RNA提取及PCR相關技術課件

1、RNA提取及PCR相關實驗技術RNA提取逆轉(zhuǎn)錄實驗步驟結(jié)果分析PCRqPCR內(nèi)容從RNA提取到基因定性/定量流程收集并保存組織、血液、細胞等臨床樣本提取、純化RNA逆轉(zhuǎn)錄生成cDNAPCR / qPCR進行定性/定量分析樣本保存要求最好使用新鮮樣品組織：取樣離體后，立即分成1cm3左右的小塊， 每塊約30-100mg，放入凍存管或錫箔紙包好， 立即放置液氮罐中速凍1小時，-80冰箱保存。注意做好標記，避免反復凍融第一部分 RNA提取RNA提取樣本保存要求細胞：不建議保存。 培養(yǎng)處理后立即提取RNA， 或收集后，于Trizol液中- 80 保存。血液：不建議長期保存。 或立即分離白細胞后，于Tr

2、izol液中 - 80 保存。前期準備工作 RNase-free水：0.1DEPC處理去離子水過夜，次日高壓滅菌除去 殘留DEPC，分裝1.5ml Eppendorf管， 4保存。 75乙醇：用RNase-free水配制，分裝為50ml，4保存。 氯仿、異丙醇、無水乙醇：新包裝開封后，分裝50ml，4保存。注意：DEPC有吸入毒性，需穿工作服，戴手套、口罩操作。樣本準備 組織 大鼠組織樣品量總RNA量（g）腦10 mg8 肺10 mg10腎臟10 mg10心臟10 mg20脾臟10 mg35肝臟10 mg40 50100mg 組織對應1ml Trizol RNA的提取注意佩戴口罩、勤更換手套

3、組織（1）液氮預冷研缽；（2）液氮研磨，至樣品呈粉末狀（需8-10min）；（3）向研缽內(nèi)加入1ml Trizol繼續(xù)研磨，至呈不黏稠液態(tài)；（4）將混合液轉(zhuǎn)移至玻璃勻漿器中，冰上勻漿3min；（5）將勻漿液轉(zhuǎn)移至1.5 ml Eppendorf管，室溫孵育5min；裂解RNA的提取 細胞 懸浮細胞：離心收集后，倒除培養(yǎng)液，加入1ml Trizol 反 復吹打細胞，至溶液不黏稠。 貼壁細胞：倒除培養(yǎng)液，PBS洗滌一次后，直接在培養(yǎng) 瓶或培養(yǎng)板中加入1ml Trizol 反復吹打細胞， 直至溶液不黏稠。室溫孵育混合液10min后，轉(zhuǎn)移至1.5 ml Eppendorf管裂解Trizol勻漿孵育后8

4、0 保存加入0.2ml氯仿，劇烈搖動15s; 3min at RT, 12,000g x 15min, 4 分層取水相，0.5mL異丙醇，顛倒混勻，10min at RT4 ，12,000g x 10min（片狀沉淀物為RNA）沉淀去上清，1ml 75乙醇洗滌，7,500g x 5min at 4，重復一次 洗滌空氣干燥，加50ul RNase-free水，55 孵育溶解干燥溶解RNA提取優(yōu)化步驟（1）對得率較低的樣本，可在異丙醇沉淀一步，選用-20 度過夜孵育，以增加得率。（2）對多糖含量較高的樣本，可在異丙醇沉淀一步，加入 高鹽溶液（0.8M檸檬酸鈉和1.2M NaCl）， -20度過 夜

5、共孵育，以去除多糖物質(zhì)的污染。注意：所有試劑均需無酶水配制。RNA鑒定及初定量 （2）瓊脂糖凝膠電泳RNA完整性鑒定 13ul RNA溶液上樣，1膠，100V電泳10min。完整RNA呈現(xiàn)明顯兩條帶28S，18S，且28S帶約為18S帶亮度的兩倍；有時也可見5S帶RNA鑒定及初定量Electrophoresis gel of the RNA sample小結(jié)RNA的保護 1. 提取前 1.1 新鮮樣品及液氮速凍 1.2 提取工作區(qū)RNase的清除 1.3 實驗用品RNase的清除 2. 提取中 2.1 組織破碎過程中的保護 2.2 細胞裂解過程中的保護 2.3 實驗人員保護措施 2.4 保存過

6、程中3. 在后續(xù)的逆轉(zhuǎn)錄過程中仍需保持無酶環(huán)境第二部分 RT-PCR 逆轉(zhuǎn)錄PCRreverse transcriptionAAAAAAAAAA-3TTTTTTTTTT-5mRNA(sense)Antisense primers:oligo(dT) orrandom hexamersor GSP1st strand cDNAAAAAAAAAAA-3TTTTTTTTTT-5PCR using GSP+GSP1GSP1GSPGSP1 (sense)GSP (antisense)1 st strand cDNART-PCR 逆轉(zhuǎn)錄 選擇方法： 兩步法（適用于多目的基因） 一步法（適用于單一目的基因）

7、RNA逆轉(zhuǎn)錄 選擇逆轉(zhuǎn)錄引物：隨機引物（適用于低豐度RNA） Oligo (dT)引物（適用于具有Poly A尾的RNA） 特異性引物 （適用于一步法） RNA 逆轉(zhuǎn)錄步驟 （3）反應體系42孵育60min。如使用隨機引物，先室溫孵育 10min后，再升溫至42。（4）72，5min失活酶，置冰進行后續(xù)反應或-20 保存。cDNA第一鏈已合成，可低溫保存或繼續(xù)后續(xù)實驗聚合酶鏈式反應(Polymerase Chain Reaction)以母鏈DNA為模板，以特定引物為延伸起點，以反應底物脫氧核糖核苷三磷酸(dNTPs)在DNA聚合酶催化下，通過變性、退火、延伸等步驟，體外復制出與母鏈模板DNA互

8、補的子鏈DNA的過程。PCR的原理和反應過程RT-PCR 逆轉(zhuǎn)錄PCR mRNA序列查找（以EGFR為例）RT-PCR 逆轉(zhuǎn)錄PCR以BLAST驗證引物RT-PCR 逆轉(zhuǎn)錄PCR PCR反應準備工作： 選擇內(nèi)參： 1. 受不同實驗處理因素時，表達恒定； 2. 在體內(nèi)各種組織中表達恒定； 3. 除實驗設計處理因素之外，能夠與目的基因 一起受同等程度的非設計其它因素影響。 常用內(nèi)參基因名稱： -actin、 GAPDH、16Sr、18Sr （Human 、Rat 、 Mouse）RT-PCR 逆轉(zhuǎn)錄步驟 二、PCR擴增（示例）cDNA第一鏈 2 ul10PCR buffer(K+) 5 ul25m

9、M MgCl2 3 ul (1.5 mM)10mM dNTPs 1 ul (各200 uM)50M引物 正向/ 反向 各0.5 ul (0.10.5 uM)Taq 酶 0.5 ul (15U)雙蒸水 38.5 ul總反應體積： 50 ulPCR mix包含：buffer（Mg2+） dNTPs Taq酶RT-PCR 逆轉(zhuǎn)錄步驟 PCR反應條件95 2 min95 30 sec40-65 10-120 sec22-35cycle72 60-120 sec72 10min12 退火溫度：引物的退火溫度一般要比估計的相應熔點溫度Tm低5左右。兩條引物的退火溫度相差不應超過4-6。特異性的改進：提高退

10、火溫度（比建議退火溫度提高2-5）；減少退火時間。過長的退火時間在正常情況下并不能提高產(chǎn)量，只會增加非特異性引物雜交的可能性。注意事項（1）每次PCR設立對照組和陰性對照組。（2）科學做法是將內(nèi)參引物加入目的基因的PCR擴增反應體系中，同時擴增作為對照。（3）將反應體系中的相同試劑預先混合，再分裝成各 反應管。（4）設定合適的循環(huán)次數(shù)，PCR不能進入平臺期。（5）在一定范圍內(nèi)調(diào)整Mg2+濃度、引物濃度、退火溫 度，消除非特異性擴增。結(jié)果鑒定 瓊脂糖凝膠電泳分析結(jié)果： 2瓊脂糖凝膠，取4-8 ul產(chǎn)物上樣，60V電泳40min， 紫外燈下觀察結(jié)果。 采用凝膠圖像分析系統(tǒng)，對電泳條帶進行密度掃描，

11、測定灰度值。注意：灰度掃描時，選擇合適的膠空白區(qū)域作為扣除的 背景灰度值。基因表達的差異分析相對定量各反應體系以內(nèi)參基因為參照，計算待測基因產(chǎn)物與其灰度比值，作為待測基因的表達值。即待測基因產(chǎn)物電泳帶灰度值內(nèi)參基因產(chǎn)物電泳帶灰度值 雙標準曲線法：待測樣本基因相對表達量 參照樣本基因相對表達量待測基因相對表達量結(jié)果示例 結(jié)果示例熒光定量PCR (Real-time PCR, qPCR)PCR + 熒光探針/ 熒光染料應用廣泛：可用于DNA和RNA的PCR產(chǎn)物定量、基因表達 研究、病原體檢測及PCR條件的優(yōu)化等?？啥吭恚航?jīng)激光激發(fā)后熒光量隨PCR循環(huán)而累積，從而 達到定量目的。無須凝膠電泳：只

12、須反應管內(nèi)直接檢測。減少污染環(huán)節(jié)：全封閉反應管。 結(jié)果重現(xiàn)性好：定量動態(tài)范圍高達五個數(shù)量級。Log DNA循環(huán)數(shù)線性增長期Linear平臺期Plateauy = x(1+e)n指數(shù)增長期GeometricReal-time PCR相同模板進行96次擴增的擴增曲線圖起始拷貝數(shù)越高，Ct值越??；起始拷貝數(shù)越低， Ct值越大與DNA結(jié)合時發(fā)光游離時不發(fā)光 一種DNA小溝結(jié)合染料1SYBR Green I熒光染料 在PCR過程中染料與DNA結(jié)合發(fā)光聚合完成聚合開始SYBR Green I每形成一個DNA雙鏈，就有一定數(shù)量的染料結(jié)合上去染料一結(jié)合，就產(chǎn)生熒光信號信號強度與DNA分子總數(shù)目成正比數(shù)量關系一

13、條探針，兩條引物 引物位于探針的兩邊一條探針，兩個基團 前邊是報告基團，后邊是淬滅基團 35RQ3355355TaqMan探針/水解探針每產(chǎn)生一條DNA鏈，就切斷一條探針每切斷一條探針，就產(chǎn)生一個單位信號信號強度與結(jié)合探針的DNA分子數(shù)成正比數(shù)量關系5TaqMan 探針上游引物335下游引物RQ3535QRReal-time PCR反應體系cDNA第一鏈 2 ul10M引物 正向/ 反向 各1 ul (0.10.5 uM)2SYBR Green qPCR Mix 10ul 雙蒸水 7 ul 總體積 20 ulSYBR Green qPCR Mix包含： SYBR Green 、buffer（M

14、g2+）、 dNTPs、 Taq酶Real-time PCR的定量方式絕對定量：通過定量標準曲線來確定起始模板的拷貝數(shù)；相對定量：用來確定經(jīng)過不同處理的樣品目標轉(zhuǎn)錄本之間的表 達差異或是目標轉(zhuǎn)錄本在不同時相的表達差異。結(jié)果分析 Ct法：目的基因與管家基因（內(nèi)參）擴增效率相同或接近 一致時，采用此法。 Ct法舉例： 測定X基因在某因子作用前后的表達變化內(nèi)參基因：GAPDH ; 實驗分實驗組和對照組X基因Ct值（平均值）GAPDH Ct值（平均值）CtCt2Ct對照組27.3516.9810.3701實驗組127.5216.8610.660.290. 82實驗組227.1717.0510.12-0

15、.251.22 Ct法實驗內(nèi)容方法(試劑)質(zhì)控結(jié)果判斷/計算RNA分離TrizolRNA濃度、純度（OD260, 280）Ratio(260/280)：1.82.0硅質(zhì)膜（柱式）完整性（變性電泳）28S/18S2，無拖尾，5S少逆轉(zhuǎn)錄（RT）cDNA syn kit (two-step)逆轉(zhuǎn)錄效率：RNA梯度稀釋(*10)RTqPCRcDNA梯度稀釋qPCRPrimer: oligo(dt)/ random/ gene specificNRC (no RT control)：不加RT酶陰性qPCRSYBR green PCR mix樣品重復：23管Cq值在2030之間，SD0.2，復管間差異0.5Eve green PCR mix溫度梯度(-6