2COOH谷氨酸合成酶2H+，2eCOOHC=OCH2CH2COOHCOOHCHNH2CH2CH2COOH谷氨酸脫氫酶NH4+吸收NO3還原N2固定光呼吸NH3NH3NADH谷氨酰胺谷氨酸谷氨酸圖1 氨的同化途徑的模式ATPNADH鐵氧還蛋白 轉(zhuǎn)氨基作用含氮化合物第12頁，共29頁，2022年，

6、5月20日，15點(diǎn)36分，星期四反應(yīng)式：NH3谷氨酸ATP 谷氨酰胺ADPPi谷氨酰胺-酮戊二酸2e2H 2谷氨酸谷氨酸17酮酸 17種氨基酸 蛋白質(zhì) 谷氨酰胺合成酶谷氨酸合成酶轉(zhuǎn)氨酶 合成 第13頁，共29頁，2022年，5月20日，15點(diǎn)36分，星期四轉(zhuǎn)氨基作用（transamination） （1）定義：是指一種-氨基酸和-酮酸在轉(zhuǎn)氨酶的作用下生成相應(yīng)的-酮酸和新的氨基酸的過程。（2）生物體內(nèi)兩種重要的轉(zhuǎn)氨基作用谷丙轉(zhuǎn)氨基作用谷草轉(zhuǎn)氨基作用第14頁，共29頁，2022年，5月20日，15點(diǎn)36分，星期四谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ GPT）磷酸吡哆醛+谷丙轉(zhuǎn)氨基作用谷草轉(zhuǎn)氨基作用+谷草轉(zhuǎn)氨酶（ GOT）

7、磷酸吡哆醛+第15頁，共29頁，2022年，5月20日，15點(diǎn)36分，星期四3. 酰胺(amide)的形成及意義形成：NH3意義：貯存氨基； 解除氨毒； 參與代謝。 谷氨酸(Glu) 酰胺合成酶 谷氨酰胺(Gln) 天門冬氨酸(Asp) ATP 天門冬酰胺(Asn) 銨態(tài)氮配方第16頁，共29頁，2022年，5月20日，15點(diǎn)36分，星期四非脲酶途徑：直接同化尿素 氨甲酰磷酸 瓜氨酸 精氨酸（二）植物對(duì)有機(jī)氮的吸收與同化1. 尿素 urea（酰胺態(tài)氮 amide nitrogen） (1) 吸收：根、葉均能直接吸收(2) 同化：脲酶途徑：尿素 NH3 氨基酸 脲酶水解尿素的毒害：當(dāng)介質(zhì)中尿素濃

8、度過高時(shí)，植物會(huì)出現(xiàn)受害癥狀第17頁，共29頁，2022年，5月20日，15點(diǎn)36分，星期四2. 氨基態(tài)氮(amino nitrogen)可直接吸收，效果因種類而異第一類 效果 硫酸銨：如甘氨酸、天門冬酰胺等第二類，尿素 AA效果 硫酸銨：如天門冬氨酸等第三類，效果 尿素：如脯氨酸、纈氨酸等第四類，有抑制作用：如蛋氨酸第18頁，共29頁，2022年，5月20日，15點(diǎn)36分，星期四植物轉(zhuǎn)氨酶(GOT和GPT)活度比色測(cè)定方法及其應(yīng)及GOGAT酶活性的測(cè)定主要試劑(1)0.05mol/L Tris-HCL緩沖液(pH7.2):0.2mol/L三羥甲基氨基甲烷(24.2g三羥甲基氨基甲烷用蒸餾水溶

9、解并定容至200ml)50ml和0.2mol/L HCl44.2ml,用蒸餾水稀釋至200ml。(2)0.1mol/L磷酸鹽緩沖液:稱取磷酸氫二鈉 (AR)11.928g,磷酸二氫鉀(AR)2.176g,加少量蒸餾水溶解并定容至1000ml。(3)2,4-二硝基苯肼溶液:稱取2,4-二硝基苯肼19.8mg,用10mol/L HCL10ml溶解后,加蒸餾水至100ml,保存于棕色瓶中備用,此液可保存3個(gè)月。(4)0.4mol/L氫氧化鈉溶液:16g氫氧化鈉(AR)加蒸餾水溶解并定容至1000ml。第19頁，共29頁，2022年，5月20日，15點(diǎn)36分，星期四(5)1mol/L氫氧化鈉溶液:40

10、g氫氧化鈉(AR)加蒸餾水溶解并定容至1000ml。(6)丙酮酸標(biāo)準(zhǔn)液(2mol/ml):精確稱取純丙酮酸鈉22.0mg于100ml容量瓶中,加0.1mol/L磷酸鹽緩沖液至刻度。此液應(yīng)新鮮配制。(7)GOT底物液(DL-門冬氨酸200mmol/L,-酮戊二酸2mmol/L):稱取-酮戊二酸29.2mg和DL-門冬氨酸2.66g置于一小燒杯中,加入1mol/L氫氧化鈉20.5ml使溶解,并校正pH至7.4,然后將溶液移入100ml容量瓶?jī)?nèi),用0.1mol/L磷酸鹽緩沖液定容至刻度。放置冰箱內(nèi)保存。(8)GPT底物液:(DL-丙氨酸200mmol/L,-酮戊二酸2mmol/L):稱取-酮戊二酸2

11、9.2mg和DL-丙氨酸1.79g置于一小燒杯中,加入0.1mol/L磷酸鹽緩沖液(pH7.4)約80ml煮沸溶解后,待冷,用1mol/L氫氧化鈉調(diào)pH至7.4(約加0.5ml),再加0.1mol/L磷酸鹽緩沖液至100ml混勻,加氯仿數(shù)滴防腐,貯于冰箱內(nèi)。第20頁，共29頁，2022年，5月20日，15點(diǎn)36分，星期四1酶粗制劑的提取將新鮮植物材料剪碎,取鮮重0.2g左右放入研缽,加0.05mol/LTris-HCl緩沖液(pH7.2)2.0ml,在冰浴中研磨,得到的勻漿用高速離心機(jī)20000g離心20min,上清液供測(cè)酶活度用。2谷草轉(zhuǎn)氨酶(GOT)活度測(cè)定取10ml試管2支,一支作測(cè)定管

12、,分別加酶粗制劑0.1ml和GOT底物液0.5ml,另一支作對(duì)照管,僅加酶粗制劑0.1ml。將二管同時(shí)置37水浴,60min后取出,各管加2,4二硝基苯肼液0.5ml終止反應(yīng),對(duì)照管再加GOT底物液0.5ml。將二管再置37水浴中20min,取出后各管加0.4mol/L NaOH 5.0ml,混勻,10min后用分光光度計(jì)比色,波長(zhǎng)500nm,蒸餾水調(diào)零點(diǎn),讀取吸光度。將測(cè)定管吸光度減去對(duì)照管吸光度,得吸光度差值,查工作曲線即可查得丙酮酸體積(ml)。若查得的丙酮酸體積超過0.2ml時(shí)應(yīng)將酶粗制液稀釋后再進(jìn)行測(cè)定,測(cè)定結(jié)果乘以稀釋倍數(shù)即得丙酮酸體積V(ml)。第21頁，共29頁，2022年，5

13、月20日，15點(diǎn)36分，星期四工作曲線繪制:取10ml試管5支,各管加0.1mol/L磷酸鹽緩沖液0.1ml,分別加GOT底物液0.5、0.45、0.40、0.35、0.30ml,丙酮酸標(biāo)準(zhǔn)液0(對(duì)照管)、0.05、0.10、0.15、0.20ml。置37水浴5min,各管加2,4-二硝基苯肼溶液0.5ml,混勻,再置37水浴中20min,取出后各管加0.4mol/L氫氧化鈉溶液5ml,混勻,10min后同上比色,讀取各管吸光度。各管吸光度分別減去對(duì)照管吸光度,以各管丙酮酸體積為橫座標(biāo),以相應(yīng)的吸光度差值為縱座標(biāo)繪制工作曲線。3谷丙轉(zhuǎn)氨酶(GPT)活度測(cè)定取10ml試管2支,一支作測(cè)定管,分別

14、加酶粗制劑0.1ml和GPT底物液0.5ml,另一支作對(duì)照管,僅加酶粗制劑0.1ml。將二管同時(shí)置37水浴,30min后取出,各管加2,4-二硝基苯肼液0.5ml終止反應(yīng),對(duì)照管再加GPT底物液0.5ml。將二管再置37水浴中20min,取出后各管加0.4mol/L NaOH 5.0ml,混勻,10min后用分光光度計(jì)比色,波長(zhǎng)500nm,蒸餾水調(diào)零點(diǎn),讀取吸光度。將測(cè)定管吸光度減去對(duì)照管吸光度,得吸光度差值,查第22頁，共29頁，2022年，5月20日，15點(diǎn)36分，星期四工作曲線即可查得丙酮酸體積(ml),若查得的丙酮酸體積超過0.2ml時(shí)應(yīng)將酶粗制液稀釋后再進(jìn)行測(cè)定,測(cè)定結(jié)果乘以稀釋倍數(shù)

15、即得丙酮酸體積V(ml)。工作曲線繪制:取10ml試管6支,各管加0.1mol/L磷酸鹽緩沖液0.1ml,分別加GPT底物液0.5、0.45、0.40、0.35、0.30、0.25ml,丙酮酸標(biāo)準(zhǔn)液0(對(duì)照管)、0.05、0.10、0.15、0.20、0.25ml。置37水浴中5min,各管加2,4-二硝基苯肼溶液0.5ml,混勻,再置37水浴中20min,取出后各管加0.4mol/L氫氧化鈉溶液5ml,混勻,10min后同上比色,讀取各管吸光度。各管吸光度分別減去對(duì)照管吸光度,以各管丙酮酸體積為橫座標(biāo),以相應(yīng)的吸光度差值為縱座標(biāo)繪制工作曲線。(四)結(jié)果計(jì)算轉(zhuǎn)氨酶活度以每克植物鮮樣在30min

16、內(nèi)反應(yīng)生成的丙酮酸微摩爾(mol)表示。GOT活度,mol/g30min=(CV20)/(m2)GPT活度,mol/g30min=(CV20)/(m2)式中,C丙酮酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度(mol/ml);V由工作曲線查得的丙酮酸體積(ml);20稀釋倍數(shù);2反應(yīng)時(shí)間換算系數(shù),GOT實(shí)際反應(yīng)時(shí)間為1h,按習(xí)慣本法酶活性以30min計(jì)算4,故應(yīng)除以2;m植物鮮重(g) 第23頁，共29頁，2022年，5月20日，15點(diǎn)36分，星期四粗酶液制備取1g水稻根/葉，置于冰浴的研缽中，加入少量石英砂和3ml提取緩沖液（100mmol/L Tris-HCl(pH7.6)含1.0mmol/L EDTA，1.0mmo

17、l/LMgCl26H2O，10mmol/L -琉基乙醇）于4研磨成勻漿?；旌暇鶆蚝笥诟咚倮鋬鲭x心機(jī)4、20,000g離心20min（13，000g 30min），收集上清，即為粗酶提取液，置于-80冰箱中凍存，待測(cè)。粗酶液用于Gs、NADH-GOGATH的活力測(cè)定。第24頁，共29頁，2022年，5月20日，15點(diǎn)36分，星期四提取液配置：（Tris，121.14；EDTA，372.24；MgCl26H2O，203.3；-琉基乙醇原液14.4mol/L）1L提取液的配置：12.114g Tris+0.3722g EDTA+0.2033g MgCl26H2O用900ml水溶解，+0.7ml-琉基

18、乙醇原液后，用1mmol/L HCl調(diào)pH值至7.6，然后定容至1L。500ml提取液的配置：6.057g Tris+0.1861g EDTA+0.1016g MgCl26H2O用450ml水溶解，+0.35ml -琉基乙醇原液后，用1mmol/L HCl（原液稀釋12000倍,83ul定容至100ml）調(diào)pH值至7.6，然后定容至500ml。第25頁，共29頁，2022年，5月20日，15點(diǎn)36分，星期四GS測(cè)定：（1）合成酶活性反應(yīng)液配制：(50mmol/L咪唑-HCl(pH7.2)含40mmol/LMgSO4,90mmol/L L-谷氨酸, 6 mmol/L羥胺)(咪唑，68.077；無

19、水氯化鎂，120；L-谷氨酸，147.13；羥胺，33.03)500ml反應(yīng)液：1.702g咪唑+2.4g MgSO4+6.621g L-谷氨酸+0.099g羥胺用450ml蒸餾水溶解，再用1mM HCl調(diào)節(jié)pH至7.2，定容至500mL250ml反應(yīng)液：0.851g咪唑+1.2g MgSO4+3.311g L-谷氨酸+0.050g羥胺用200ml蒸餾水溶解，再用1mM HCl調(diào)節(jié)pH至7.2，定容至250mL（2）10 mmol/L ATP-Na(3個(gè)水，606.24): 0.0666g 定容至11ml（3）酸性FeC13終止液（2% (WV/) TCA+3.5% (WV/) FeC136H

20、2O+2%HCl）配制: 2g TCA+3.5g FeC136H2O+ 5.333ml HCl原液（分析純濃鹽酸一般為37.5%，摩爾濃度近似為12mol/L），用蒸餾水溶解后，定容至100ml.（4）測(cè)定（1個(gè)處理，3個(gè)管（1個(gè)對(duì)照，兩個(gè)重復(fù)）反應(yīng)總體積2ml：1.9ml(1ml活性反應(yīng)液+0.8ml蒸餾水+0.1ml粗酶液)混合液在37預(yù)熱2-3min后加入0.1ml 10 mmol/L ATP啟動(dòng)反應(yīng)?；旌暇鶆蚝?，37室溫保溫15min后，立刻加入1ml FeC13終止液終止反應(yīng)，然后3000g離心5min，上清液于540nm處測(cè)定吸光值?？瞻讓?duì)照：按順序加入1ml活性反應(yīng)液+0.8ml

21、蒸餾水+0.1ml 10 mmol/L ATP+1ml FeC13終止液+0.1ml粗酶液，然后3000g離心5min，上清液于540nm處測(cè)定吸光值。（5）一個(gè)GS活性單位定義為每分鐘于37產(chǎn)生1umol的r谷氨酰異羥肟酸一glutamyl hydroxmate)所需的酶量。（6）標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：以r谷氨酰異羥肟酸做標(biāo)準(zhǔn)曲線取1ml反應(yīng)液，37預(yù)保溫，5min后分別加入0，0.5，1.0，1.5，2.0，3，4，5，6，7mM的谷氨?；惲u肟酸1ml，混合均勻后，37室溫保溫15min后，立刻加入1ml FeC13終止液終止反應(yīng)，搖勻后在540nm波長(zhǎng)下比色，以蒸餾水作對(duì)照，做標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)

22、標(biāo)準(zhǔn)曲線得出谷氨?；惲u肟酸計(jì)算公式：=7.9*OD540-0.162 第26頁，共29頁，2022年，5月20日，15點(diǎn)36分，星期四NADH-GOGAT活性的測(cè)定NADH-GOGAT活性測(cè)定按singh(1986)報(bào)道的方法進(jìn)行。測(cè)活貯備液:A:20mmol/L谷氨酰胺(146.15) 0.2923g定容至100mlB:100mmol/L a-酮戊二酸(146.11) 1.4611g定容至100mlC:10 mmol/L KCl(74.551) 0.0745g定容至100mlD:25mmol/L Tris-HCl緩沖液(pH7.6) 1.514g 定容至500mlE:3mmol/L NAD

23、H(新鮮配制) (709.4) 0.017g 定容至8ml空白對(duì)照為0.4mL(A)+0.05mL(B)+0.lmL(C)+2.45mL(D)。測(cè)活管:0.05mLB+0.lmL C+ 1.95mLD (測(cè)定前可以按照10:20:390比例混勻后，取混合液2.1ml)30水浴中預(yù)熱幾分鐘后,按順序加入0.2mLE和0.3mL酶液,再加入0.4mL A,混勻,立即啟動(dòng)反應(yīng)，紫外分光光度計(jì)在340nm處測(cè)光吸收,倒回試管,30水浴,三分鐘后再測(cè)一次光吸收,計(jì)算差值。NADH-GOGAT酶活性單位定義為:每分鐘反應(yīng)混合液于30減少1umol NADH為一個(gè)酶活性單位。第27頁，共29頁，2022年，5月20日，15點(diǎn)36分，星期四NADH-GDH活性的測(cè)定:NADH-GDH(還原型GDH)和NAD+-GDH (氧化型GDH)的活性測(cè)定,參照Loulkakais等(1990)的方法。NADH-GDH測(cè)活貯備液:6.9898g Tris+1.6876g