免疫自動化儀器分析醫(yī)學課件

1、免疫自動化儀器分析1.免疫自動化儀器分析1.概論早期免疫分析通過觀察沉淀物形成，凝集及溶血現(xiàn)象發(fā)生來分析，如免疫擴散、免疫電泳、血凝試驗、補體結合等上世紀50年代末60年代初，利用AG-AB復合物形成使?jié)岫雀淖?，再用比濁計來比濁，但因其敏感性差未被接?0年代初，開始有自動檢測系統(tǒng)，但因其用的是激光為光源，固定波長，靈敏度較低，而且時間一般要23小時2.概論早期免疫分析通過觀察沉淀物形成，凝集及溶血現(xiàn)象發(fā)生來分析概論70年代未，速率比濁計的出現(xiàn)，使抗原抗體結合的反應在幾十秒內(nèi)出結果，可以說是免疫化學測定的革命的發(fā)展隨著標記技術的發(fā)展，免疫化學可以納入臨床化學檢驗范疇如今，自動化免疫分析系統(tǒng)更加

2、飛速發(fā)展自動化免疫分析的基礎是抗原抗體的結合，具有高特異性；手段多是利用標記技術而將檢測信號放大，具有高靈敏度3.概論70年代未，速率比濁計的出現(xiàn)，使抗原抗體結合的反應在幾十自動化免疫儀器種類（應用技術）免疫比濁分析技術化學發(fā)光、電發(fā)光分析技術熒光免疫分析技術放射免疫分析技術酶免疫分析技術流式細胞術4.自動化免疫儀器種類（應用技術）免疫比濁分析技術4.免疫比濁利用抗原抗體結合后溶液的濁度變化而檢測的一種方法此法準確快速，已成為免疫診斷技術中重要的檢測手段比濁法與比色法5.免疫比濁利用抗原抗體結合后溶液的濁度變化而檢測的一種方法5.散射免疫比濁分析法 基本原理：抗原抗體復合物對一定波長的光產(chǎn)生折

3、射、偏轉(zhuǎn)，偏轉(zhuǎn)角度及散射光強度與復合物粒子的大小和量有關（圖）Rayleigh散射（圖） Mile散射Heidelberger曲線6.散射免疫比濁分析法 基本原理：抗原抗體復合物對一定波長的光產(chǎn)定時散射比濁分析基本原理：免疫沉淀反應和散射比濁分析結合之技術，反應分兩個階段，預反應階段和反應階段（圖）保證抗原不過量的方法： 確保反應體系抗體過量 對抗原過量進行閾值限定7.定時散射比濁分析基本原理：免疫沉淀反應和散射比濁分析結合之技預反應階段5ul樣本抗原過剩區(qū)閾值信號反 應 階 段45ul樣本7.5秒2分鐘6分鐘（2+4分鐘）定時散射比濁反應曲線圖抗原不過量抗原過量8.預反應階段抗原過剩區(qū)閾值信

4、號反 應 階 段7.5秒2速率散射比濁分析基本原理：抗原抗體結合反應的一種動態(tài)測定法，適時檢測抗原抗體復合物形成的散射光信號最快反應時間（圖）抗原過量檢測（圖）9.速率散射比濁分析基本原理：抗原抗體結合反應的一種動態(tài)測定法，抗原濃度遞增散射光峰值峰值信號與抗原抗體反應之間的關系圖ABCDFGHI10.抗原濃度遞增散射光峰值峰值信號與抗原抗體反應之間的關系圖AB反應時間（秒）06085散射率抗體過量抗原過量第二峰值信號抗原量檢測速率峰值信號產(chǎn)生11.反應時間（秒）06085散射率抗體過量抗原過量第二峰值信號抗免疫透射比濁基本原理：檢測信號是通過溶液的光，測量角度與正前方夾角為0（圖），保持抗體過

5、量，形成可溶性AG-AB復合物，使介質(zhì)濁度發(fā)生改變。實驗要求： 選擇親和力高的抗體，抗原抗體復合物要大、數(shù)量要多，反應時間充分。12.免疫透射比濁基本原理：檢測信號是通過溶液的光，測量角度與正前單色器透射比濁計散射比濁計散射比濁和透射比濁的區(qū)別示意圖透射光散射光散射光13.單色器透散射散射比濁和透射比濁的區(qū)別示意圖透射光散射光13膠乳濁度測定法基本原理是：將抗體吸附在大小適中、均勻一致的膠乳顆粒上，當遇到相應抗原時，則使膠乳顆粒發(fā)生凝集。單個膠乳顆粒在入射光波之內(nèi)不阻礙光線透過，兩個或兩個以上膠乳顆粒凝聚時則使透過光減少，這種減少的程度與膠乳顆粒凝聚的程度呈正比，當然也與待測抗原量呈正比（圖）

6、 14.膠乳濁度測定法基本原理是：將抗體吸附在大小適中、均勻一致的膠光波膠乳濁度測定法原理dd 2d15.光波膠乳濁度測定法原理dd 2d15.影響免疫比濁的因素 抗原抗體比例抗體純度和效價增聚劑（PEG）16.影響免疫比濁的因素 抗原抗體比例16.自動免疫濁度分析儀的要求校準程序，使儀器處于正常的工作狀態(tài)定標程序，保證檢測結果的準確性自動控制，保證實施實驗條件中的抗原抗體反應體系要求自動系統(tǒng)，障礙的檢測和預警。17.自動免疫濁度分析儀的要求校準程序，使儀器處于正常的工作狀態(tài)1自動化免疫儀器種類（應用技術）免疫比濁分析技術化學發(fā)光、電發(fā)光分析技術熒光免疫分析技術放射免疫分析技術酶免疫分析技術流

7、式細胞術18.自動化免疫儀器種類（應用技術）免疫比濁分析技術18.化學發(fā)光自動免疫分析化學發(fā)光是指在化學反應過程中產(chǎn)生光的發(fā)射現(xiàn)象基本原理：標記在抗原或抗體上的發(fā)光物質(zhì)在堿性介質(zhì)中氧化時產(chǎn)生激發(fā)態(tài)的中間體，中間體回基態(tài)時產(chǎn)生輻射，多余的能量為發(fā)射光子，產(chǎn)生發(fā)光現(xiàn)象，再對光信號進行接收轉(zhuǎn)化，可得檢測物濃度發(fā)光物質(zhì)須具備：氧化致發(fā)光、光量子產(chǎn)額高、理化性能好19.化學發(fā)光自動免疫分析化學發(fā)光是指在化學反應過程中產(chǎn)生光的發(fā)射化學發(fā)光自動免疫分析類型 化學發(fā)光免疫分析（CLIA） 是一種用發(fā)光劑直接標記抗體的一類免疫分析法，用來標記的發(fā)光物必須能參與發(fā)光反應、標記和偶聯(lián)后能穩(wěn)定、理化性質(zhì)和免疫特性不改

8、變，多用吖啶酯類和苯酚類化合物。 20.化學發(fā)光自動免疫分析類型 化學發(fā)光免疫分析（CLIA）20.化學發(fā)光自動免疫分析類型化學發(fā)光酶免疫分析（CLEIA） 以催化反應的酶為標記物，抗原抗體結合后，其中的酶可對發(fā)光體系產(chǎn)生催化作用，產(chǎn)生發(fā)光效應。發(fā)光信號與抗原抗體的量成正比。多用的發(fā)光體系是HRP-魯米諾。 21.化學發(fā)光自動免疫分析類型化學發(fā)光酶免疫分析（CLEIA）21化學發(fā)光自動免疫分析類型微粒子化學發(fā)光免疫分析（ECIA） 也是一種酶免疫分析，用磁珠作為固相載體，增加反應體積和分離效率。標記的酶多為ALP。22.化學發(fā)光自動免疫分析類型微粒子化學發(fā)光免疫分析（ECIA）2化學發(fā)光自動免

9、疫分析類型電化學發(fā)光免疫分析（ECLIA） 一種在電極表面由電化學引發(fā)的特異性化學發(fā)光反應，實際上包括了電化學和化學發(fā)光二個過程,其中應用了“親和素-生物素”放大系統(tǒng)，使檢測的靈敏度大大提高以雙抗體夾心法為例之圖示（圖）23.化學發(fā)光自動免疫分析類型電化學發(fā)光免疫分析（ECLIA）23ECLIA體系結構圖24.ECLIA體系結構圖24.ECLIA檢測流程圖一（雙抗體夾心的形成）25.ECLIA檢測流程圖一（雙抗體夾心的形成）25.ECLIA檢測流程圖二 （生物素與親和素結合）26.ECLIA檢測流程圖二 （生物素與親和素結合）26.ECLIA檢測流程圖三 （磁珠吸引吸附于電極表面）27.ECL

10、IA檢測流程圖三 （ECLIA檢測流程圖四 （電極充電啟動電化學反應）28.ECLIA檢測流程圖四 （電極充電啟動電ECLIA檢測流程圖五 （撤消磁場沖洗磁珠）29.ECLIA檢測流程圖五 （撤消磁場沖洗磁珠）29.化學發(fā)光自動免疫分析化學發(fā)光免疫分析是免疫技術、發(fā)光技術和計算機系統(tǒng)的結合，具有特異性強、靈敏度高（pg/ml)、精密度好、準確度好等特點，越來越多的人體微量指標應用這種方法來檢測，已漸漸代替了RIA。30.化學發(fā)光自動免疫分析化學發(fā)光免疫分析是免疫技術、發(fā)光技術和計自動化免疫儀器種類（應用技術）免疫比濁分析技術化學發(fā)光、電發(fā)光分析技術熒光免疫分析技術放射免疫分析技術酶免疫分析技術

11、流式細胞術31.自動化免疫儀器種類（應用技術）免疫比濁分析技術31.熒光免疫自動化利用熒光物質(zhì)標記抗原抗體的一種檢測方法由免疫反應、熒光及計算機技術聯(lián)合應用的技術主要有時間分辨熒光免疫測定和熒光偏振免疫測定32.熒光免疫自動化利用熒光物質(zhì)標記抗原抗體的一種檢測方法32.熒光免疫自動化時間分辨熒光免疫測定（TRFIA）：AG-AB結合，某些熒光物質(zhì)發(fā)長壽命熒光，時間分辨技術利用長壽命熒光物質(zhì)（鑭氏元素銪螯合物）標記抗原或抗體，測定過程中，可利用延遲時間來消除非特異性的熒光干擾（圖） 。33.熒光免疫自動化時間分辨熒光免疫測定（TRFIA）：AG-AB光強度激發(fā)短壽命熒光長壽命熒光延遲時間測量時間

12、銪螯合物的激發(fā)、發(fā)射光譜34.光強度激發(fā)短壽命熒光長壽命熒光延遲時間測量時間銪螯合物的激發(fā)熒光免疫自動化TRFIA設計中的一些注意事項： Stakes位移（圖） 解離增強35.熒光免疫自動化TRFIA設計中的一些注意事項：35.熒光免疫自動化熒光偏振免疫測定：以小分子物質(zhì)與大分子物質(zhì)的旋轉(zhuǎn)差異而使它們對偏振光的吸收不同為依據(jù)檢測小分子藥物熒光酶免疫分析：標記酶參與反應36.熒光免疫自動化熒光偏振免疫測定：以小分子物質(zhì)與大分子物質(zhì)的旋波長300 400 500 600 700Stakes吸光度Stakes位移示意圖激發(fā)光熒光37.波長300 400 5自動化免疫儀器種類（應用技術）免疫比濁分析技

13、術化學發(fā)光、電發(fā)光分析技術熒光免疫分析技術放射免疫分析技術酶免疫分析技術流式細胞術38.自動化免疫儀器種類（應用技術）免疫比濁分析技術38.流式細胞儀流式細胞儀（FCM）是以激光為光源，檢測生物學顆粒理化性質(zhì)的儀器生物學顆粒包括免疫復合物、DNA、RNA、蛋白質(zhì)、病毒顆粒、脂質(zhì)體、細胞器、細胞、染色體、真核細胞等理化性質(zhì)則為細胞大小、形狀、胞漿顆粒、DNA含量、酶活性等39.流式細胞儀流式細胞儀（FCM）是以激光為光源，檢測生物學顆粒流式細胞儀FCM綜合了激光技術、電子技術、流體力學、細胞化學及計算機技術，被稱為實驗室“CT”FCM現(xiàn)正廣泛應用于細胞生物學、免疫學、腫瘤學、血液學、病理學、遺傳

14、學、臨床檢驗學等40.流式細胞儀FCM綜合了激光技術、電子技術、流體力學、細胞化學流式細胞儀基本原理基本原理：單個經(jīng)熒光染料染色的細胞經(jīng)過激光激發(fā)后，發(fā)射的熒光在不同的角度進行測量，并對其信號進行綜合分析（圖）細胞分選原理：通過測量區(qū)的細胞若其參數(shù)符合實驗設計的條件，在經(jīng)過偏轉(zhuǎn)板時被充上相應的電荷并被偏轉(zhuǎn)收集（圖）41.流式細胞儀基本原理基本原理：單個經(jīng)熒光染料染色的細胞經(jīng)過激光42.42.43.43.液流系統(tǒng)：樣本和鞘流液組成（圖）光學系統(tǒng)：光源可為汞燈或激光信號接收系統(tǒng)：散射光和熒光的檢測流式細胞儀基本組成44.液流系統(tǒng)：樣本和鞘流液組成（圖）流式細胞儀基本組成44.側(cè)向熒光信號鞘流前向散

15、射光流式細胞流動池示意圖噴嘴激光束45.側(cè)向熒光信號鞘流前向散射光流式細胞流動池示意圖噴嘴激光束45散射光的檢測信號的產(chǎn)生及強度（圖）前向散射光（圖）側(cè)向散射光（圖）46.散射光的檢測信號的產(chǎn)生及強度（圖）46.信號的產(chǎn)生激光照射區(qū)信號檢測曲線47.信號的產(chǎn)生激光照射區(qū)信號檢測曲線47.細胞中熒光素今量與信號的關系信號的產(chǎn)生48.細胞中熒光素今量與信號的關系信號的產(chǎn)生48.細胞中熒光素今量與信號的關系信號的產(chǎn)生49.細胞中熒光素今量與信號的關系信號的產(chǎn)生49.激光器激光器激光探測器大顆粒小顆粒前散射光示意圖50.激光器激光器激光探測器大顆粒小顆粒前散射光示意圖50.激光器激光器側(cè)向散射光探測器復雜顆粒簡單顆粒側(cè)向散射光示意圖51.激光器激光器側(cè)向散射光探測器復雜顆粒簡單顆粒側(cè)向散射光示意圖熒光測量熒光染料染色的細胞通過測量區(qū)時，細胞中特異性熒光物質(zhì)受激發(fā)產(chǎn)生熒光信號，后者強弱表示待測物質(zhì)的多少熒光的檢測系統(tǒng)由濾光片和檢測器組成，濾光片的作用是使激發(fā)光波長盡可能接近熒光染料的激發(fā)光譜峰值，濾除非熒光信號，提高熒光的檢測強度52.熒光測量熒光染料染色的細胞通過測量區(qū)時，細胞中特異性熒光物質(zhì)流式細胞儀免疫分析的技術要求儀器性能指標：熒光分辨率、熒光靈敏度、前向角散色光靈敏度、前向角散光分辨率、分析/分選速度、分選純度、分選收獲率檢測樣品