DNARNA合成常見(jiàn)問(wèn)題解答

1、DNA/RNA合成 常見(jiàn)問(wèn)題解答處理和保存 HYPERLINK /faq5.asp#Q1#Q1 l Q1#Q1 1. 如何保存寡核苷酸? HYPERLINK /faq5.asp#Q2#Q2 l Q2#Q2 2. 如何重懸寡核苷酸? HYPERLINK /faq5.asp#Q3#Q3 l Q3#Q3 3. 如果寡核苷酸在室溫中放置超過(guò)一星期，還可以使用嗎? HYPERLINK /faq5.asp#Q4#Q4 l Q4#Q4 4. 熒光染料標(biāo)記的寡核苷酸，在儲(chǔ)存和使用過(guò)程中必須特殊處理嗎?純化和濃縮 HYPERLINK /faq5.asp#Q5#Q5 l Q5#Q5 5. 如何定量合成的寡核苷酸?

2、 HYPERLINK /faq5.asp#Q6#Q6 l Q6#Q6 6. 如何通過(guò)紫外吸光度值來(lái)定量寡核苷酸? HYPERLINK /faq5.asp#Q7#Q7 l Q7#Q7 7. 如一個(gè)18個(gè)堿基的寡核苷酸包括3個(gè)dG,4個(gè)dC,5個(gè)dA和6個(gè)dT, OD值是0.7，那 么它的量是多少? HYPERLINK /faq5.asp#Q8#Q8 l Q8#Q8 8. 如何計(jì)算寡核苷酸的分子量? HYPERLINK /faq5.asp#Q9#Q9 l Q9#Q9 9. 如何測(cè)定寡核苷酸的質(zhì)量? HYPERLINK /faq5.asp#Q10#Q10 l Q10#Q10 10. 如何測(cè)定寡核苷酸

3、的質(zhì)量? HYPERLINK /faq5.asp#Q11#Q11 l Q11#Q11 11. 如何測(cè)定合成的寡核苷酸的Tm值? HYPERLINK /faq5.asp#Q12#Q12 l Q12#Q12 12. 為什么Bioneer提供的Tm值和我們的Tm值不同? HYPERLINK /faq5.asp#Q13#Q13 l Q13#Q13 13. 用什么方法調(diào)整寡核苷酸的濃度? HYPERLINK /faq5.asp#Q14#Q14 l Q14#Q14 14. 單位換算表合成與訂購(gòu) HYPERLINK /faq5.asp#Q15#Q15 l Q15#Q15 15. 如何合成寡核苷酸? HYPE

4、RLINK /faq5.asp#Q17#Q17 l Q17#Q17 16. 標(biāo)準(zhǔn)寡核苷酸結(jié)構(gòu) HYPERLINK /faq5.asp#Q17#Q17 l Q17#Q17 17. Bioneer能合成的最長(zhǎng)的寡核苷酸是多長(zhǎng)? HYPERLINK /faq5.asp#Q18#Q18 l Q18#Q18 18. 當(dāng)我預(yù)訂50nmol的寡核苷酸，產(chǎn)品卻不足50 nmol，為什么? HYPERLINK /faq5.asp#Q19#Q19 l Q19#Q19 19. 能合成出高百分比“G”的寡核苷酸嗎? HYPERLINK /faq5.asp#Q20#Q20 l Q20#Q20 20. 能提供寡核糖核酸(

5、RNA)合成嗎? HYPERLINK /faq5.asp#Q21#Q21 l Q21#Q21 21. 合成的寡核苷酸在3 或5位有磷酸基嗎? HYPERLINK /faq5.asp#Q22#Q22 l Q22#Q22 22. 簡(jiǎn)并引物及通用引物是什么?純化方法 HYPERLINK /faq5.asp#Q23#Q23 l Q23#Q23 23. 怎樣純化合成的寡核苷酸? HYPERLINK /faq5.asp#Q24#Q24 l Q24#Q24 24. 用于芯片分析的60 mer寡核苷酸如何被純化呢?修飾寡核苷酸 HYPERLINK /faq5.asp#Q25#Q25 l Q25#Q25 25.

6、 修飾寡核苷酸 HYPERLINK /faq5.asp#Q26#Q26 l Q26#Q26 26. 作為反義脫氧寡核苷酸的硫磷?；押塑账釋?shí)驗(yàn) HYPERLINK /faq5.asp#Q27#Q27 l Q27#Q27 27. 怎樣制備雙鏈DNA?Q1. 如何保保存寡核苷酸酸？ HYPERLINK /faq5.asp#TOP#TOP l TOP#TOP HYPERLINK /faq5.asp#TOP#TOP l TOP#TOP TOP 通通常，寡核苷苷酸應(yīng)該-220保存，該溫溫度下能穩(wěn)定定保存一年以以上。寡核苷苷酸在溶液中中較為穩(wěn)定，但但易被污染的的核酸酶降解解，因此我們們建議應(yīng)干燥燥儲(chǔ)存。若

7、要要以溶液形式式儲(chǔ)存，最好好將其分裝在在幾管中分別別保存，反復(fù)復(fù)凍融會(huì)使寡寡核苷酸降解解。另外，酸酸性條件下，DDNA會(huì)因?yàn)闉槊撪堰首饔糜枚到?；堿堿性條件會(huì)使使磷酸二酯鍵鍵水解斷裂。Q2. 如何重重懸寡核苷酸酸？ HYPERLINK /faq5.asp#TOP#TOP l TOP#TOP HYPERLINK /faq5.asp#TOP#TOP l TOP#TOP TOP 為為便于長(zhǎng)期保保存，我們建建議使用TEE緩沖液(110 mM Tris-HCl,11 mM EEDTA, pH8.00)，而不用用無(wú)菌水來(lái)溶溶解寡核苷酸酸。重懸后，寡寡核苷酸應(yīng)該該在-20癈癈保存以長(zhǎng)期期使用。寡核核苷酸在無(wú)

8、菌菌水中很難溶溶解，加一定定量的NaOOH有助于寡寡核苷酸在水水中溶解。Q3. 如果寡寡核苷酸在室室溫中放置超超過(guò)一星期，還還可以使用嗎嗎？ HYPERLINK /faq5.asp#TOP#TOP l TOP#TOP HYPERLINK /faq5.asp#TOP#TOP l TOP#TOP TOP 脫脫水的寡核苷苷酸是長(zhǎng)期穩(wěn)穩(wěn)定的。即使使在溶液狀態(tài)態(tài)寡核苷酸也也相當(dāng)穩(wěn)定，通通常情況(沒(méi)沒(méi)有引入使寡寡核苷酸降解解的污染物)即使在室溫溫中放置超過(guò)過(guò)一星期也能能使用。Q4. 熒光染染料標(biāo)記的寡寡核苷酸，在在儲(chǔ)存和使用用過(guò)程中必須須特殊處理嗎嗎？ HYPERLINK /faq5.asp#TOP#TO

9、P l TOP#TOP HYPERLINK /faq5.asp#TOP#TOP l TOP#TOP TOP 如如果暴露在光光線下，熒光光染料標(biāo)記的的寡核苷酸比比未標(biāo)記的寡寡核苷酸更易易降解，熒光光強(qiáng)度會(huì)逐漸漸降低。為了了保持其熒光光效能，熒光光染料標(biāo)記的的核苷酸應(yīng)避避光-20保存。由于于Cy3和CCy5在pHH大于9時(shí)易易被降解，所所以Cy3和和Cy5修飾飾Q5. 如何定定量合成的寡寡核苷酸? HYPERLINK /faq5.asp#TOP#TOP l TOP#TOP HYPERLINK /faq5.asp#TOP#TOP l TOP#TOP TOP 合合成的寡核苷苷酸的量非常常少，不能直直接

10、稱重來(lái)定定量。通常通通過(guò)測(cè)量紫外外吸光度值(OD值)來(lái)來(lái)定量。Q6. 如何通通過(guò)紫外吸光光度值來(lái)定量量寡核苷酸？ HYPERLINK /faq5.asp#TOP#TOP l TOP#TOP HYPERLINK /faq5.asp#TOP#TOP l TOP#TOP TOP 寡寡核苷酸的量量經(jīng)常用ODD值來(lái)描述。11個(gè)OD值是是體積1mll寡核苷酸溶溶液，在內(nèi)徑徑1cm的比色色杯中的吸光光度值，約為為33 mgg寡核苷酸，序序列不同的寡寡核苷酸ODD值有所不同同。因?yàn)樵?260nm處處單個(gè)堿基的的吸光度值是是已知的，所所以序列已知知的寡核苷酸酸的濃度就可可以測(cè)定。dT: 8.88 ml/mold

11、G: 11.7 ml/mol dC: 7.33 ml/mol dA: 15.4 ml/mol 對(duì)對(duì)于一段寡核核苷酸，它的的吸光度等于于每個(gè)堿基的的數(shù)目乘以它它的吸光系數(shù)數(shù)，然后將44種堿基的結(jié)結(jié)果加起來(lái)就就是整個(gè)寡核核苷酸的吸光光度。它的濃濃度可通過(guò)下下式來(lái)計(jì)算 ：O.D. =C (內(nèi)徑徑1 cm的比比色杯)Q7. 如一個(gè)個(gè)18個(gè)堿基基的寡核苷酸酸包括3個(gè)ddG,4個(gè)ddC,5個(gè)ddA和6個(gè)ddT, ODD值是0.77，那么它的的量是多少？ HYPERLINK /faq5.asp#TOP#TOP l TOP#TOP HYPERLINK /faq5.asp#TOP#TOP l TOP#TOP T

12、OP首先，用下面公公式計(jì)算188個(gè)堿基的寡寡核苷酸的吸吸光度是多少少 ：.3.45 8 1 mmolee然后，通過(guò)下式式來(lái)計(jì)算寡核核苷酸的濃度度：O.D. =C，C = O.D./CC = 0.77 /1944.1 = 0.00336 (mmol/mll) = 33.6 (nnmol/mml)最后，OD值為為0.7的118個(gè)堿基寡寡核苷酸的濃濃度是3.66nmol。Q8. 如何計(jì)計(jì)算寡核苷酸酸的分子量? HYPERLINK /faq5.asp#TOP#TOP l TOP#TOP HYPERLINK /faq5.asp#TOP#TOP l TOP#TOP TOP寡核苷酸的分子子量可以通過(guò)過(guò)下式進(jìn)

13、行計(jì)計(jì)算：M.W. =(NA 2249.2) + (NNC 2225.2) + (NNG 2265.2) + (NNT 2240.2) + (寡寡核苷酸長(zhǎng)度度-1) 63.998 + 22.02NA =總 AA數(shù)NC = 總CC數(shù)NG = 總GG數(shù)NT = 總TT數(shù)Q9. 如何測(cè)測(cè)定寡核苷酸酸的質(zhì)量? HYPERLINK /faq5.asp#TOP#TOP l TOP#TOP HYPERLINK /faq5.asp#TOP#TOP l TOP#TOP TOP 通通常，合成的的寡核苷酸的的質(zhì)量用摩爾爾數(shù)來(lái)描述，常常用nmoll。用寡核苷苷酸的摩爾數(shù)數(shù)或寡核苷酸酸的分子量可可以計(jì)算寡核核苷酸的量：

14、 寡寡核苷酸質(zhì)量量(ng) =分子量(M.W.)摩爾數(shù)(nmol)Q10. 如果果不知道寡核核苷酸的堿基基組成，有什什么辦法來(lái)定定量合成的寡寡核苷酸？ HYPERLINK /faq5.asp#TOP#TOP l TOP#TOP HYPERLINK /faq5.asp#TOP#TOP l TOP#TOP TOP 1 寡大m 苷為m對(duì)寡上較最 的短 質(zhì)算以 確果Q11. 如何何測(cè)定合成的的寡核苷酸的的Tm值? HYPERLINK /faq5.asp#TOP#TOP l TOP#TOP HYPERLINK /faq5.asp#TOP#TOP l TOP#TOP TOP TTm(解鏈溫溫度)是指550

15、%雙鏈被被解開(kāi)成單鏈鏈時(shí)的溫度。寡寡核苷酸濃度度和鹽濃度會(huì)會(huì)影響Tm值值的大小。 法們用鄰( ,45來(lái)來(lái)計(jì)算。用這這種方法計(jì)算算前，也有多多種方法來(lái)估估測(cè)。如果是是15個(gè)堿基基以下，那么么有一種好的的方法來(lái)估算算，對(duì)于A和和T，可以乘乘以2癈，對(duì)對(duì)于C和G，可可以乘以4癈癈然后相加，這這叫做Walllace法法則。 Tm= 2 (A + T) + 4 (G + C)另一種方法來(lái)估估計(jì)長(zhǎng)鏈中GGC含量Tm = 811.5 + 0.41(%GC) - 5000/L + 16.6 logMM(L:寡核苷酸酸的長(zhǎng)度；MM:1價(jià)陽(yáng)離離子的濃度) 但但這些方法不不能消除堿基基堆積的影響響，結(jié)果并不不準(zhǔn)確，

16、所以以近鄰法被廣廣泛的應(yīng)用。但但是，對(duì)于在在60-700 bp或115bp以下下的寡核苷酸酸的測(cè)定，近近鄰法還是有有缺點(diǎn)。 BBioneeer使用的近近鄰法具有新新的特點(diǎn)。它它考慮到在退退火過(guò)程中不不同的堿基序序列的影響，并并且通過(guò)熱力力學(xué)來(lái)測(cè)定，可可以更有效的的測(cè)定Tm值值。比如5 -GC-3 和55 -CGG-3的序序列用熱力學(xué)學(xué)方法測(cè)定結(jié)結(jié)果是不同的的。計(jì)算方法法如下： 依依靠熱力學(xué)方方法，焓和熵熵通過(guò)兩個(gè)堿堿基來(lái)確定。salt是指一價(jià)陽(yáng)陽(yáng)離子的濃度度，Oliigo是指指反應(yīng)過(guò)程中中的寡核苷酸酸濃度。R是是指氣體常數(shù)數(shù)(1.9887 callK-1mmol-1)。Bionneer用近近鄰

17、法計(jì)算TTm值時(shí)，使使用的是500 mM的鹽鹽濃度和1 nM的寡核核苷酸的濃度度。 BBioneeer會(huì)給每一一個(gè)用戶提供供Tm值，但但這只是估計(jì)計(jì)值，我們不不能保證精確確性，因此這這個(gè)值僅供用用戶參考。如果沒(méi)有擴(kuò)增出出產(chǎn)物，你可可以把退火溫溫度降到Tmm值以下45癈。如果果有許多非特特異性的產(chǎn)物物，你需要改改變實(shí)驗(yàn)條件件如提高退火火溫度以得到到正確的產(chǎn)物物。Q12. 為什什么Bionneer提供供的Tm值和和我們的Tmm值不同? HYPERLINK /faq5.asp#TOP#TOP l TOP#TOP HYPERLINK /faq5.asp#TOP#TOP l TOP#TOP TOP BB

18、ioneeer使用的TTm值的計(jì)算算方法和我們們通常的計(jì)算算方法是不同同的。我們通通常只是簡(jiǎn)單單的乘以A、GG、C、T的的數(shù)目，但序序列不同堿基基的Tm值亦亦會(huì)不同。如如Tm值取決決于序列中的的每一個(gè)堿基基，即使堿基基數(shù)相同但序序列不同時(shí)，TTm值也將不不同。Q13. 用什什么方法調(diào)整整寡核苷酸的的濃度？ HYPERLINK /faq5.asp#TOP#TOP l TOP#TOP HYPERLINK /faq5.asp#TOP#TOP l TOP#TOP TOP 首首先，在Biioneerr提供的數(shù)據(jù)據(jù)表或報(bào)告單單中的1000 pmoll/靗，是用用來(lái)加入TEE緩沖液或無(wú)無(wú)菌水，以使使管中寡核

19、苷苷酸的終濃度度達(dá)到1000 pmoll/靗。例如如,數(shù)據(jù)表或或報(bào)告單中是是189.00和209.2時(shí)，則應(yīng)應(yīng)向兩個(gè)管中中分別加入相相應(yīng)量的無(wú)菌菌水,即可使使每個(gè)管中的的寡核苷酸濃濃度達(dá)到1000 pmool/l。每每一個(gè)管中寡寡核苷酸含量量通過(guò)下式可可以計(jì)算如下下：189.0ll100 pmol/l = 18,9000 pmool = 118.9 nnmol,209.2ll100 pmol/l = 20,9220 pmool = 220.92 nmol如果所要的終濃濃度是0.55M，pmmol/ll需要換MM。100 pmool/l = 1000 1066pmoll/106l = 11001

20、006 100-12mmol/L = 10-4moll/L= 10-4106 mol/L= 102mmol /LL= 100 M終濃度換算為1100M，如如果需要的濃濃度是0.55M的，加加入終體積的的1/2000的引物量，以以使引物終濃濃度為0.55M。PCR反應(yīng)的終終體積是500l，所以以需要加500/200 = 0.225l的引引物，以使終終濃度達(dá)到00.5M。Q14. 單位位換算表 HYPERLINK /faq5.asp#TOP#TOP l TOP#TOP HYPERLINK /faq5.asp#TOP#TOP l TOP#TOP TOP科學(xué)系統(tǒng)單位: 10-1 = decci d 1

21、01 = decaa da 10-2 = cennti cc 102 = hectto h 10-3 = millli mm 103 = kiloo k 10-6 = miccro mm 106 = megaa M 10-9 = nanno n 109 = gigaa G 10-122 = piico pp 1012 = terra T 10-155 = feemto f 1015 = petta P 10-188 = attto aa 1018 = exaa E 10-211 = zeepto z 1021 = zettta ZZ 10-244 = yoocto y 1024 = yottt

22、a YY寡核苷酸單位換換算的例子:1 pmol/l= 110-12 mool/1110-6L= 110-6 moll/L= 1moll/L= 1MQ15. 如何何合成寡核苷苷酸? HYPERLINK /faq5.asp#TOP#TOP l TOP#TOP HYPERLINK /faq5.asp#TOP#TOP l TOP#TOP TOP 目目前最流行的的用于合成寡寡核苷酸的方方法是通過(guò)使使用“亞磷酸酸三 連形 33-5磷 Koster發(fā)現(xiàn)了-氰乙基亞磷酰胺并作為構(gòu)建單體，現(xiàn)在普遍的用于寡核苷酸的合成(Nucl. Acids Res. 1984, 12,4539; Tetrahedron Let

23、t. 1983, 24,5843)。通過(guò)“亞磷酸三脂”的方法使用-氰乙基亞磷酰胺，合成效率能夠達(dá)到(98%)而合成時(shí)間比其它寡核苷酸的合成方法更短。而且，由于單體-氰乙基亞磷酰胺在激活以前很穩(wěn)定，這是對(duì)合成寡核苷酸來(lái)說(shuō)所必需的，他們能儲(chǔ)存更長(zhǎng)的時(shí)間。當(dāng)寡核苷酸共價(jià)的連接在固相載體上就可以使其不被過(guò)量溶解-氰乙基亞磷酰胺和結(jié)合試劑的作用下，寡核苷酸被合成。在各種各樣的固相載體中，可控孔度玻片已經(jīng)在近年廣泛使用了，這種玻片是由均勻的玻璃基質(zhì)組成，上面有固定尺寸的孔。 整整個(gè)寡核苷酸酸的合成通過(guò)過(guò)一系列的反反應(yīng)完成，其其中包括四個(gè)個(gè)循環(huán)反應(yīng)：脫保護(hù)，連連接，氧化，加加帽。脫保護(hù) 通通過(guò)第一個(gè)循循環(huán)脫

24、保護(hù)護(hù)，CPG裂裂解出5保保護(hù)基團(tuán)DMMT。酸性條條件對(duì)于脫保保護(hù)是必需的的，通常使用用3三氯乙乙酸。據(jù)報(bào)道道，寡核苷酸酸在酸性環(huán)境境中易脫嘌呤呤，尤其是對(duì)對(duì)于腺苷。因因?yàn)槿纫宜崴嵊泻軓?qiáng)的酸酸性，所以用用三氯乙酸脫脫保護(hù)時(shí)，反反應(yīng)時(shí)間不應(yīng)應(yīng)該太長(zhǎng)。比比起三氯乙酸酸，二氯乙酸酸酸性較弱，能能夠在一些情情況下避免脫脫嘌呤問(wèn)題。脫脫保護(hù)后產(chǎn)生生的DMT陽(yáng)陽(yáng)離子呈現(xiàn)出出一種深橘色色。通過(guò)測(cè)定定吸光度，來(lái)來(lái)監(jiān)測(cè)反應(yīng)效效率。連接 脫脫保護(hù)后，CCPG上的55-羥基暴暴露，結(jié)合核核苷-氰乙乙基亞磷酰胺胺，三亞磷酸酸酯氧化變成成磷酸三脂，然然后按順序連連接。對(duì)于核核苷-氰乙乙基亞磷酰胺胺，為了避免免合成寡核

25、苷苷酸過(guò)程中負(fù)負(fù)反應(yīng)的發(fā)生生，堿基的環(huán)環(huán)外氨基被保保護(hù)以免形成成酰胺結(jié)構(gòu)。苯苯甲酰基用于于保護(hù)酰苷和和胞苷。另一一方面，異丁丁?；糜邙B鳥苷堿基保護(hù)護(hù)。胸苷堿基基中沒(méi)有環(huán)外外的胺基，所所以不需要保保護(hù)。-氰氰乙基亞磷酰酰胺用于保護(hù)護(hù)所有核苷的的5-羥基基。 因因?yàn)楹塑?-氰乙基亞磷磷酰胺在正常常條件下非常常穩(wěn)定，不能能直接和正在在合成鏈上游游離的5-羥基功能基基團(tuán)發(fā)生反應(yīng)應(yīng)。所以，它它們必須首先先通過(guò)一種弱弱酸性激活劑劑激活。在各各種激活劑中中，四唑作為為標(biāo)準(zhǔn)激活劑劑具有很強(qiáng)的的激活作用。四四唑已經(jīng)被認(rèn)認(rèn)為具有雙重重作用：它質(zhì)質(zhì)子化2-氰氰乙基亞磷酰酰胺的二異丙丙氨基，產(chǎn)生生親核基團(tuán)，形形成具

26、有活性性的四唑膦中中間產(chǎn)物。用用這種被激活活的核苷亞磷磷酰胺試劑耦耦聯(lián)反應(yīng)快(不到2分鐘鐘)，產(chǎn)量高高。氧化 新新合成的亞磷磷酸鹽和核苷苷酸之間的鍵鍵合不穩(wěn)定，對(duì)對(duì)酸和堿均很很敏感。因此此，三價(jià)的亞亞磷酸三脂被被氧化成五價(jià)價(jià)的磷酸三脂脂。碘是溫和和的氧化劑，在在堿性的四氫氫呋喃溶液中中作為氧的供供體。此步反反應(yīng)非?？?，在在三十秒內(nèi)就就可以完成。加帽 因因?yàn)榻Y(jié)合反應(yīng)應(yīng)在特定的時(shí)時(shí)間內(nèi)不能夠夠定量，在每每一步結(jié)合反反應(yīng)中都有一一小段提前終終止的序列產(chǎn)產(chǎn)生。如果這這些序列進(jìn)一一步參與反應(yīng)應(yīng)，產(chǎn)物將很很難從混合序序列中分離出出來(lái)。通過(guò)加加帽，即將自自由羥基乙酰?；?，解決了了這個(gè)問(wèn)題。乙乙?；捎蓮?qiáng)強(qiáng)的

27、乙?；囋噭┩瓿?，該該試劑是由等等摩爾的醋酸酸酐和N-甲甲基咪唑組成成，反應(yīng)可在在30秒內(nèi)完完成。氧化后后，核苷酸加加入，循環(huán)完完成。寡核苷苷酸合成后，移移去增長(zhǎng)鏈55-末端的的DMT基團(tuán)團(tuán)，下一個(gè)核核苷酸的聚合合循環(huán)開(kāi)始。整整個(gè)寡核苷酸酸合成后，借借助濃氨水的的處理，寡核核苷酸從固相相載體上分離離，同時(shí)堿基基和磷酸基去去保護(hù)。Q16. 標(biāo)準(zhǔn)準(zhǔn)寡核苷酸結(jié)結(jié)構(gòu) HYPERLINK /faq5.asp#TOP#TOP l TOP#TOP HYPERLINK /faq5.asp#TOP#TOP l TOP#TOP TOPQ17. Biioneerr能合成的最最長(zhǎng)的寡核苷苷酸是多長(zhǎng)? HYPERLIN

28、K /faq5.asp#TOP#TOP l TOP#TOP HYPERLINK /faq5.asp#TOP#TOP l TOP#TOP TOP合成量0.0225 mool: 500 mer合成量0.055 moll: 50 mer合成量0.1 mol: 100 mer合成量0.2 mol: 100 mer合成量1.0 mol: 130 merQ18. 當(dāng)我我預(yù)訂50nnmol的寡寡核苷酸，產(chǎn)產(chǎn)品卻不足550 nmool，為什么么? HYPERLINK /faq5.asp#TOP#TOP l TOP#TOP HYPERLINK /faq5.asp#TOP#TOP l TOP#TOP TOP 55

29、0 nmool的寡核苷苷酸合成不意意味著能得到到50 nmmol的最終終產(chǎn)品。500 nmoll是指在寡核核苷酸合成開(kāi)開(kāi)始時(shí)固相載載體負(fù)荷的數(shù)數(shù)量。寡核苷苷酸通常是反反應(yīng)所要求的的量而不是最最終產(chǎn)率，用用戶得到的核核苷酸的數(shù)量量自然要比要要求的少。終終產(chǎn)率受寡核核苷酸長(zhǎng)度、堿堿基組成和連連接效率的影影響。Q19. 能合合成出高百分分比“G”的的寡核苷酸嗎嗎? HYPERLINK /faq5.asp#TOP#TOP l TOP#TOP HYPERLINK /faq5.asp#TOP#TOP l TOP#TOP TOP 眾眾所周知，含含高百分比的的“G”寡核核苷酸不容易易被合成，特特別是序列中中包

30、含一行“GG”。有報(bào)道道，如果有四四個(gè)或更多的的“G”排成成一行，寡核核苷酸將趨向向形成鳥嘌呤呤四聚體(PPoon aand MaacGreggor,Biiopolyymers, 19998, 455, 4277 -4344)。通過(guò)次次黃嘌呤核苷苷置換部分GG，就能避免免四聚體鳥苷苷的形成。Q20. 能提提供寡核糖核核酸(RNAA)合成嗎？ HYPERLINK /faq5.asp#TOP#TOP l TOP#TOP HYPERLINK /faq5.asp#TOP#TOP l TOP#TOP TOP 是是的，我們能能合成。我們們能提供2-OH或/和2-O-甲基結(jié)構(gòu)的的寡核糖核苷苷酸，也能合合成由

31、DNAA和RNA組組成的寡核苷苷酸。Q21. 合成成的寡核苷酸酸在3 或或5位有磷磷酸基嗎？ HYPERLINK /faq5.asp#TOP#TOP l TOP#TOP HYPERLINK /faq5.asp#TOP#TOP l TOP#TOP TOP 如如果沒(méi)有殊要要求,合成的的寡核苷酸在在3或5端均無(wú)磷酸酸基。如果你你想要3或或5有磷酸酸基的寡核苷苷酸，你應(yīng)該該在訂單上標(biāo)標(biāo)注清楚在33或5端端進(jìn)行磷酸化化修飾。Q22. 簡(jiǎn)并并引物及通用用引物是什么么？ HYPERLINK /faq5.asp#TOP#TOP l TOP#TOP HYPERLINK /faq5.asp#TOP#TOP l T

32、OP#TOP TOPR - a 或 gY - c 或 tM - a 或 cK - g 或 tS - g 或 cW - a 或 tV - a, c或 ggH - a, t或 ccB - g, t或 ccD - g, a或 ttN I:AA I:T=I:GG.形成穩(wěn)定定的堿基配對(duì)對(duì)。包含肌苷苷的寡核苷酸酸借助PCRR或探針雜交交可用于檢測(cè)測(cè)或分析不同同的或相似的的DNA序列列。硫磷酰修飾法： 經(jīng)經(jīng)硫磷?；墓押塑账崴釋?duì)核酸內(nèi)切切酶和核酸外外切酶的降解解有很好的抵抵抗作用，這這種特性能增增加反義寡核核苷酸鏈在細(xì)細(xì)胞內(nèi)的效果果。我們可以以依據(jù)用戶的的需要，在寡寡核苷酸部分分序列中用硫硫磷?；脫Q換

33、核苷酸內(nèi)部部的磷酸基(在磷酸基中中用一個(gè)硫原原子代替一個(gè)個(gè)氧原子)。雙重修飾法(55熒光素33 Dabbsyl & 5熒光光素鈉3 TAMRAA 修飾)： 雙雙重標(biāo)記的寡寡核苷酸可在在實(shí)時(shí)PCRR中用來(lái)檢測(cè)測(cè)DNA的擴(kuò)擴(kuò)增。他們或或者在反應(yīng)中中裂開(kāi)(如TTaqMann探針)或者者在互補(bǔ)目的的DNA存在在的情況下經(jīng)經(jīng)歷一種構(gòu)型型變化(如分分子信標(biāo))。許許多探針利用用寡核苷酸形形成反向環(huán)構(gòu)構(gòu)型的特征進(jìn)進(jìn)行設(shè)計(jì)。實(shí)實(shí)際上，通過(guò)過(guò)除去供體熒熒光基團(tuán)的淬淬滅作用，探探針可指示反反應(yīng)的發(fā)生。PCR檢測(cè)的55 核酸酶酶測(cè)定法(TTaqMann探針)： 55核酸酶測(cè)測(cè)定法被用來(lái)來(lái)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)反反應(yīng)。這種測(cè)測(cè)定法利

34、用耐耐熱性DNAA聚合酶的55核酸外切切酶的活性來(lái)來(lái)檢測(cè)正在進(jìn)進(jìn)行的反應(yīng)。耐耐熱性DNAA聚合酶能夠夠從鏈狀DNNA的5端端水解核苷酸酸，舊鏈在合合成一條新鏈鏈時(shí)被置換。裂裂解主要發(fā)生生在置換的單單鏈部分和DDNA配對(duì)的的雙鏈部分的的連接處。這這導(dǎo)致單核苷苷酸和寡核苷苷酸從置換的的DNA鏈的的5末端被被釋放。DNNA聚合酶的的這種特性被被用來(lái)監(jiān)測(cè)反反應(yīng)。在5端核酸酶檢檢測(cè)法中FRRET DNNA雙重探針針是短的寡核核苷酸，與擴(kuò)擴(kuò)增DNA靶靶序列和修飾飾的3端互互補(bǔ)，以至于于他們不能在在3端延長(zhǎng)長(zhǎng)。他們?cè)?3和5末末端用熒光基基團(tuán)標(biāo)記。報(bào)報(bào)告熒光染料料被放置在55末端，粹粹滅劑被放置置在探針的3

35、3末端。在在完整的探針針中，染料的的熒光性被消消除，在PCCR反應(yīng)中探探針與靶序列列雜交 ，借借助耐熱性DDNA聚合酶酶的5核酸酸酶的活性，淬淬滅劑與報(bào)告告基因分離，從從而恢復(fù)報(bào)告告基因的熒光光性。兩個(gè)探探針被使用，一一個(gè)用于正常常序列，另一一個(gè)用于3 bp缺失的的互補(bǔ)序列。每每個(gè)探針在55末端有不不同的報(bào)告熒熒光，并且一一個(gè)相同的粹粹滅劑染料連連接在從5末端數(shù)的第第七個(gè)核苷酸酸上。靶DNNA的鑒定由由熒光發(fā)射光光譜決定。分子信標(biāo)： 嚴(yán)嚴(yán)格的說(shuō)，熒熒光淬滅在使使用DABCCYL分子指指示標(biāo)中不是是FRET相相關(guān)的，因?yàn)闉樗荒軡M足足重疊光譜的的標(biāo)準(zhǔn)。然而而，以FREET為基礎(chǔ)的的淬滅也能被被使

36、用。分子子信標(biāo)被作為為雜交探針后后不久被應(yīng)用用于PCR，利利用它們能夠夠同互補(bǔ)DNNA雜交的原原理，它們能能夠被用來(lái)監(jiān)監(jiān)測(cè)一個(gè)正在在進(jìn)行中的反反應(yīng)和在實(shí)時(shí)時(shí)PCR中區(qū)區(qū)別等位基因因。反應(yīng)完成成后，反應(yīng)物物加入固定有有分子信標(biāo)的的微量滴定孔孔中，借助讀讀取產(chǎn)生的熒熒光檢測(cè)產(chǎn)物物?；蛘哌€可可用封閉試管管和實(shí)時(shí)程序序來(lái)檢測(cè)。在在這種情況下下，分子信標(biāo)標(biāo)被直接加入入到PCR混混合物并且與與擴(kuò)增反應(yīng)中中新合成的DDNA雜交。與與TaqMann探針相比，分分子信標(biāo)優(yōu)勢(shì)勢(shì)在于能夠進(jìn)進(jìn)行多重PCCR檢測(cè)，因因?yàn)?，在理論論上，他們能能同時(shí)測(cè)定更更多的產(chǎn)品。Q26. 作為為反義脫氧寡寡核苷酸的硫硫磷?；押撕塑账?/p>

37、 HYPERLINK /faq5.asp#TOP#TOP l TOP#TOP HYPERLINK /faq5.asp#TOP#TOP l TOP#TOP TOP 隨隨著我們對(duì)分分子生物學(xué)的的理解不斷加加深，我們慢慢慢獲得對(duì)分分子水平疾病病的認(rèn)識(shí)。合合理的藥物設(shè)設(shè)計(jì)變得更加加可行。特別別是在蛋白質(zhì)質(zhì)水平上分子子間的反應(yīng)能能夠被完美的的設(shè)計(jì)，通過(guò)過(guò)生物合理的的途徑來(lái)提高高結(jié)合性，分分子間的相互互作用成功的的被應(yīng)用和被被最佳化。合合成的脫氧寡寡核苷酸(OODNs)已已經(jīng)被Zammecnikk和Stepphensoon提出作為為一種新的潛潛在的治療方方法，這種方方法以一種合合理的方式與與信使RNAA疾

38、病關(guān)聯(lián)蛋蛋白相互作用用，并且特異異的抑制它的的合成。 這這種被稱為反反義策略的方方法的優(yōu)勢(shì)在在于，通過(guò)眾眾所周知的WWatsonn-Cricck堿基配對(duì)對(duì)法則，即單單鏈核酸與互互補(bǔ)的寡核苷苷酸鏈相互作作用形成雙螺螺旋結(jié)構(gòu)。每每個(gè)蛋白分子子均遵循分子子生物學(xué)的基基本機(jī)制合成成：一個(gè)基因因(雙鏈DNNA)攜帶一一種特定蛋白白質(zhì)的遺傳信信息，被轉(zhuǎn)錄錄成作為信息息攜帶者的單單鏈mRNAA，再以此作作為模板在核核糖體指導(dǎo)蛋蛋白質(zhì)的合成成(翻譯)。因因此，反義策策略不被限制制于特定類型型的疾病而能能夠被廣泛地地應(yīng)用。天然然的寡核苷酸酸(DNA和和RNA)不不能夠達(dá)到作作為反義藥物物候選物的標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)，不同的的

39、化學(xué)修飾將將克服現(xiàn)存的的障礙，它將將被細(xì)胞吸收收，抵抗核酸酸酶的降解和和提高與mRRNA的親和和力。首先，脫脫氧寡核苷酸酸(ODNss)必須能夠夠穿越細(xì)胞膜膜到達(dá)細(xì)胞質(zhì)質(zhì)或細(xì)胞核。一一旦進(jìn)入細(xì)胞胞內(nèi)部，ODDNs就必須須抵抗核酸酶酶的降解。最最后，為了抑抑制致病基因因的表達(dá)，OODNs必須須能夠特異性性結(jié)合并對(duì)靶靶mRNA有有高度的親和和力。早期在在組織培養(yǎng)中中觀察到的OODNs的活活性后曾認(rèn)為為，這些理論論上的障礙不不值得擔(dān)心。然然而，最近文文章的數(shù)據(jù)分分析顯示這些些理論上的障障礙確實(shí)存在在。 最最近的研究焦焦點(diǎn)在于用化化學(xué)方法改善善ODNs的的特性，主要要集中在核苷苷酸酶抵抗力力和mRNAA親和力的提提高方面。mmRNA親和和力對(duì)于反義義策略非常重重要，它常常常用解鏈溫度度(Tm)所所反映。雙倍倍體核酸中，由由于堿基堆積積