藥典三部2022版通則1101微生物檢查法

1、本文格式為Word版，下載可任意編輯 藥典三部2022版通則1101微生物檢查法 1101 無菌檢查法 無菌檢查法系用于檢查藥典要求無菌的藥品、生物制品、醫(yī)療器具、原料、輔料及其他品種是否無菌的一種方法。若供試品符合無菌檢查法的規(guī)定，僅說明了供試品在該檢驗(yàn)條件下未發(fā)現(xiàn)微生物污染。 無菌檢查應(yīng)在無菌條件下進(jìn)行，試驗(yàn)環(huán)境務(wù)必達(dá)到無菌檢查的要求，檢驗(yàn)全過程應(yīng)嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作，防止微生物污染，防止污染的措施不得影響供試品中微生物的檢出。單向流空氣區(qū)、工作臺(tái)面及環(huán)境應(yīng)定期按醫(yī)藥工業(yè)清白室（區(qū)）懸浮粒子、浮游菌和沉降菌的測(cè)試方法的現(xiàn)行國家標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行清白度確認(rèn)。隔離系統(tǒng)應(yīng)定期按相關(guān)的要求進(jìn)行驗(yàn)證，其內(nèi)部環(huán)境的

2、清白度須符合無菌檢查的要求。日常檢驗(yàn)還需對(duì)試驗(yàn)環(huán)境進(jìn)行監(jiān)控。 培養(yǎng)基 硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基主要用于厭氧菌的培養(yǎng)，也可用于需氧菌培養(yǎng)；胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基用于真菌和需氧菌的培養(yǎng)。 培養(yǎng)基的制備及培養(yǎng)條件 培養(yǎng)基可按以下處方制備，亦可使用按該處方生產(chǎn)的符合規(guī)定的脫水培養(yǎng)基或成品培養(yǎng)基。配制后應(yīng)采用驗(yàn)證合格的滅菌程序滅菌。制備好的培養(yǎng)基應(yīng)保存在225、避光的環(huán)境，若保存于非封閉容器中，一般在3周內(nèi)使用；若保存于密閉容器中，一般可在一年內(nèi)使用。 1. 硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基 胰酪胨15.0g 氯化鈉 2.5g 酵母浸出粉 5.0g 新配制的0.1% 刃天青溶液 1 / 14 1.0ml 無水葡萄糖 5.

3、0g 瓊脂 0.75g L-胱氨酸0.5g 水 1000ml 硫乙醇酸鈉0.5g （或硫乙醇酸）(0.3ml) 除葡萄糖和刃天青溶液外，取上述成分混合，微溫溶解，調(diào)理pH為弱堿性，煮沸，濾清，參與葡萄糖和刃天青溶液，搖勻，調(diào)理pH，使滅菌后在25的pH值為7.10.2。分裝至適合的容器中，其裝量與容器高度的比例應(yīng)符合培養(yǎng)終止后培養(yǎng)基氧化層（粉紅色）不超過培養(yǎng)基深度的1/2。滅菌。在供試品接種前，培養(yǎng)基氧化層的高度不得超過培養(yǎng)基深度的1/5，否則，須經(jīng)100水浴加熱至粉紅色消失（不超過20分鐘），迅速冷卻，只限加熱一次，并防止污染。 除另有規(guī)定外，硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基置3035培養(yǎng)。 2. 胰酪

4、大豆胨液體培養(yǎng)基 胰酪胨 17.0g 氯化鈉 5.0g 大豆木瓜蛋白酶水解物 3.0g 磷酸氫二鉀 2.5g 葡萄糖/無水葡萄糖2.5g/2.3g 水1000ml 除葡萄糖外，取上述成分，混合，微溫溶解，濾過，調(diào)理pH使滅菌后在25的pH值為7.30.2，參與葡萄糖，分裝，滅菌。 胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基置2025培養(yǎng)。 3. 中和或滅活用培養(yǎng)基 2 / 14 按上述硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基或胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基的處方及制法，在培養(yǎng)基滅菌或使用前參與適合的中和劑、滅活劑或表面活性劑，其用量同方法適用性試驗(yàn)。 4. 0.5%葡萄糖肉湯培養(yǎng)基（用于硫酸鏈霉素等抗生素的無菌檢查） 胨10.0g 氯化鈉5.0

5、g 牛肉浸出粉3.0g 水1000ml 葡萄糖 5.0g 除葡萄糖外，取上述成分混合，微溫溶解，調(diào)理pH為弱堿性，煮沸，參與葡萄糖溶解后，搖勻，濾清，調(diào)理pH使滅菌后在25的pH值為7.20.2，分裝，滅菌。 5. 胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基 胰酪胨15.0g 瓊脂15.0g 大豆木瓜蛋白酶水解物5.0g 水1000ml 氯化鈉 5.0g 除瓊脂外，取上述成分，混合，微溫溶解，調(diào)理pH使滅菌后在25的pH值為7.30.2，參與瓊脂，加熱溶化后，搖勻，分裝，滅菌。 6. 沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基 動(dòng)物組織胃蛋白酶水解物水 3 / 14 和胰酪胨等量混合物 10.0g 1000ml 葡萄糖 20.0g 除葡

6、萄糖外，取上述成分，混合，微溫溶解，調(diào)理pH使滅菌后在25的pH值為5.60.2，參與葡萄糖，搖勻，分裝，滅菌。 7. 沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基 動(dòng)物組織胃蛋白酶水解物和胰酪胨等量混合物10.0g 瓊脂15.0g 葡萄糖40.0g 水1000ml 除葡萄糖、瓊脂外，取上述成分，混合，微溫溶解，調(diào)理pH使滅菌后在25pH值為5.60.2，參與瓊脂，加熱溶化后，再參與葡萄糖，搖勻，分裝，滅菌。 培養(yǎng)基的適用性檢查 無菌檢查用的硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基和胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基等應(yīng)符合培養(yǎng)基的無菌性檢查及靈敏度檢查要求。本檢查可在供試品的無菌檢查前或與供試品的無菌檢查同時(shí)進(jìn)行。 無菌性檢查每批培養(yǎng)基隨機(jī)取不少于

7、5支（瓶），置各培養(yǎng)基規(guī)定的溫度培養(yǎng)14天，應(yīng)無菌生長。 靈敏度檢查 菌種培養(yǎng)基靈敏度檢查所用的菌株傳代次數(shù)不得超過5代（從菌種保存中心獲得的枯燥菌種為第0代），并采用適合的菌種保存技術(shù)進(jìn)行保存，以保證試驗(yàn)菌株的生物學(xué)特性。 金黃色葡萄球菌（Staphylococcus）CMCC（B）26 003 4 / 14 銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）CMCC（B）10 104枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）CMCC（B）63 501 生孢梭菌（Clostridium sporogenes）CMCC（F）64 941 白色念珠菌（Candida albic

8、ans）CMCC（F）98 001 黑曲霉（Aspergillus niger）CMCC（F）98 003 菌液制備接種金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌的新鮮培養(yǎng)物至胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中或胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基上，接種生孢梭菌的新鮮培養(yǎng)物至硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基中，3035培養(yǎng)1824小時(shí)；接種白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物至沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基中或沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上，2025培養(yǎng)2448小時(shí)，上述培養(yǎng)物用pH7.0 無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液或0.9% 無菌氯化鈉溶液制成每1ml含菌數(shù)小于100cfu（菌落形成單位）的菌懸液。接種黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物至沙氏葡萄糖瓊脂斜面培養(yǎng)基上，2025培養(yǎng)

9、57天，參與35ml含0.05% （ml/ml）聚山梨酯80的pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液或0.9%無菌氯化鈉溶液，將孢子洗脫。然后，采用適合的方法吸出孢子懸液至無菌試管中，用含0.05% （ml/ml）聚山梨酯80的pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液或0.9% 無菌氯化鈉溶液制成每1ml 含孢子數(shù)小于100cfu的孢子懸液。 菌懸液若在室溫下放置，應(yīng)在2小時(shí)內(nèi)使用；若保存在28可在24小時(shí)內(nèi)使用。黑曲霉孢子懸液可保存在28，在驗(yàn)證過的貯存期內(nèi)使用。 培養(yǎng)基接種取每管裝量為12ml 的硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基7支，分別接種小于100cfu的金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、生孢梭菌各2支，另1支

10、不接種作為空白對(duì)照，培養(yǎng)3天；取每管裝量為9ml的胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基7支，分別接種小于100cfu的枯草芽孢 5 / 14 桿菌、白色念珠菌、黑曲霉各2支，另1支不接種作為空白對(duì)照，培養(yǎng)5天。逐日觀測(cè)結(jié)果。 結(jié)果判定空白對(duì)照管應(yīng)無菌生長，若加菌的培養(yǎng)基管均生長良好，判該培養(yǎng)基的靈敏度檢查符合規(guī)定。 稀釋液、沖洗液及其制備方法 稀釋液、沖洗液配置后應(yīng)采用驗(yàn)證合格的滅菌程序滅菌。 1. 0.1%無菌蛋白胨水溶液取蛋白胨1.0g，加水1000ml，微溫溶解，濾清，調(diào)理pH至7.10.2，分裝，滅菌。 2. pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液取磷酸二氫鉀 3.56g，無水磷酸氫二鈉5.77g，氯化鈉

11、 4.30g，蛋白胨1.00g，加水1000ml，微溫溶解，濾清，分裝，滅菌。 根據(jù)供試品的特性，可選用其他閱歷證過的適合的溶液作為稀釋液、沖洗液（如0.9% 無菌氯化鈉溶液）。 如需要，可在上述稀釋液或沖洗液的滅菌前或滅菌后參與表面活性劑或中和劑等。 方法適用性試驗(yàn) 進(jìn)行產(chǎn)品無菌檢查時(shí)，應(yīng)進(jìn)行方法適用性試驗(yàn)，以確認(rèn)所采用的方法適合于該產(chǎn)品的無菌檢查。若檢驗(yàn)程序或產(chǎn)品發(fā)生變化可能影響檢驗(yàn)結(jié)果時(shí)，應(yīng)重新進(jìn)行方法適用性試驗(yàn)。 方法適用性試驗(yàn)按“供試品的無菌檢查的規(guī)定及以下要求進(jìn)行操作。對(duì)每一試驗(yàn)菌應(yīng)逐一進(jìn)行方法確認(rèn)。 菌種及菌液制備除大腸埃希菌（Escherichia coli）CMCC（B）44

12、 102外，金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、生孢梭菌、白色念珠 6 / 14 菌、黑曲霉的菌株及菌液制備同培養(yǎng)基靈敏度檢查。大腸埃希菌的菌液制備同金黃色葡萄球菌。 薄膜過濾法取每種培養(yǎng)基規(guī)定接種的供試品總量按薄膜過濾 法過濾，沖洗，在結(jié)果一次的沖洗液中參與小于100cfu的試驗(yàn)菌，過濾。加硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基或胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基至濾筒內(nèi)。另取一裝有同體積培養(yǎng)基的容器，參與等量試驗(yàn)菌，作為對(duì)照。置規(guī)定溫度培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間不得超過5天，各試驗(yàn)菌同法操作。 直接接種法取符合直接接種法培養(yǎng)基用量要求的硫乙醇酸鹽 流體培養(yǎng)基6管，分別接入小于100cfu的金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、生孢梭菌各2管，取符合

13、直接接種法培養(yǎng)基用量要求的胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基6管，分別接入小于100cfu的枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉各2管。其中1管接入每支培養(yǎng)基規(guī)定的供試品接種量，另1管作為對(duì)照，置規(guī)定的溫度培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間不得超過5天。 結(jié)果判定與對(duì)照管對(duì)比，如含供試品各容器中的試驗(yàn)菌均生長良好，則說明供試品的該檢驗(yàn)量在該檢驗(yàn)條件下無抑菌作用或其抑菌作用可以忽視不計(jì)，照此檢查方法和檢查條件進(jìn)行供試品的無菌檢查。如含供試品的任一容器中的試驗(yàn)菌生長微弱、緩慢或不生長，則說明供試品的該檢驗(yàn)量在該檢驗(yàn)條件下有抑菌作用，應(yīng)采用增加沖洗量、增加培養(yǎng)基的用量、使用中和劑或滅活劑、更換濾膜品種等方法，消除供試品的抑菌作用，并重新進(jìn)行方法適用性試驗(yàn)。 方法適用性試驗(yàn)也可與供試品的無菌檢查同時(shí)進(jìn)行。 供試品的無菌檢查 無菌檢查法包括薄膜過濾法和直接接種法。只要供試品性質(zhì)