儀器分析分子發(fā)光分析法

1、關(guān)于儀器分析分子發(fā)光分析法第1頁，共61頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)56分，星期四分子發(fā)光分析法較高激發(fā)態(tài)基 態(tài)吸收能量受激退激光輻射分子在退激過程中以光輻射形式釋放能量 5- 1 分子發(fā)光分析法及其分類第2頁，共61頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)56分，星期四根據(jù)分子受激時(shí)所吸收能源及輻射光的機(jī)理不同分為以下幾類： 光致發(fā)光：以光能來激發(fā)而發(fā)光 化學(xué)發(fā)光：以化學(xué)反應(yīng)能激發(fā)而發(fā)光化學(xué)發(fā) 光分析法 熱致發(fā)光 、生物發(fā)光、電致發(fā)光熒光熒光分析法磷光磷光分析法第3頁，共61頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)56分，星期四激發(fā)光譜和熒光光譜熒光強(qiáng)度波長（nm)300400500硫酸奎寧的兩個(gè)

2、光譜Iex,maxfl,max第4頁，共61頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)56分，星期四硒熒光分光光度法GB17378.5-1998(13.1)油類沉積物 熒光分光光度法GB17378.5-1998(14.1)石油烴熒光分光光度法GB17378.6-1998(14.1)第5頁，共61頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)56分，星期四 5- 2 熒光和磷光光譜法一、熒光和磷光光譜的產(chǎn)生基態(tài)分子光照后，價(jià)電子躍遷產(chǎn)生熒光和磷光 基態(tài)分子 價(jià)電子躍遷到激發(fā)態(tài)光照激發(fā)去激發(fā)光 * * n基 態(tài)第6頁，共61頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)56分，星期四1. 電子自旋狀態(tài)的多重性分子中的電子數(shù)及自旋

3、方向基態(tài)單重態(tài) S0第一激發(fā)單重態(tài) S1S0, S1, S2, S3分別代表基態(tài)、第一、 二、 三激發(fā)單重態(tài)單重態(tài)分子具有抗磁性，激發(fā)態(tài)的平均壽命約為10-8第7頁，共61頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)56分，星期四T1、T2、T3分別表示第一、二、三激發(fā)三重態(tài)由基態(tài)單重態(tài)激發(fā)三重態(tài)，凈自旋 0。這種躍遷為禁阻躍遷基態(tài)單重態(tài) S0第一激發(fā)三重態(tài) T1自旋平行三重態(tài)分子具有順磁性，激發(fā)態(tài)的平均壽命約為10-4 1S第8頁，共61頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)56分，星期四 2. 無輻射去激 外部轉(zhuǎn)移激發(fā)態(tài)分子與溶劑分子或溶質(zhì)分子的相互作用產(chǎn)生能量轉(zhuǎn)移，熒光或磷光減弱或消失振動馳豫(VR)

4、同一電子能級中，從較高振動能級到較低振動能級的過程內(nèi)部轉(zhuǎn)換(IC)相同的多重態(tài)之間的轉(zhuǎn)換 S-S系間竄躍(ISC)不同的多重態(tài)之間的轉(zhuǎn)換S-T 發(fā)生系間竄躍電子需轉(zhuǎn)向，S1T1間進(jìn)行，比內(nèi)部轉(zhuǎn)換困難 第9頁，共61頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)56分，星期四T1S0ISCVRVRIC吸光 吸光S0S1S2VR：振動馳豫IC：內(nèi)部轉(zhuǎn)換ISC：系間竄躍第10頁，共61頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)56分，星期四3.輻射去激熒光和磷光產(chǎn)生S1或T1 S0 這種過程叫輻射去激 發(fā)光(1) 熒光：從S1的最低振動能級回到S0各振動能級所產(chǎn)生的光輻射叫熒光第11頁，共61頁，2022年，5月20日

5、，18點(diǎn)56分，星期四特點(diǎn)：產(chǎn)生速度快，10-910-6s；依賴于外部光源 熒激第12頁，共61頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)56分，星期四T1S0ISCVRVRIC吸光 吸光 熒光圖5-1 分子熒光光譜產(chǎn)生過程示意圖S0S1S2VR：振動馳豫IC：內(nèi)部轉(zhuǎn)換ISC：系間竄躍第13頁，共61頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)56分，星期四（2）磷光S1 T1 S0 磷光特點(diǎn)：發(fā)光速度慢，約為 10-4 10s，光照停止后，磷光仍可持續(xù)一段時(shí)間體系間竄躍(isc)發(fā)光第14頁，共61頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)56分，星期四磷光的波長更長 磷 熒 激 * 易產(chǎn)生熒光 n * 易產(chǎn)生磷光第

6、15頁，共61頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)56分，星期四T1S0ISCVRVRIC吸光 吸光 熒光 磷光圖5-1 分子熒光、磷光光譜產(chǎn)生過程示意圖S0S1S2VR：振動馳豫IC：內(nèi)部轉(zhuǎn)換ISC：系間竄躍VR第16頁，共61頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)56分，星期四二、熒光、磷光與分子結(jié)構(gòu)的關(guān)系（一）熒光效率 熒光強(qiáng)度常用熒光量子效率f 來描述 熒光量子效率 f =發(fā)熒光的分子數(shù)激發(fā)態(tài)分子總數(shù)第17頁，共61頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)56分，星期四 f 是一個(gè)物質(zhì)熒光特性的重要參數(shù)，反映了熒光物質(zhì)發(fā)射熒光的能力， f 越大，熒光越強(qiáng)，在01之間。分析上有應(yīng)用價(jià)值的熒光化合物的

7、熒光效率大于0.1。第18頁，共61頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)56分，星期四（二）熒光磷光與有機(jī)化合物結(jié)構(gòu)的關(guān)系至今對激發(fā)態(tài)分子的性質(zhì)了解不深，無法定量地描述熒光與分子結(jié)構(gòu)之間的關(guān)系物質(zhì)只有吸收了紫外可見光，產(chǎn)生 *、n *躍遷，產(chǎn)生熒光第19頁，共61頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)56分，星期四 *與n *躍遷相比，摩爾吸收系數(shù)大102103，壽命短 *躍遷常產(chǎn)生較強(qiáng)的熒光， n *躍遷產(chǎn)生的熒光弱，但可產(chǎn)生系間竄躍，產(chǎn)生更強(qiáng)的磷光第20頁，共61頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)56分，星期四1. 共軛體系有較強(qiáng)的熒光具有共軛體系的芳環(huán)或雜環(huán)化合物, 電子共軛程度越大，越易產(chǎn)生

8、熒光; 環(huán)越多，共軛程度越大, 產(chǎn)生熒光波長越長，發(fā)射的熒光強(qiáng)度越強(qiáng)第21頁，共61頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)56分，星期四f ex /nm em /nm 0.11 205 278 0.29 286 3100.46 365 400苯萘蒽 350菲線狀環(huán)結(jié)構(gòu)比非線狀結(jié)構(gòu)的熒光波長長第22頁，共61頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)56分，星期四 多環(huán)芳烴是重要的環(huán)境污染物，可用熒光法測定 3,4 - 苯并芘是強(qiáng)致癌物 ex = 386 nm em = 430 nm第23頁，共61頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)56分，星期四2. 剛性平面結(jié)構(gòu)較穩(wěn)定的平面結(jié)構(gòu)具有強(qiáng)熒光的分子多數(shù)有剛性平

9、面結(jié)構(gòu)熒光素：氧橋把兩個(gè)環(huán)固定在一個(gè)平面上，具有平面結(jié)構(gòu)，強(qiáng)熒光物質(zhì)酚酞：無氧橋把兩個(gè)環(huán)固定，不能很好的共平面，為非熒光物質(zhì)第24頁，共61頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)56分，星期四例 1，2 - 二苯乙烯反式：平面構(gòu)型 強(qiáng)熒光體順式：非平面構(gòu)型 非熒光體第25頁，共61頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)56分，星期四（三）取代基的類型（1）增強(qiáng)熒光的取代基 -OH、-OR、-NH2、-NHR、-NR2等給電子基團(tuán)由于基團(tuán)的 n 電子（孤對電子）的電子云與苯環(huán)上的 軌道平行，共享了共軛 電子，擴(kuò)大了共軛體系，使熒光波長長移，熒光強(qiáng)度增強(qiáng)第26頁，共61頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)5

10、6分，星期四（2）減弱熒光的取代基 -COOH 、 -NO2 、-COOR 、-NO、-SH 吸電子基團(tuán), 使熒光波長短移，熒光強(qiáng)度減弱芳環(huán)上被F、Cl、Br、I 取代后，使系間竄躍加強(qiáng)，磷光增強(qiáng)，熒光減弱。磷光相應(yīng)增強(qiáng)，這種效應(yīng)為重原子效應(yīng)。（3）影響不明顯的取代基 -NH3+、-R、- SO3H等第27頁，共61頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)56分，星期四三、環(huán)境對熒光、磷光的影響 1. 溶劑的影響 不同的溶劑中可能表現(xiàn)出不同的熒光性質(zhì) 溶劑的極性增強(qiáng)，熒光波長紅移，強(qiáng)度增大 2. 溫度的影響低溫下測定，提高靈敏度 因?yàn)檩椛滠S遷的速率基本不隨溫度變; 非輻射躍遷隨溫度升高顯著增大。 熒

11、光效率會隨溶液溫度升高下降，強(qiáng)度減弱。 溫度對磷光影響更大第28頁，共61頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)56分，星期四3. pH的影響大多數(shù)含有酸性或堿性基團(tuán)的芳香族化合物的熒光性質(zhì)受溶液pH的影響很大共軛酸堿對是具有不同熒光性質(zhì)的兩種型體，具有各自的熒光效率和熒光波長例： 苯酚離子化后，熒光消失pH1有熒光pH13無熒光第29頁，共61頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)56分，星期四但兩個(gè)苯環(huán)相連的化合物，又表現(xiàn)出相反的性質(zhì)，分子形式無熒光，離子化后顯熒光例：苯酚有熒光無熒光另外，表面活性劑也會影響熒光強(qiáng)度和特性第30頁，共61頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)56分，星期四熒光池I0I

12、If熒光強(qiáng)度檢測器四、熒光強(qiáng)度與熒光物質(zhì)濃度的關(guān)系 強(qiáng)度為I0的入射光，照射到濃度很稀的熒光物質(zhì)時(shí),產(chǎn)生熒光，熒光強(qiáng)度If 與入射光強(qiáng)度有下面的關(guān)系：If = f Ia= f （I0 - I ）Ia為吸收的輻射強(qiáng)度I0為入射光強(qiáng)度I 為透射光 If = f （I0- I010-A ） = f I0 （1-10-A ）I = I010-A第31頁，共61頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)56分，星期四當(dāng)A0.05時(shí)，方括號中其它各項(xiàng)與第一項(xiàng)相比可忽略不計(jì)，上式簡化 If = 2.3 f I0A =2.3 f I0bc將上式展開第32頁，共61頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)56分，星期四當(dāng)A0

13、.05時(shí)， If與 f 、I0、 和c 有關(guān)。對一給定物質(zhì)，當(dāng)激發(fā)光波長和強(qiáng)度一定時(shí)， f 、I0、 和b為常數(shù)，合并為K If = KC Ip = KC定量分析依據(jù)第33頁，共61頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)56分，星期四熒光強(qiáng)度與物質(zhì)濃度呈線形關(guān)系， If=KC只有在濃度低時(shí)使用，熒光物質(zhì)測定的是微量或痕量組分，靈敏度高濃度高時(shí)， If與C不呈線形關(guān)系，有時(shí)C增大， If反而降低。因?yàn)楣?中后面影響；有時(shí)發(fā)生熒光猝滅效應(yīng)第34頁，共61頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)56分，星期四熒光猝滅 熒光物質(zhì)與溶劑或其它物質(zhì)之間發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，或發(fā)生碰撞后使熒光強(qiáng)度下降(熒光效率f 下降)稱

14、為熒光猝滅。使熒光強(qiáng)度降低的物質(zhì)稱為熒光猝滅劑第35頁，共61頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)56分，星期四氧分子及產(chǎn)生重原子效應(yīng)的溴化物、碘化物等都是常見的熒光猝滅劑碰撞猝滅 M +激 M* M* + Q M + Q +熱自熄滅熒光物質(zhì)發(fā)射的熒光被熒光物質(zhì)的基態(tài)分子所吸收，即自吸收現(xiàn)象第36頁，共61頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)56分，星期四（一）熒光分析儀器 主要由光源、單色器、樣品池、檢測器和顯示器組成。五、熒光和磷光分析儀器第37頁，共61頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)56分，星期四光源第一單色器液池檢測器第二單色器檢測器放大器及記錄器 ex em與分光光度計(jì)有兩點(diǎn)不同兩個(gè)

15、單色器檢測器與激發(fā)光互成直角I0I第38頁，共61頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)56分，星期四1、光源激發(fā)光源一般要求比吸收測量中的光源有更大的發(fā)射強(qiáng)度；適用波長范圍寬熒光計(jì)中，常使用鹵鎢燈作光源熒光光度計(jì)中常用高壓汞燈和氙弧燈應(yīng)用最廣泛的一種光源，可發(fā)射250800nm很強(qiáng)的連續(xù)光源利用汞蒸氣放電發(fā)光的光源；常用其發(fā)射365 nm、405 nm、 436 nm 三條譜線以365 nm 的譜線最強(qiáng)第39頁，共61頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)56分，星期四2、單色器熒光計(jì)用濾光片作單色器，熒光計(jì)只能用于定量分析，不能獲得光譜大多數(shù)熒光光度計(jì)一般采用兩個(gè)光柵單色器，有較高的分辨率，能掃描

16、圖譜，既可獲得激發(fā)光譜，又可獲得熒光光譜第一單色器作用：分離出所需要的激發(fā)光，選擇最佳激發(fā)波長 ex 第二單色器作用：濾掉一些雜散光和雜質(zhì)所發(fā)射的干擾光，用來選擇測定用的熒光波長 em。第40頁，共61頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)56分，星期四3、樣品池盛放測定溶液，通常是石英材料的方形池，四面都透光，只能用手拿棱或最上邊4、檢測器把光信號轉(zhuǎn)化成電信號, 放大, 直接轉(zhuǎn)成熒光強(qiáng)度熒光的強(qiáng)度一般較弱，要求檢測器有較高的靈敏度，熒光光度計(jì)采用光電倍增管熒光分析比吸收光度法具有高得多的靈敏度，是因?yàn)闊晒鈴?qiáng)度與激發(fā)光強(qiáng)度成正比，提高激發(fā)光強(qiáng)度可 大大提高熒光強(qiáng)度5、讀出裝置掃描激發(fā)光譜和發(fā)射光譜

17、記錄, 結(jié)果打印輸出第41頁，共61頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)56分，星期四（二）激發(fā)光譜和熒光、磷光光譜激發(fā)光譜：熒光和磷光均為光致發(fā)光，合適的激發(fā)光波長需根據(jù)激發(fā)光譜確定I ex固定em 熒光波長獲得方法：固定em不變，改變ex，測定它的熒光強(qiáng)度，以I 為縱坐標(biāo)， ex為橫坐標(biāo)得左圖，即熒光物質(zhì)的激發(fā)光譜，確定最大ex第42頁，共61頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)56分，星期四I em固定 ex 激發(fā)光波長獲得方法：固定ex不變，改變em，以I 為縱坐標(biāo)， em為橫坐標(biāo)得左圖，即熒光物質(zhì)的發(fā)射光譜從曲線上找出最大的 em發(fā)射光譜：熒光、磷光光譜第43頁，共61頁，2022年，5

18、月20日，18點(diǎn)56分，星期四磷 熒 激圖吸收峰熒光峰磷光峰第44頁，共61頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)56分，星期四激發(fā)光譜和熒光光譜熒光強(qiáng)度波長（nm)300400500硫酸奎寧的兩個(gè)光譜Iex,maxfl,max第45頁，共61頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)56分，星期四（三）磷光分析儀器與熒光分析儀器相似，主要差異如下：1. 試樣室試樣需在液氮溫度（77K，-196）下測定低溫磷光（將液池放在盛放液氮的杜瓦瓶內(nèi)）固體表面室溫磷光分析需特制試樣室2. 磷光鏡有些物質(zhì)既可產(chǎn)生熒光，又能產(chǎn)生磷光。用機(jī)械切光裝置磷光鏡區(qū)別熒光和磷光。利用熒光壽命短，磷光壽命長消除熒光干擾。第46頁，

19、共61頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)56分，星期四六、 熒光、磷光分析及應(yīng)用（一）定量分析方法 定量分析依據(jù) If = KC Ip = KC1. 標(biāo)準(zhǔn)曲線法最常用的定量分析方法濃度 C1 C2 C3 C4 C5 Cx熒光強(qiáng)度 If1 If2 If3 If4 If5 Ifx If IfxCxC第47頁，共61頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)56分，星期四2. 熒光猝滅法把熒光猝滅用在定量分析上，具有較高的靈敏度和選擇性熒光物質(zhì) M 與猝滅劑 Q 生成不發(fā)熒光的基態(tài)配合物MQ M + Q = MQ（非熒光物質(zhì)）第48頁，共61頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)56分，星期四猝滅劑加入前的熒光

20、強(qiáng)度猝滅劑加入后試液的熒光強(qiáng)度常數(shù)猝滅劑濃度I前/I后與C(Q) 有線性關(guān)系，可求猝滅劑含量經(jīng)推導(dǎo)得出：第49頁，共61頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)56分，星期四標(biāo)準(zhǔn)曲線法I前/I后xCQxCQI前/I后第50頁，共61頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)56分，星期四3. 比較法比較簡單如果試樣數(shù)量不多，可用比較法進(jìn)行測量配一標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為Cs， Cs與未知液濃度Cx相近，并在相同條件下測定它們的熒光強(qiáng)度 未知液 If x = KCx 標(biāo)準(zhǔn)液 If s = KCs 比較第51頁，共61頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)56分，星期四（二）熒光分析法的應(yīng)用熒光分析法具有靈敏度高、取樣量少等

21、優(yōu)點(diǎn)1. 無機(jī)化合物的分析與有機(jī)化合物生成發(fā)熒光的有機(jī)配合物后，進(jìn)行熒光分析的元素達(dá)70多種，其中較常采用熒光法測定的元素有：Be、Al、B、Ga、Se、Mg、Zn、Cd及某些稀土元素?zé)晒忖绶ㄒ彩菬晒夥治鲋薪?jīng)常采用的方法?？刹捎脽晒忖绶ㄩg接測定的離子有：F-、S2-、Co2+、Ni2+、Cu2+等第52頁，共61頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)56分，星期四2. 有機(jī)化合物的分析芳香族化合物因具有共軛的不飽和體系，多數(shù)能發(fā)熒光；可直接用熒光法測定。對于具有致癌活性的多環(huán)芳烴熒光分析法是最主要的測定方法為提高測定的靈敏度，有時(shí)也將芳香族化合物與適當(dāng)試劑反應(yīng)之后進(jìn)行測定可測定結(jié)構(gòu)復(fù)雜的大量有

22、機(jī)物質(zhì)，如：各種維生素、葉綠素、氨基酸、蛋白質(zhì)、酶和輔酶以及各種藥物、毒物和農(nóng)藥等第53頁，共61頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)56分，星期四例：3，4 苯并芘3，4 苯并芘為強(qiáng)致癌物質(zhì)煤炭、石油、天然氣等燃料不完全燃燒以及吸煙、焚燒垃圾都會產(chǎn)生3，4 苯并芘，汽車尾氣也是主要來源食品加工過程也會產(chǎn)生3，4 苯并芘，尤其是煙熏、油炸、烘烤食品分析測定：用環(huán)己烷將3，4 苯并芘從試樣中提取出來，用堿將提取液的脂肪類物質(zhì)皂化，然后用色譜法分離純化，用95%C2H5OH稀釋，用熒光分光光度計(jì)測定相對熒光強(qiáng)度進(jìn)行定量第54頁，共61頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)56分，星期四例： VB2又稱核黃素，是一種生長促進(jìn)劑，常存在于動物肝臟、肉類、蛋黃、豆類、花生、蘑菇和海藻中， VB2易溶于強(qiáng)酸或強(qiáng)堿性溶液。 在低濃度情況下，I= KC，I與C呈線性關(guān)系，在p