高效液相色譜法測(cè)定雙黃連粉針劑中綠原酸和黃芩苷的含量

1、高效液相色譜法測(cè)定雙黃連粉針劑中綠原酸和黃芩苷的含量【關(guān)鍵詞】雙黃連粉針劑；,綠原酸；,黃芩苷；,高效液相色譜法；,梯度洗脫摘要：目的建立高效液相色譜HPL法同時(shí)測(cè)定雙黃連粉針劑中綠原酸和黃芩苷外標(biāo)定量測(cè)定方法。方法用自制813混合型烷基鍵合硅膠柱(5，4.6150)為固定相，甲醇和水溶液用磷酸調(diào)pH2.7為流動(dòng)相，在813柱上梯度洗脫，流速為1lin-1，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為323n。結(jié)果綠原酸和黃芩苷的線性范圍分別為4.0100.0gl-1和8.6215.0gl-1；相關(guān)系數(shù)分別為0.99989和0.99997；加樣回收率分別為100.53%和99.94%；檢測(cè)限分別為0.014gl-1和0.0

2、20gl-1；精細(xì)度實(shí)驗(yàn)RSD分別為1.12%和0.61%；重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)RSD分別為1.14%和0.73%，穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)RSD分別為0.89%和0.54%；4批樣品中綠原酸的含量在1.5771.753gl-1，黃芩苷的含量在26.0228.68gl-1。結(jié)論該方法簡(jiǎn)便，快速，準(zhǔn)確，靈敏度高，重現(xiàn)性好，本錢低，可用于雙黃連粉針劑的質(zhì)量控制。關(guān)鍵詞：雙黃連粉針劑；綠原酸；黃芩苷；高效液相色譜法；梯度洗脫QuantitativeDeterinatinfhlrgeniAidandBaialininShuanghuanglianPderInjetinbyHPLAbstrat：bjetiveTdevelpan

3、RP-HPLethdfrthedeterinatinfhlrgeniaidandbaialininShuanghuanglianpderinjetin.ethdsA813ixedalkyl(5，4.6150)bndsiliafrreversed-phaseHPLasprepared.ThebilephaseasH3Hphsphriaidslutin(pH2.7).Theflrateassetat1.0l/in.Thedetetinavelengthasat323n.hlrgeniaidandbaialinereseparatedbyHPLithgradeelutin.ResultsThelin

4、earityrangesfhlrgeniaidandbaialinere4.0100.0g/land8.6215.0g/lrespetively，therrelatineffiientsere0.99989and0.99997,theaveragereveriesfaddingsapleere100.53%and99.94%,detetinliitsere0.014g/land0.020g/l,theRSD(n=5)feasureentpreisintestere1.12%and0.61%,theRSD(n=5)freprduibilitybeteentestsere0.89%and0.54%

5、.ThententfhlrgeniaidinShuanghuanglianpderas1.5771.753g/l，andthatfbaialinas26.0228.68g/l.nlusinTheethdissiple,fast,aurate，sensitive,reprduibleandlst.ItisfitfrthequalityntrlfShuanghuanglianpder.Keyrds：Shuanghuanglianpder;hlrgeniaid;Baialin；HPL雙黃連粉針劑是供注射用的中藥制劑，由金銀花、黃芩和連翹組成，具有清熱解毒、辛涼解表的功能。主要成分為綠原酸、黃芩苷，質(zhì)

6、量控制多采用黃芩苷和綠原酸作為指標(biāo)。含量測(cè)定方法有紫外分光光度法1，2、高效毛細(xì)管電泳3，4及高效液相色譜法59等。由于該制劑成分中黃芩苷和綠原酸極性相差較大,故質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定分別測(cè)定二者含量。本實(shí)驗(yàn)采用自制813混合型烷基鍵合硅膠柱10，利用梯度洗脫，逐漸降低流動(dòng)相極性的方法不經(jīng)別離同時(shí)測(cè)定四批樣品中綠原酸和黃芩苷的含量，以期為該制劑的含量的質(zhì)量控制提供參考。1器材1.1儀器KNAUER高效液相色譜儀德國(guó)由K-501HPL泵、分析型動(dòng)態(tài)混合器、K-2600UVDetetr、7725i手動(dòng)進(jìn)樣閥、Eerhr2000BasiEditin色譜工作站軟件V2.05和T3000柱溫箱北京創(chuàng)新通恒科技組

7、成。KQ-400BD型數(shù)控超聲波清洗器昆山市超聲儀器，813混合型烷基鍵合硅膠色譜柱自制，PHS-3精細(xì)pH計(jì)上海雷磁儀器廠，TU-1900光度掃描儀。1.2藥品與試劑雙黃連粉針劑哈爾濱醫(yī)藥股份，批號(hào)0010207，0306201，0402205，0402206；綠原酸對(duì)照品中國(guó)藥品生物制品鑒定所消費(fèi)，批號(hào)110753-200212；黃芩苷對(duì)照品中國(guó)藥品生物制品鑒定所，批號(hào)110715-200212；甲醇色譜純，上?；瘜W(xué)試劑，磷酸分析純，重蒸餾水。2方法與結(jié)果2.1混合型烷基鍵合硅膠的制備2.0g經(jīng)6lL-1Hl活化后的枯燥硅膠，懸浮在80l無(wú)水甲苯中，參加2.0l813烷基三乙氧基硅烷和3滴

8、三乙胺，在氮?dú)鈿夥罩校?20加熱攪拌反響24h，待冷至室溫后，抽濾，分別用甲苯、乙醚、丙酮、甲醇、水洗滌屢次，120下真空枯燥2h后稱重，得約2.2g固定相。813混合烷基三乙氧基硅烷是一種石油尾氣中的混合烯烴硅氫加成得到的廉價(jià)的偶聯(lián)劑。2.2流動(dòng)相的制備流動(dòng)相A：測(cè)試前，甲醇R用G4玻璃漏斗過濾，然后超聲30in，冷卻后供測(cè)試用；流動(dòng)相B：取適量重蒸餾水至500l燒杯中，通過酸度計(jì)和電磁攪拌器，用H3P4(AR)-H219，v/v溶液調(diào)pH2.7，以下操作同流動(dòng)相A。2.3對(duì)照品儲(chǔ)藏液的制備精細(xì)稱取黃芩苷對(duì)照品21.5g，綠原酸對(duì)照品10.0g，分別置50l棕色量瓶中，用甲醇-水(11,v/

9、v)溶解定容至50l，分別配制成濃度為0.43gl-1和0.20gl-1的貯備液，綠原酸置冰箱低溫保存。2.4樣品溶液及空白對(duì)照液的制備精細(xì)稱取雙黃連粉針劑15g置50l棕色容量瓶中，參加甲醇-水(11,v/v)適量，超聲溶解20in，冷卻，用甲醇-水(11,v/v)稀釋至刻度，搖勻，以3000rin-1的轉(zhuǎn)速離心20in后，用0.45過濾膜過濾，供測(cè)試用。另取處方中除金銀花、黃芩的其余藥材，按規(guī)定工藝制備成雙黃連粉針劑后，依樣品溶液制備方法制成空白液。轉(zhuǎn)貼于論文聯(lián)盟.ll.2.5色譜別離檢測(cè)條件2.5.1波長(zhǎng)的選擇對(duì)照品中綠原酸和黃芩苷用TU-1900型紫外分光光度計(jì)進(jìn)展紫外掃描，綠原酸在3

10、23n處有較強(qiáng)的吸收，而黃芩苷在275n處有較強(qiáng)吸收,317n有次強(qiáng)吸收。但由于綠原酸在樣品中含量較低，而黃芩苷在樣品中含量較高約為綠原酸的15倍，為了進(jìn)步綠原酸檢測(cè)靈敏度，應(yīng)選323n作為測(cè)定波長(zhǎng)。2.5.2流動(dòng)相的組成及酸度的選擇在流動(dòng)相的pH值固定不變時(shí)，被別離組分隨梯度起始甲醇含量的下降而逐漸分開，當(dāng)梯度起始甲醇含量從25%eH-H2,v/v繼續(xù)下降時(shí)，色譜峰變寬，柱效下降，別離效果變差，因此，固定梯度起始甲醇含量為25%eH-H2,v/v。在流動(dòng)相梯度固定不變時(shí)，改變pH值，色譜峰隨pH值下降變窄，柱效進(jìn)步，保存時(shí)間縮短，別離效果進(jìn)步，當(dāng)pH值下降到2.7時(shí)，待測(cè)組分與其他組分實(shí)現(xiàn)基

11、線別離，因此，固定流動(dòng)相的pH值為2.7。2.5.3色譜別離條件及色譜別離圖色譜柱為813混合烷基鍵合相5，4.6150，流動(dòng)相：A：甲醇，B：水用磷酸調(diào)至pH2.7，梯度洗脫：07in，A25%，79in，A25%40%，915in，40%50%，流速1lin-1，柱溫：30，檢測(cè)波長(zhǎng)：323n，進(jìn)樣量20l。在上述優(yōu)化的色譜條件下得色譜別離圖見圖1。對(duì)照品中綠原酸和黃芩苷的保存時(shí)間分別為6.030，17.749in；拖尾因子分別為1.033，1.115；柱效分別為14198，242834。樣品中綠原酸和黃芩苷的保存時(shí)間為6.033，17.750in，拖尾因子分別為1.054，1.158，柱

12、效分別為14198，242834，待測(cè)組分與鄰近組分到達(dá)了基線別離。2.6方法學(xué)考察2.6.1線性關(guān)系考察及檢出限精細(xì)稱取上述貯備液各0.2，0.4，0.8，1.2，1.6，2.0，3.0，4.0，5.0l至10l容量瓶中，用甲醇-水11,v/v稀至刻度，搖勻，用0.45微孔過濾膜過濾后，按上述色譜條件進(jìn)展測(cè)定。以標(biāo)準(zhǔn)物的峰面積為A為縱坐標(biāo),標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度()為橫坐標(biāo),得綠原酸和黃芩苷的線性回歸方程：A=-0.15083+1.01463，r=0.99989A=-0.45437+0.59963，r=0.99997結(jié)果說(shuō)明:綠原酸在4.0100.0gl-1濃度范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，黃芩苷在8.6215.

13、0gl-1濃度范圍內(nèi)呈線性關(guān)系。按信噪比31計(jì)，綠原酸和黃芩苷的檢出限分別為0.27ng和0.39ng。2.6.2樣品的測(cè)定按上述測(cè)定條件對(duì)“2.4項(xiàng)下的樣品溶液進(jìn)展測(cè)定。分別由線性回歸方程求得綠原酸和黃芩苷的濃度。結(jié)果見表1。a-綠原酸對(duì)照品；b-黃芩苷對(duì)照品；-樣品；1-綠原酸；2-黃芩苷;d-空白樣品圖1雙黃連粉針劑對(duì)照品和空白樣品的色譜別離圖略表1樣品含量測(cè)定結(jié)果略2.6.3回收率實(shí)驗(yàn)精細(xì)稱取含量的雙黃連粉針劑批號(hào)：040220614.8g兩份于2個(gè)50l棕色容量瓶，參加甲醇-水11,v/v適量，超聲溶解20in，冷卻，分別參加綠原酸0.40，0.60，0.8l，黃芩苷0.40，0.6

14、0，0.8l，再用50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，用0.45微孔過濾膜過濾后，按上述色譜條件測(cè)定。結(jié)果見表3。表2綠原酸及黃芩苷回收率測(cè)定結(jié)果略2.6.4精細(xì)度實(shí)驗(yàn)分別精細(xì)汲取綠原酸和黃芩苷對(duì)照品溶液1.2l，用50%的甲醇稀至10l容量瓶中搖勻，用0.45微孔過濾膜過濾后，按上述色譜條件下，日內(nèi)重復(fù)測(cè)定5次，日間重復(fù)測(cè)定5次，日內(nèi)測(cè)定綠原酸的平均峰面積為25.0213，RSD為1.12%；測(cè)定黃芩苷的平均峰面積為30.3104，RSD為0.61%。日間測(cè)定綠原酸的平均峰面積為24.6852,RSD為1.73%，黃芩苷的平均峰面積為為29.7034，RSD為0.71%。結(jié)果見表3。表3精細(xì)度實(shí)驗(yàn)測(cè)

15、定結(jié)果略2.6.5重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)取同一批號(hào)0402206雙黃連粉針劑5份，按樣品測(cè)定項(xiàng)下測(cè)定，5份雙黃連粉針劑中，綠原酸的測(cè)定結(jié)果分別是1.727%，1.710%，1.723%，1.728%，1.740%，平均含量為1.726%，RSD=0.52%，黃芩苷的測(cè)定結(jié)果分別是26.36%，26.09%，26.30%，26.26%，26.29%，平均含量為26.26%，RSD=0.39%。2.6.6穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)精細(xì)汲取樣品溶液批號(hào)0402206，按“2.5項(xiàng)下測(cè)定，分別在0，2，4，6，8，10，12h測(cè)定綠原酸和黃芩苷的峰面積，其RSD分別為0.82%和1.02%，說(shuō)明至少在12h內(nèi)可進(jìn)展準(zhǔn)確的定量分析

16、。3討論從表1可知，不同廠家不同批號(hào)的雙黃連粉針劑中綠原酸和黃芩苷的含量各不一樣，黃芩苷的測(cè)定與?中國(guó)藥典?方法進(jìn)展比擬，兩種方法測(cè)定的結(jié)果非常吻合，但藥典方法只能單一測(cè)定黃芩苷的含量，不能同時(shí)測(cè)定黃芩苷和綠原酸的含量。為了保證其質(zhì)量，選擇一種簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確的定量方法控制其質(zhì)量是至關(guān)重要的。文獻(xiàn)6，7也是采用高效液相法同時(shí)測(cè)定兩種組分，但均為進(jìn)口DS柱，價(jià)格比擬昂貴。本方法采用813混合烷基三乙氧基硅烷和自制球型硅膠合成了混合型烷基鍵合相液相色譜固定相，價(jià)格低廉，利用梯度洗脫兩種組分也得到很好的別離，且方法簡(jiǎn)單，結(jié)果準(zhǔn)確，說(shuō)明可用廉價(jià)的813柱代替較昂貴DS柱，對(duì)雙黃連粉針劑的質(zhì)量進(jìn)展控制，

17、具有實(shí)際意義。參考文獻(xiàn)：1李茂森.一階導(dǎo)數(shù)光譜法測(cè)定雙黃連口服液中黃芩苷的含量J.基層中藥雜志，1996，102：32.2欒士香.系數(shù)倍率法測(cè)定雙黃連注射液中黃芩苷、綠原酸、連翹甙的含量J.中國(guó)中藥雜志，1991，1610：602.3程智勇，韓鳳梅，蔡敏，等.HPE法測(cè)定雙黃連口服液中黃芩苷和綠原酸的含量J.藥學(xué)學(xué)報(bào),1999，3411：854.4鄭一寧，謝天堯，莫金垣，等.雙黃連粉針劑中黃芩苷的高效毛細(xì)管電泳-電導(dǎo)法測(cè)定J.分析測(cè)試學(xué)報(bào)，2001，206：21.5華菊根，胡立君，李國(guó)忱.注射用雙黃連質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究J.中成藥，1996，1811：13.6馬洪波，鄧光瑞，李興斌，等.改良HPL法測(cè)定雙黃連粉針劑