醫(yī)療器械無菌實驗課件

1、醫(yī)療器械無菌實驗主講人：王文慶山東省醫(yī)療器械產(chǎn)品質(zhì)量檢驗中心2007年6月概 述實驗器材實驗準(zhǔn)備實驗方法抑菌驗證總 結(jié)概 述無菌醫(yī)療器械滅菌控制中的微生物檢驗包括醫(yī)療器械滅菌過程確認(rèn)中的微生物檢驗，常規(guī)生產(chǎn)過程控制中的微生物檢驗，以及產(chǎn)品放行中的微生物檢驗 。本文以GB/T 14233.2-2005 醫(yī)用輸液、輸血、注射器具檢驗方法 第二部分：生物試驗方法中“3.無菌實驗”部分，以及中華人民共和國藥典 2005年版二部附錄XI H“無菌檢查法”為依據(jù)，對醫(yī)療器械產(chǎn)品放行中的無菌實驗進行總結(jié)概述?！盁o菌”的概念：圍繞無菌有兩個英文單詞，sterility和sterile。前者定義為無存活微生物的

2、程度，用于滅菌要求；后者定義為無存活微生物，用于產(chǎn)品名稱和包裝標(biāo)識。在我國的諸多標(biāo)準(zhǔn)中，都將這兩個單詞混稱為“無菌”。對于一個給定的滅菌過程，無論滅菌的程度如何，微生物總是難免以一個有限概率存活下來 ，這種存活概率由微生物的數(shù)量、抗性以及在處理過程中微生物所處的環(huán)境來確定。 “無菌”是指微生物存活概率低于10-6； “無菌醫(yī)療器械”表示為醫(yī)療器械中，有殘存微生物的醫(yī)療器械的概率小于10-6，即一百萬件中不多于1件。這是醫(yī)療器械公認(rèn)的無菌保證水平?！盁o菌實驗”的概念：無菌實驗是用于檢驗一次性使用無菌醫(yī)療器械是否染有活菌的一種方法。本實驗系將醫(yī)療器械或其浸提液接種于培養(yǎng)基內(nèi)，以檢驗供試品是否有細(xì)菌

3、和真菌污染，其全過程必須嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作，防止微生物污染，同時也應(yīng)避免在抑菌條件下進行實驗操作。3. 試劑75%(V/V)乙醇、新潔爾滅(1：1000)溶液或其他適宜消毒溶液， 2mol/L鹽酸溶液、2mol/L氫氧化鈉溶液等；質(zhì)量濃度為9g/L的無菌氯化鈉溶液、其他符合2005年版中國藥典附錄XI H“無菌檢查法”要求的稀釋液和沖洗液（0.1%的蛋白胨水溶液和pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液等）。實驗準(zhǔn)備 1. 器具滅菌1.1 移液管、刻度吸管在管口上端內(nèi)，松松地塞少許棉花，然后放于吸管筒內(nèi)或牛皮紙袋內(nèi)，蓋嚴(yán)，滅菌備用。1.2 試管、離心管、三角瓶等在管(瓶)口塞上海棉膠專用塞或紗布棉塞，塞子

4、應(yīng)塞進管口內(nèi)2/3處，用牛皮紙將管口包扎緊，滅菌備用。2. 培養(yǎng)基的準(zhǔn)備2.1 培養(yǎng)基的制備硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基用于培養(yǎng)好氧菌、厭氧菌，改良馬丁培養(yǎng)基用于培養(yǎng)真菌。一般采用商品脫水培養(yǎng)基，臨用時按照使用說明書進行配制，需注意培養(yǎng)基的PH值應(yīng)符合規(guī)定，否則必須校正后，滅菌使用。制備好的培養(yǎng)基應(yīng)保存在2-25、避光的環(huán)境。培養(yǎng)基若保存于非密閉容器中，一般在三周內(nèi)使用。若保存于密閉容器中，一般可在一年內(nèi)使用。對于硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基，在供試品接種前，其氧化層的高度不得超過培養(yǎng)基深度的1/5。否則，須經(jīng)100水浴加熱至粉紅色消失（不超過20分鐘），迅速冷卻，只限加熱一次，并應(yīng)防止被污染。無菌試驗培養(yǎng)時

5、間結(jié)束時，氧化層高度不得超過培養(yǎng)基深度的1/2。2.2 培養(yǎng)基的無菌性檢查臨用前須對配制好的培養(yǎng)基進行無菌性檢查，每批培養(yǎng)基隨機取不少于 5 支（瓶），培養(yǎng)14天，證明無菌生長后方可使用。 2.3 培養(yǎng)基靈敏度檢查 2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)菌株金黃色葡萄球菌 CMCC（B）26 003銅綠假單胞菌 CMCC（B）10 104枯草芽孢桿菌 CMCC（B）63 501生孢梭菌 CMCC（B）64 941白色念珠菌 CMCC（F）98 001黑曲霉 CMCC（F）98 0032.3.3 培養(yǎng)基接種及結(jié)果判斷 取每管裝量為12mL的硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基9支，分別接種小于100cfu的金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞

6、菌、枯草芽孢桿菌、生孢梭菌各2支，另1支不接種作為空白對照，培養(yǎng)3天；取每管裝量為9mL的改良馬丁培養(yǎng)基5支，分別接種小于100cfu的白色念珠菌、黑曲霉各2支，另1支不接種作為空白對照，培養(yǎng)5天。逐日觀察結(jié)果。空白對照管應(yīng)無菌生長，若加菌的培養(yǎng)基管均生長良好，判該培養(yǎng)基的靈敏度檢查符合規(guī)定。3. 無菌室要求 無菌醫(yī)療器械生產(chǎn)企業(yè)應(yīng)將微生物檢測作為檢測工作的重點，而微生物實驗室承擔(dān)著滅菌驗證、環(huán)境監(jiān)控、產(chǎn)品放行等一系列重要工作，所以說無菌醫(yī)療器械生產(chǎn)企業(yè)擁有一個微生物實驗室是十分必要的 。微生物實驗室應(yīng)滿足無菌實驗對工作環(huán)境的要求，環(huán)境潔凈度10000級，無菌室操作臺或超凈工作臺局部應(yīng)符合潔凈

7、度100級單向流空氣區(qū)域要求。應(yīng)定期檢查工作臺面空氣菌落數(shù)，方法如下：取直徑約90mm培養(yǎng)皿，無菌操作注入融化的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基約20mL，在30-35培養(yǎng)48h證明無菌后，取3只培養(yǎng)皿在無菌室操作臺或超凈工作臺平均位置打開上蓋，暴露 30min后蓋好置30-35培養(yǎng)48h后取出檢查。3只培養(yǎng)皿上生長的菌落數(shù)平均應(yīng)不超過l個（ 100級清潔度要求）。無菌試驗過程中應(yīng)檢查空氣中的菌落數(shù)，方法同上。在試驗開始進行時打開培養(yǎng)皿蓋，至試驗結(jié)束后蓋好，按照上法培養(yǎng)，應(yīng)符合上述要求。 無菌操作臺或超凈工作臺潔凈度應(yīng)達(dá)到100級；溫度為18 26 ；相對濕度為45% 65% ；垂直層流風(fēng)速0.3m/s , 水

8、平層流風(fēng)速0.4m/s；不同級別潔凈區(qū)及潔凈區(qū)之間的靜壓差5Pa, 潔凈區(qū)及室外之間的靜壓差10Pa ；粒徑5m的塵粒數(shù)不得存在，0.5m的塵粒數(shù)3500個/m3；空氣流量應(yīng)控制在0.751.0m/s；細(xì)菌沉降菌數(shù)平均1cfu/皿注：以上各指標(biāo)參見YY0033-2000無菌醫(yī)療器具生產(chǎn)管理規(guī)范。4.試驗前準(zhǔn)備培養(yǎng)基在移入緩沖間前應(yīng)先編號，并用0.1%新潔爾滅或(V/V)酒精棉等擦拭瓶(管)外壁，然后連同其他用具(包括無菌衣、帽、口罩等) 移入緩沖間；供試品移入前，外包裝須進行消毒處理。操作人員用肥皂、自來水洗雙手，關(guān)閉紫外燈，進入緩沖間，換拖鞋，再用75%(V/V)酒精棉等擦手，穿戴衣、帽、口

9、罩。將所需物品剝掉牛皮紙，移入無菌操作室，準(zhǔn)備進行實驗。每次實驗所用物品必須計劃好，并有備用物。實驗方法1.薄膜過濾法2.直接接種法1. 薄膜過濾法1.1 供試液制備1.1.1 供試品數(shù)量 同一批號3個-11個單位供試品。（注：不同類型醫(yī)療器械可根據(jù)具體情況參照采用。）1.1.2 浸提介質(zhì) 質(zhì)量濃度為9g/L的無菌氯化鈉溶液或其他符合2005年版中國藥典附錄XI H“無菌檢查法”要求的稀釋液和沖洗液。1.1.3 供試液制備方法根據(jù)供試品具體特性選擇下列適用方法：1) 管類器具：按管內(nèi)表面積每10cm2流過管內(nèi)腔1mL浸提介質(zhì)，流量約為10mL/min。2) 容器類器具：容器內(nèi)已裝有液體的可直接

10、抽取容器內(nèi)液體為供試液；空容器按容器內(nèi)表面積每10cm2加入浸提介質(zhì)lmL，振搖數(shù)次。3) 實體類器具：實體類器具按表面積每10cm2 加入浸提介質(zhì)lmL，振搖數(shù)次。制備供試液時，應(yīng)使浸提介質(zhì)充分洗提供試品的浸提表面。供試液制備應(yīng)按無菌操作法進行，在制備后2h內(nèi)使用。1.3 培養(yǎng)及觀察陽性對照培養(yǎng)4872小時應(yīng)生長良好；陰性對照不得有菌生長；細(xì)菌培養(yǎng)基在3035培養(yǎng)，真菌培養(yǎng)基在23-28培養(yǎng)，各培養(yǎng)14天。培養(yǎng)期間應(yīng)逐日觀察并記錄是否有菌生長。如果在接種后、或在在培養(yǎng)過程中培養(yǎng)基出現(xiàn)渾濁，培養(yǎng)14天后，不能從外觀上判斷有無微生物生長，可取該培養(yǎng)液適量轉(zhuǎn)種至同種新鮮培養(yǎng)基中或劃線接種于斜面培養(yǎng)

11、基上，細(xì)菌培養(yǎng) 2 天、真菌培養(yǎng) 3 天。觀察接種的同種新鮮培養(yǎng)基是否再出現(xiàn)渾濁或斜面是否有菌生長，或取培養(yǎng)液涂片，染色，鏡檢，判斷是否有菌。1.4 結(jié)果判斷當(dāng)陽性對照顯渾濁并確有細(xì)菌生長時，可根據(jù)觀察所得的結(jié)果判定。如細(xì)菌及真菌培養(yǎng)基均為澄清或雖顯渾濁但經(jīng)證明并非有菌生長，判供試品符合規(guī)定。如細(xì)菌及真菌培養(yǎng)基中任何1個顯渾濁并證明為有菌生長，應(yīng)重新取同量供試品，依法重試，若無菌生長，判供試品符合規(guī)定；若有菌生長，判供試品不符合規(guī)定。2.2 接種培養(yǎng)基取符合直接接種法培養(yǎng)基用量要求的硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基（每管裝量不少于15mL）和改良馬丁培養(yǎng)基（每管裝量不少于10mL）各10管，取上述制備的供

12、試品，在近火焰上以右手握拳，小指為主拔開培養(yǎng)基管的塞子，管口通過火焰， 移至火焰下側(cè)，沿著培養(yǎng)基管壁接入供試品（體積不得大于培養(yǎng)基體積的10%），輕輕搖勻。取硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基和改良馬丁培養(yǎng)基各1管，利用9g/L的氯化鈉溶液代替供試品如法操作，作為陰性對照。 取硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基1管，接入供試品，然后再接入小于100cfu的金黃色葡萄球菌，作為陽性對照。2.3 培養(yǎng)及觀察 同1.32.4 結(jié)果判斷 同1.4 抑菌驗證對未知或可疑的供試品，在進行無菌實驗前，應(yīng)對供試品進行抑菌性驗證實驗，以確認(rèn)供試品在該實驗條件下無抑菌活性或其抑菌活性可以忽略不計，從而證明所采用的無菌實驗方法適合于該供試品的

13、無菌檢驗。 若確認(rèn)供試品在該實驗條件下存在抑菌作用，應(yīng)采取措施消除其抑菌作用，重新進行驗證。抑菌性驗證實驗可在無菌實驗前，也可與無菌實驗同時進行。同無菌實驗相對應(yīng)，其方法也可分為薄膜過濾法和直接接種法，對應(yīng)的實驗條件，包括單個容器接種供試品的體積和培養(yǎng)基的體積等也應(yīng)該是一致的。1. 直接接種法與培養(yǎng)基靈敏度檢查同法制備菌液，取硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基8管（每管裝量不少于15mL），接入小于100cfu的金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、生孢梭菌各2管。取符合直接接種法培養(yǎng)基用量要求的改良馬丁培養(yǎng)基4管（每管裝量不少于10mL），分別接入小于100cfu的白色念珠菌、黑曲霉各2管。其中1管

14、接入供試品（體積不得大于培養(yǎng)基體積的10%），另1管作為對照。細(xì)菌培養(yǎng)基在30-35培養(yǎng)3天，真菌培養(yǎng)基在23-28培養(yǎng)5天。2. 薄膜過濾法取規(guī)定量的供試品進行薄膜過濾，并加入小于100cfu的實驗菌，將培養(yǎng)基加入集菌培養(yǎng)器內(nèi)；另取一裝有相同體積培養(yǎng)基的集菌培養(yǎng)器，加入實驗菌作為對照，按規(guī)定溫度培養(yǎng)3-5天。各實驗菌同法操作。3. 結(jié)果判斷與對照管比較，如含供試品各容器中的試驗菌均生長良好，則供試品的該檢驗量在該檢驗條件下無抑菌作用或其抑菌作用可以忽略不計，照此檢查法和檢查條件進行供試品的無菌檢查。如含供試品的任一容器中微生物生長微弱、緩慢或不生長，則供試品的該檢驗量在該檢驗條件下有抑菌作用

15、，可采用增加沖洗量，或增加培養(yǎng)基的用量，或使用薄膜過濾法，或使用中和劑或滅活劑如-內(nèi)酰胺酶、對氨基苯甲酸等方法，消除供試品的抑菌作用，并重新進行方法驗證后，再進行無菌實驗?？?結(jié) 無菌實驗是微生物學(xué)檢驗工作的重要組成部分。當(dāng)今，眾多的無菌醫(yī)療器械生產(chǎn)企業(yè)把GB/T 14233.2-2005 醫(yī)用輸液、輸血、注射器具檢驗方法 第二部分：生物試驗方法作為無菌檢驗的標(biāo)準(zhǔn)。 GB/T 14233.2-2005對無菌醫(yī)療器械產(chǎn)品的供試品數(shù)量及制備方法等做了詳細(xì)規(guī)定。而對于接種方法、培養(yǎng)和觀察以及結(jié)果判斷等，完全等同采納了中華人民共和國藥典 2005年版二部附錄XI H“無菌檢查法”的技術(shù)要求和方法。本文在綜合考慮如上依據(jù)的基礎(chǔ)上，對本檢驗中心從事的“無菌實驗”部分進行了概述