藏紅花提取液對(duì)慢性高眼壓兔視網(wǎng)膜的影響

1、藏紅花提取液對(duì)慢性高眼壓兔視網(wǎng)膜的影響摘要LI的建立兔慢性高眼壓模型，分析藏紅花提取液對(duì)慢性高眼壓兔眼視 網(wǎng)膜的作用效果。方法選取120只新西蘭家兔，隨機(jī)分為對(duì)照組、高眼壓模型組以 及干預(yù)治療組，每組40只共80眼。高眼壓模型組以及干預(yù)治療組家兔通過(guò)注射復(fù)方卡波姆溶 液建立慢性高眼壓模型，干預(yù)治療組家兔每日靜脈推注藏紅花提取液。在建立模型后的7d、14 d以及4周，各組分別處死10只動(dòng)物，利用光鏡觀察視網(wǎng)膜形態(tài)學(xué)變化，并檢測(cè)視網(wǎng) 膜超氧化物歧化酶(S0D)、丙二醛(MDA)以及視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(RGCs)水平，對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué) 分析。結(jié)果高眼壓模型組及干預(yù)治療組視網(wǎng)膜均發(fā)生腫脹、萎縮，與高眼壓

2、模型組相 比，干預(yù)治療組損傷程度較輕;建立模型7d時(shí)，高眼壓模型組及干預(yù)治療組SOD值明顯低于對(duì) 照組，MDA含量顯著高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P 0. 05),但干預(yù)治療組指標(biāo)變化幅 度明顯小于高眼壓模型組(P 0. 05);建立模型14 d時(shí)，高眼壓模型組及干預(yù)治療組SOD明 顯恢復(fù)，接近正常水平，MDA含量仍高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P 0. 05),高眼壓模型組RGCs數(shù)目為(62. 78?10. 24)個(gè)，顯著低于對(duì)照組及干預(yù)治療組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P 0. 05)。結(jié)論藏紅花提取液能夠保護(hù)慢性高眼壓兔眼視網(wǎng)膜功能，可作為青光眼的有 效治療藥物。關(guān)鍵詞藏紅花;眼高壓；視網(wǎng)

3、膜;超氧化物歧化酶；丙二醛;視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞中圖分類號(hào)R285. 5 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A 文章編號(hào)1673-7210 (2014) 09(a)-0004-04Abstract Objective To establish a rabbit model of chronic ocular hypertension,analyze saffron extract effects for retina of rabbits with chronic high intraocularpressure Methods 120 New Zealand rabbits were randomly divided

4、into control group,model group and high I0P intervention group, 40 cases (80 eyes) in each groupOcular model group and intervention group were established rabbits chronic ocularhypertension model by injecting carbomer solution, rabbits in the intervention group were given daily intravenous injection

5、 of saffron extract After model establishmentfor 7 d, 14 d and 4 week, each group were sacrificed 10 animals Retinal morphological changes were observed by light microscope, then superoxide dismutase (SOD),malondialdehyde (MDA), retinal ganglion cells (RGCs) levels were detected The results were ana

6、lyzed Results The retinal had swelling, shrinking in theintervention group and model group, compared with the model group, the degree ofdamage was less in the intervention group After model establishment for 7 d, SODlevels in the model group and intervention group were significant lower than thecont

7、rol group, and MDA levels in the model group and intervention group were significant higher than the control group, with statistically significant difference (P 0.05), but the rangeability in the intervention group was less than the model group (P 003) After model establishment for 14 d, SOD levels

8、in the model group and intervention group had recovered to normal level, but MDA levels still higher than the control group, with statistically significant difference (P 0. 05) Thenumber of RGCs in the model group was (62.78?10.24), which was significantly lower than the intervention group and the c

9、ontrol group, with statistically significantdifference (P 0. 05),具有可比性。1. 2主要試劑及儀器復(fù)方卡波姆溶液（上海申興制藥廠生產(chǎn)的卡波姆-940+山西雙鶴藥業(yè)生產(chǎn)的地塞 米松）；丁卡因滴眼液（遼亍中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)室）；氯霉素滴眼液（武漢天天明藥業(yè)有限 責(zé)任公司，批號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字H34024067）;速眠新注射液（解放軍農(nóng)牧大學(xué)軍事獸醫(yī)研 究所）；藏紅花（遼宇中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院藥劑科）；S0D分析試劑盒（南京建成生物工 程研究所）；MDA分析試劑盒（南京建成生物工程研究所）；立式壓力蒸汽滅菌器、電 子天平、低溫高速離心機(jī)、流式細(xì)胞

10、分析儀、分光光度計(jì)以及共聚焦顯微鏡等均由 遼宇中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供。1.3藏紅花提取液制備稱取15 g藏紅花，加蒸憎水煮沸后過(guò)濾2次，減壓濃縮濾液，添加950 mL/L 乙醇（濃縮濾液與乙醇比例為1?3）,沉淀24 h,再次過(guò)濾，濾液經(jīng)減壓蒸鐳對(duì)乙醇 進(jìn)行回收后，稀釋到100 mL裝瓶，蒸汽滅菌后放置在冰箱中（-4?）保存，實(shí)驗(yàn)時(shí)稀 釋成50 g/Lo1.4模型制備參照文獻(xiàn)5進(jìn)行慢性高眼壓模型制備。高眼壓模型組以及干預(yù)治療組新西蘭 家兔耳緣靜脈注射速眠新（劑量標(biāo)準(zhǔn)為每公斤0.1 mL）,全身麻醉后應(yīng)用5 g/LT 卡因滴眼液行雙眼表面麻醉，用1 mL注射器在角膜緣穿刺形成小針孔，在小針孔 對(duì)側(cè)

11、角膜緣穿刺，抽出0.2 mL房水，注入復(fù)方卡波姆溶液0.2 mL,制成慢性高眼 壓模型。實(shí)驗(yàn)期間眼壓范圍應(yīng)為32, 39 mm Hg6 （1 mm H薩0. 133 kPa）,并持續(xù)4 周。對(duì)照眼僅采取前房穿刺。1.5用藥方法每日上午8?00, 9?00干預(yù)治療組固定新西蘭白兔后耳緣靜脈注射藏紅花提取 液，劑量為40 mg/kg；I0i眼壓模型組和對(duì)照組給予生理鹽水，每日1次。高眼壓模 型組和干預(yù)治療組每日測(cè)量眼壓，如果出現(xiàn)眼壓低于32 mm Hg,則持續(xù)注入復(fù)方 卡波姆溶液。1個(gè)月為1個(gè)療程。1. 6檢測(cè)指標(biāo)及方法成功建模后7 d、14 d及4周各組分別選取10只動(dòng)物進(jìn)行空氣栓塞處死，處 死

12、動(dòng)物后立即摘除雙側(cè)眼球，去除晶狀體及玻璃體，剝?nèi)∫暰W(wǎng)膜，觀察視網(wǎng)膜的形 態(tài)學(xué)改變，并檢測(cè)SOD、MDA水平以及RGCso1.6.1視網(wǎng)膜形態(tài)學(xué)觀察摘除大鼠眼球，應(yīng)用4%中性甲醛溶液進(jìn)行固定后， 剪除角膜及晶狀體，采用乙醇脫水以及二屮苯透明，石蠟包埋后釆取矢狀切片，常 規(guī)蘇木精-伊紅染色，光鏡下觀察視網(wǎng)膜形態(tài)學(xué)變化。SOD活性檢測(cè) 應(yīng)用黃卩票吟氧化酶法。視網(wǎng)膜組織勻漿經(jīng)離心(3500 r/min)處理10 min,留取上清液檢測(cè)SOD活性。測(cè)定管及對(duì)照管分別加入試劑或 樣品，充分混勻后放置在37?水浴箱中作用40 min,加入顯色劑后混勻，靜置10 min倒入光徑比色杯中，在波長(zhǎng)550 nm處用

13、蒸憾水調(diào)零，比色測(cè)定各樣本A值， 依據(jù)公式計(jì)算SOD活性。MDA含量檢測(cè) 應(yīng)用TBA比色法。離心(3500 r/min)處理視網(wǎng)膜勻漿10 min,取上清液待測(cè)。標(biāo)準(zhǔn)管、標(biāo)準(zhǔn)空白管以及測(cè)定管中分別加入TBA或樣品，旋 渦混勻器混勻后，用保鮮膜扎緊試管口，刺一小孔，放置在水浴箱中(95?)作用40 min后取出，流水冷卻，離心(3500 r/min)處理10 min,取上清液置入光徑比色 杯，在波長(zhǎng)532 nm處采取蒸憎水調(diào)零處理，比色測(cè)定A值，按公式計(jì)算MDA含 量。RGCs數(shù)目檢測(cè) 慢性高眼壓持續(xù)4周時(shí)，新西蘭白兔應(yīng)用大劑量速眠新 注射液進(jìn)行耳緣靜脈內(nèi)注射，深度麻醉后，摘取眼球，縫線定位角膜

14、緣的6點(diǎn)以及 12點(diǎn)鐘位置，剪除角膜、虹膜、晶體以及玻璃體，將剩余眼球壁置于Bouin液中 固定，24 h后應(yīng)用二甲苯進(jìn)行透明處理，常規(guī)浸蠟、石蠟包埋、切片(均通過(guò)視乳 頭、6點(diǎn)鐘以及12點(diǎn)鐘方位)、染色以及封片，制成光鏡切片后，利用HPIAS-1000 圖象測(cè)量系統(tǒng)訃數(shù)RGCs數(shù)LI,同時(shí)對(duì)視乳頭兩側(cè)5 cm范圍內(nèi)的RGCs數(shù)LI進(jìn)行測(cè) 量。7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)?標(biāo)準(zhǔn)差（x?s） 表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn);相關(guān)性分 析用Pearson檢驗(yàn)，以P 0. 05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2結(jié)果1視網(wǎng)膜形態(tài)學(xué)

15、改變建模14 d后觀察各組視網(wǎng)膜形態(tài)學(xué)改變，對(duì)照組:視網(wǎng)膜組織結(jié)構(gòu)清晰，細(xì)胞 核呈圓形或卵圓形，邊緣清晰（圖1A）;高眼壓模型組:視網(wǎng)膜全層高度水腫，神經(jīng) 纖維層、外內(nèi)叢狀層明顯水腫，細(xì)胞核腫脹，周圍可見空泡變性（圖1B）;治療干預(yù) 組:視網(wǎng)膜內(nèi)叢狀層發(fā)生腫脹，視網(wǎng)膜可見輕度萎縮，與高眼壓模型組相比，程度 較輕，內(nèi)外核層密度較大（圖10。3討論高眼壓作為青光眼的主要獨(dú)立危險(xiǎn)因素7-10,能夠顯著增加致盲性眼病青光 眼發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。而隨著臨床關(guān)于青光眼的深入研究，其相關(guān)病理機(jī)制研究證實(shí)，青光 眼視神經(jīng)損害的主要機(jī)制為視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞發(fā)生進(jìn)行性死亡，視神經(jīng)纖維發(fā)生丟 失。U前已知的對(duì)青光眼視神經(jīng)節(jié)細(xì)胞

16、凋亡具有促進(jìn)作用的因素主要為神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因 子剝奪、毒素興奮性增加、細(xì)胞內(nèi)鈣離子超載、一氧化氮代謝紊亂、氧自山基過(guò) 量、內(nèi)皮素增多、細(xì)胞凋亡基因表達(dá)上升以及自體免疫機(jī)制異常等11-13K并且 自山基對(duì)細(xì)胞衰老過(guò)程、小梁網(wǎng)細(xì)胞組成結(jié)構(gòu)以及退行性改變具有重要影響。II前 抑制視神經(jīng)細(xì)胞凋亡、保護(hù)視神經(jīng)已經(jīng)成為臨床防治青光眼的主要手段之一。SOD 作為抗過(guò)氧化物酶之一，能對(duì)超氧陰離子歧化反應(yīng)起催化作用，是活性氧的主要防 御屏障，SOD活性降低，將導(dǎo)致自山基堆積。MDA作為脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)指標(biāo)，能夠 損傷視網(wǎng)膜組織。中藥研究發(fā)現(xiàn)，藏紅花不但鎮(zhèn)靜、祛痰、解痙、活血效果顯著，而且具有良好 的抗氧化、保護(hù)神經(jīng)元作

17、用。藏紅花作為臨床常用中藥之一，主要功效為行氣活 血、祛瘀化痰?，F(xiàn)代研究證實(shí)14,藏紅花不僅能夠抗腫瘤、抗氧化、降血脂、改 善微循環(huán)，而且能夠清除自山基，具有強(qiáng)效超氧化物清除活性，能夠調(diào)節(jié)眼部血液 血循，恢復(fù)視網(wǎng)膜功能。藏紅花提取液有擴(kuò)張血管、改善微循環(huán)的作用，可改善慢 性高眼壓導(dǎo)致的視網(wǎng)膜視神經(jīng)缺血程度，顯著保護(hù)視神經(jīng)細(xì)胞15o本實(shí)驗(yàn)中，在建立兔慢性高眼壓模型的基礎(chǔ)上，檢測(cè)SOD活性、MDA含量以及 RGCs數(shù)目，通過(guò)與正常兔和模型兔比較，證實(shí)了藏紅花提取液能夠顯著減輕視網(wǎng)膜損傷程 度，提高SOD活性，降低MDA含量，顯著抑制視神經(jīng)細(xì)胞凋亡。綜上所述，藏紅花提取液能夠降低慢性高眼壓導(dǎo)致的視網(wǎng)

18、膜損傷，具有保護(hù)視 網(wǎng)膜功能的作用，值得臨床深入探討。參考文獻(xiàn)1葛堅(jiān)，白玉嬪青光眼手術(shù)治療進(jìn)展J.實(shí)用醫(yī)院臨床雜志，2010,7(6) :8-12.2孟凡嶺.青光眼研究進(jìn)展J.中國(guó)煤炭工業(yè)醫(yī)學(xué)雜志,2012, 15(8):1305- 1310.3郭斌，范欽華，王莉，等.藏紅花素對(duì)缺氧環(huán)境下Wistar大鼠視網(wǎng)膜 MUller細(xì)胞活性和膠質(zhì)纖維酸性蛋口表達(dá)的影響J.中華臨床醫(yī)師雜志：電子版， 2012, 6(12):231-235.4黃偉革，包輝英，吳國(guó)忠.中藥治療青光眼研究進(jìn)展J.醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2011, 30(2):223-226.5王昌鵬，楊新光，王曉娟，等.兔慢性高眼壓模型的建立J.第四軍醫(yī)大 學(xué)學(xué)報(bào)，2004, 25(7) : 606-609.李潔，黃麗娜，曾平.口疾藜皂昔對(duì)慢性高眼壓兔視網(wǎng)膜SOD活性和MDA含