羅氏診斷二代測序技術(shù)在HBV耐藥檢測中應(yīng)用課件

1、羅氏診斷二代測序技術(shù)在耐藥檢測中的應(yīng)用 羅氏診斷 應(yīng)用科學(xué)市場部 劉璐璐羅氏診斷二代測序技術(shù)在耐藥檢測中的應(yīng)用 羅氏診斷 應(yīng)用科學(xué) 耐藥性產(chǎn)生病毒每天高速復(fù)制，并在復(fù)制時發(fā)生錯誤，這些自發(fā)突變導(dǎo)致突變株出現(xiàn)。突變株增殖能力通常低于野生型，因而在未用藥的群體中占少數(shù)。但在病毒藥物作用下，藥物對于耐藥性的突變有選擇作用，導(dǎo)致了耐藥菌株成為優(yōu)勢株，導(dǎo)致藥物治療的失敗。 耐藥性產(chǎn)生病毒每天高速復(fù)制，并在復(fù)制時發(fā)生錯誤，這些自發(fā)突耐藥是核苷酸類藥物的共性耐藥檢測的意義治療前檢測，有助于臨床判斷用藥是否有效；治療中每 個月檢測，有助于觀察療效，及時調(diào)整用藥 ： . . , , : .用藥后出現(xiàn)耐藥拉米夫定

2、 阿德福韋酯 恩替卡韋 替比夫定 替諾福韋耐藥是核苷酸類藥物的共性 ： . .測序用于病毒耐藥檢測深度測序可檢出低頻準(zhǔn)種超深焦磷酸測序可檢測低于的準(zhǔn)種普通焦磷酸測序僅限及以上的準(zhǔn)種毛細(xì)管電泳測序僅限及以上的準(zhǔn)種提早判斷準(zhǔn)種組成，在劣勢菌種未發(fā)展成為優(yōu)勢菌種之前，即調(diào)整用藥策略；降低治療失敗可能性，減少對身體傷害。測序用于病毒耐藥檢測深度測序可檢出低頻準(zhǔn)種超深焦磷酸測序普高深度測序優(yōu)勢已經(jīng)成功實現(xiàn)對于基因區(qū)段突變位點的發(fā)現(xiàn)，比目前常用的一代測序及線性探針反向雜交法更加靈敏進行相對定量，對于病毒群體中突變數(shù)量改變進行跟蹤深度測序的運用將較傳統(tǒng)方法提前個月檢測出突變，因此能夠更好的抓住治療的時機并給

3、出治療的方案高深度測序優(yōu)勢測序系統(tǒng)發(fā)展測序通量及讀長不斷增加，大小測序平臺齊備 20 Mb100 Mb 500 Mb 測序系統(tǒng)發(fā)展測序通量及讀長不斷增加，大小測序平臺齊備獨立實驗室適用型精巧型 二代測序平臺 獨立實驗室適用型精巧型 二代測序平臺 測序步驟概覽 測序步驟概覽 測序流程 文庫構(gòu)建. 文庫構(gòu)建： , , , *產(chǎn)物可直接測序傳統(tǒng)文庫構(gòu)建：克隆一個片段 一個反應(yīng)珠 測序流程 文庫構(gòu)建. 文庫構(gòu)建：傳統(tǒng)文庫構(gòu)建：一個片段 測序流程 . 每個分子獨立進行反應(yīng)后獨立測序擴增效果好，適應(yīng)高含量片段、甚至樣本一個反應(yīng)珠 一個讀長 測序流程 . 一個反應(yīng)珠 一個讀長 單克隆測序的價值通過 實現(xiàn)單克

4、隆直接閱讀每一種分子結(jié)果突變比例的計算（低頻）基于實際的序列信息每個分子獨立進行反應(yīng)后獨立測序擴增效果好，適應(yīng)高 含量片段、甚至樣本 流程混合測序 流程單克隆測序單克隆測序的價值通過 實現(xiàn)單克隆直接閱讀每一種分子結(jié)果 流測序流程 測序 特異的測序引物和單鏈模板結(jié)合, 加入一種 聚合酶的作用下，單個 與模板的下一個堿基配對，同時釋放出一個分子的焦磷酸() 在硫酸化酶的作用下，和結(jié)合形成在熒光素酶的催化下，生成的又可以和熒光素結(jié)合形成氧化熒光素，同時產(chǎn)生可見光，被捕捉 降解剩余的和殘留的少量加入另一種重復(fù)步驟在每一個測序循環(huán)里，堿基以同樣的次序()流過板當(dāng)模板鏈的互補核苷酸加入延伸鏈時，會產(chǎn)生了熒

5、光信號熒光信號強度與所加入的核苷酸數(shù)目成比例熒光信號被照相機記錄熒光素酶 硫酸化酶氧化熒光素可見光. 基于焦磷酸反應(yīng)的邊合成邊測序測序流程 測序 特異的測序引物和單鏈模板結(jié)合, 加入一種13 : .邊合成邊測序 實驗體系的不斷優(yōu)化使得當(dāng)前可獲得 平均為的讀長并將繼續(xù)以提升讀長為技術(shù)的發(fā)展方向之一13 測序流程 數(shù)據(jù)獲取圖像處理信號處理測序流程 數(shù)據(jù)獲取圖像處理信號處理測序流程數(shù)據(jù)分析測序與分析同時進行，小時完成小時產(chǎn)出 萬條以上的序列自帶套軟件，滿足多數(shù)應(yīng)用需求軟件自動過濾，高質(zhì)量序列比例高 的位置仍可保持的準(zhǔn)確性 在德國大腸桿菌事件中 ., , , : 擁有最長的讀長，平均讀長在個堿基，的序

6、列可以用于基因組拼接月日收到樣本，月日完成全部測序與機制確認(rèn)工作數(shù)據(jù)分析僅由的非專業(yè)生信團隊，不到半天時間即得到結(jié)果測序流程數(shù)據(jù)分析測序與分析同時進行，小時完成 在德序列讀長分布圖 測序系統(tǒng)運行產(chǎn)生的讀長范圍為，甚至更長 實驗將利用幾乎全部數(shù)據(jù)平均讀長為典型讀長在 范圍 實驗將主要根據(jù)典型讀長進行引物設(shè)計Number of readsReadlength (bases)序列讀長分布圖 測序系統(tǒng)運行產(chǎn)生的讀長范圍為，甚至更長 NSimple simple 454 long reads ? 長測序能夠帶來什么 保證樣本的獲得，長焦磷酸確保閱讀Simple simple 454 long reads

7、 長讀長的價值一條通讀一個目標(biāo)序列，無需拼接，避免錯誤產(chǎn)生與時間消耗通過一條判斷突變的連鎖關(guān)系更少引物獲得更多目標(biāo)引物設(shè)計的區(qū)間更靈活條 既可通讀耐藥相關(guān)基因的產(chǎn)物耐藥基因()檢測有的個片段( )( )()( ) , ; (): . 長讀長的價值一條通讀一個目標(biāo)序列，無需拼接，避免錯誤產(chǎn)生與擴增子文庫的設(shè)計長讀長給予更多引物設(shè)計空間，條通讀熱點突變區(qū)域 ( ) 雙向測序 (. ) ( )AB 通過序列，可以混合多個樣本測序同時測序 基因可設(shè)計個產(chǎn)物片段基因可設(shè)計個產(chǎn)物片段基因可設(shè)計個產(chǎn)物片段基因可設(shè)計個產(chǎn)物片段基因可設(shè)計個產(chǎn)物片段擴增子文庫的設(shè)計長讀長給予更多引物設(shè)計空間，條通讀熱點突變測序在

8、 耐藥基因測序的應(yīng)用方案DNA 提取PCR產(chǎn)物的獲取PCR產(chǎn)物純化PCR產(chǎn)物樣品定量(Agilent2100, qPCR儀)PCR產(chǎn)物樣品均一化PCR產(chǎn)物混樣 454測序建庫加接頭(10min)emPCR擴增(2h手工操作+6h機器運行)454 Junior測序(10h)數(shù)據(jù)分析測序在 耐藥基因測序的應(yīng)用方案DNA 提取PCR產(chǎn)物的獲取P 測序步驟耐藥檢測應(yīng)用(乳滴)擴增每一帶有與測序引物的耐藥突變高發(fā)片段在其各自的微乳滴中進行獨立擴增，排除了其它競爭性或污染性序列對 反應(yīng)的影響。焦磷酸測序?qū)⑺薪Y(jié)合有片段的磁珠置于(板)中進行測序。板的孔徑恰好僅能容納一顆磁珠。將板置于測序儀中，單個核苷酸依

9、次流經(jīng)孔洞和捕獲磁珠間。當(dāng)所加入的核苷酸與模板互補時，便產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光信號，進而被系統(tǒng)的相機記錄。 測序步驟耐藥檢測應(yīng)用的分析結(jié)果呈現(xiàn)可檢測單點突變的分析結(jié)果呈現(xiàn)可檢測單點突變的分析結(jié)果呈現(xiàn)可關(guān)注已知突變的分析結(jié)果呈現(xiàn)可關(guān)注已知突變 , , , , 的分析結(jié)果呈現(xiàn)可檢測有意義的連鎖突變位點的分析結(jié)果呈現(xiàn)可檢測有意義的連鎖突變位點已有基因突變數(shù)據(jù)庫 已有基因突變數(shù)據(jù)庫 結(jié)果展示 結(jié)果展示近兩年使用 發(fā)表耐藥檢測文獻 . , , , , . () : . , , , , , , , , , , , , , , , , . () (). () . , , , , , , , , . () : . , , , , , , , , , . () :近兩年使用 發(fā)表耐藥檢測文獻 . , 測序系統(tǒng)您身邊的二代測序平臺經(jīng)典可靠：運用測序技術(shù)，與 測序系統(tǒng)相同的化學(xué)原理，