免疫分析的技術

1、關于免疫分析技術第1頁，共42頁，2022年，5月20日，9點45分，星期四第一節(jié) 免疫檢測技術概述免疫檢測技術起源：檢測病原微生物抗原及抗體的血清學診斷。1896年G. Widal和A. Sicard利用傷寒病人的血清與傷寒桿菌發(fā)生特異性凝集的現(xiàn)象，有效準確地診斷傷寒。免疫分析法（immunoassay, IA）是利用抗原抗體反應產(chǎn)生免疫復合物的原理分析微量或超微量待測物質的一種分析手段，往往需要借助一種信號放大系統(tǒng)把抗原抗體結合的反應信息予以展現(xiàn)和放大。免疫分析技術是以抗原與抗體在體外特異性、可逆性結合反應為基礎的分析技術。免疫分析法是將免疫反應與現(xiàn)代測試手段相結合而建立的超微量測定技術。

2、第2頁，共42頁，2022年，5月20日，9點45分，星期四免疫分析技術的特點高度的靈敏性：可檢測10-1810-6級別的物質；（免疫聚合酶鏈反應，免疫沉淀反應）高度的特異性：可區(qū)別物質間細微的差異，這是其他技術無法比擬的。第3頁，共42頁，2022年，5月20日，9點45分，星期四樣品前處理復雜操作繁瑣需要昂貴的儀器設備檢測時間長可大大簡化甚至省去復雜的樣品前處理過程操作簡便無需昂貴的儀器設備快速、靈敏、特異，可短時間檢測大量樣品 與目前農(nóng)藥殘留的主要檢測方法氣相色譜分析法和高效液相色譜法等相比，免疫分析方法具有明顯優(yōu)勢。GC/HPLC法 IA分析法第4頁，共42頁，2022年，5月20日，

3、9點45分，星期四免疫分析技術的分類根據(jù)免疫反應的動力學類型分為：競爭反應：標記抗原（Ag*）和非標記抗原（Ag）共同競爭與抗體的反應。 Ag（樣品） + Ab AgAb Ag *（定量加入） + Ab *AgAb夾心反應：將抗體、抗原和第二抗體結合在一起，形成夾心式結合物。最終，檢測夾心結合物上標記物，計算樣品中抗原含量。 Ab1 + Ag + Ab2* Ab1-Ag-Ab1*第5頁，共42頁，2022年，5月20日，9點45分，星期四免疫分析技術的分類根據(jù)抗原和抗體在反應中存在方式不同分為：均相分析（液相免疫分析）：不需要將游離抗原與結合物分離，直接進行測定。特點：簡單省時，適合于測定小分

4、子化合物，靈敏度10-9 g/ml；異相分析（固相免疫分析）：抗原抗體反應后，將結合物與游離抗原（或抗體）及樣品用常規(guī)物理方法分離，然后對分離出的結合物進行檢測。特點：有較高靈敏度靈敏度10-12 g/ml，干擾少。第6頁，共42頁，2022年，5月20日，9點45分，星期四免疫分析技術的分類根據(jù)標記方法的不同分為：熒光免疫分析技術放射免疫分析技術酶聯(lián)免疫分析技術發(fā)光免疫分析技術免疫標記技術指用熒光素、放射性同位素、酶、鐵蛋白、膠體金及化學、生物發(fā)光劑等作為追蹤物，標記抗體或抗原進行的抗原抗體反應，并借助熒光顯微鏡、射線測量儀、酶標檢測儀、電子顯微鏡和發(fā)光免疫測定儀等精密儀器，對實驗結果直接進

5、行觀察或進行自動化測定。第7頁，共42頁，2022年，5月20日，9點45分，星期四第二節(jié) 四種常見免疫分析技術第8頁，共42頁，2022年，5月20日，9點45分，星期四（1）熒光免疫分析技術熒光免疫分析技術是標記免疫技術中發(fā)展最早的一種，是將抗原抗體反應的特異性與熒光物質檢測的敏感性和直觀性結合起來的一種方法。 1941年，Coons首次采用熒光素進行標記而獲得成功。這種以熒光物質標記抗體而進行抗原定位的技術稱為熒光抗體技術。基本原理：熒光免疫分析法是將不影響抗原抗體活性的熒光色素標記在抗體（或抗原）上，與其相應的抗原（或抗體）結合后，在熒光顯微鏡下呈現(xiàn)一種特異性熒光反應。第9頁，共42頁

6、，2022年，5月20日，9點45分，星期四（1）熒光免疫分析技術熒光現(xiàn)象與熒光物質 熒光素(fluorescein): 在藍光或紫外線照射下，發(fā)出綠色熒光的一種黃色染料。用于熒光抗體技術中的熒光染料。 常用的熒光素：異硫氰酸熒光素（FITC），四乙基羅丹明（RB200），四甲基異硫氰酸羅丹明（TRITC），酶作用后產(chǎn)生熒光的物質。 第10頁，共42頁，2022年，5月20日，9點45分，星期四（1）熒光免疫分析技術抗體的熒光素標記 用于標記的抗體要求：高特異性和高親和力；不應含有針對標本中正常組織的抗體；一般需經(jīng)純化提取后再作標記。作為標記的熒光素要求：具有能與Ab分子形成共價健的化學基團；

7、與蛋白質結合后，仍能保持較高的熒光效率；熒光色澤與背景組織的色澤對比鮮明；與Ab結合后不影響Ab的生化與免疫性質；標記方法簡單、安全無毒；與蛋白質的結合物穩(wěn)定，不易解離，易于保存。第11頁，共42頁，2022年，5月20日，9點45分，星期四（1）熒光免疫分析技術直接法優(yōu)點：操作簡便、特異性高、非特異 熒光染色因素少，缺點：靈敏度偏低，每檢查一種抗原需制備相應的特異熒光抗體第12頁，共42頁，2022年，5月20日，9點45分，星期四（1）熒光免疫分析技術間接法優(yōu)點：靈敏度高，在不同抗原的檢測中只需應用一種熒光抗體。既可檢測抗原，也可檢測抗體。應用：常用于微生物檢測，例如：沙門氏菌。第13頁，

8、共42頁，2022年，5月20日，9點45分，星期四在醫(yī)學檢驗中的應用:熒光抗體技術在臨床檢驗上已廣泛用于細菌、病毒和寄生蟲的檢驗及自身免疫病的診斷等 第14頁，共42頁，2022年，5月20日，9點45分，星期四熒光顯微鏡第15頁，共42頁，2022年，5月20日，9點45分，星期四（2）放射免疫分析技術放射免疫分析技術（Radioimmunoassay，RIA）定義：是以放射性核素為標記物的標記免疫分析方法，用于定量測定受檢標本中抗原。1959年，Yalow和Berson創(chuàng)建的分析方法?；驹恚旱?6頁，共42頁，2022年，5月20日，9點45分，星期四（2）放射免疫分析技術常用標記核

9、素：125I： 射線，半衰期 60 天3H： 射線，半衰期 12.3 年測量儀器 計數(shù)儀 液閃儀優(yōu)點：檢測靈敏度高，高達ngpg水平;測定的準確性好，數(shù)量級的回收率接近100%.缺點：操作相對復雜，同位素半衰期短，保存及操作相對復雜。第17頁，共42頁，2022年，5月20日，9點45分，星期四液閃儀計數(shù)器 第18頁，共42頁，2022年，5月20日，9點45分，星期四（3）酶聯(lián)免疫分析技術繼免疫熒光抗體技術和放射免疫分析之后發(fā)展起來的一大新型的標記免疫技術，這一技術的誕生被譽為免疫血清學技術的一場革命，是應用最廣泛的免疫學技術之一。1971年，Engvall和Perlman首次報道建立酶聯(lián)免

10、疫吸附試驗（Enzyme-Linked ImmunosorbentAssays, ELISA）。由于ELISA具有快速、敏感、簡便、易于標準化等優(yōu)點，使其得到迅速的發(fā)展和廣泛應用 。第19頁，共42頁，2022年，5月20日，9點45分，星期四（3）酶聯(lián)免疫分析技術基本原理：利用酶催化底物反應的生物放大作用,提高特異性抗原-抗體免疫學反應的檢測敏感性的一種標記免疫技術。常用于標記抗體的酶：酶須具有下列特性：有高度的活性和敏感性；在室溫下穩(wěn)定；反應產(chǎn)物易于顯現(xiàn)；能商品化生產(chǎn)。目前應用較多的有辣根過氧化物酶（HRP）、堿性磷酸酶、葡萄糖氧化酶等，其中以HRP應用最廣。第20頁，共42頁，2022年

11、，5月20日，9點45分，星期四（3）酶聯(lián)免疫分析技術直接法測定抗體缺點：每檢查一種抗體需制備相應的特異抗體。第21頁，共42頁，2022年，5月20日，9點45分，星期四（3）酶聯(lián)免疫分析技術間接法測定抗體優(yōu)點：靈敏度高，在不同抗體的檢測中只需應用一種酶標抗體。既可檢測抗原，也可檢測抗體。第22頁，共42頁，2022年，5月20日，9點45分，星期四（3）酶聯(lián)免疫分析技術雙抗體夾心測定抗原第23頁，共42頁，2022年，5月20日，9點45分，星期四（3）酶聯(lián)免疫分析技術應用：檢測食品中農(nóng)、獸藥殘留及微生物；還可以檢測營養(yǎng)素，例如蛋白質、激素等。第24頁，共42頁，2022年，5月20日，9

12、點45分，星期四酶標儀第25頁，共42頁，2022年，5月20日，9點45分，星期四（4）發(fā)光免疫分析技術發(fā)光免疫分析：將發(fā)光分析和免疫反應相結合而建立起來的一種新的檢測微量抗原或抗體的新型標記免疫分析技術。發(fā)光:是指分子或原子中的電子吸收能量后，由基態(tài)（較低能級）躍遷到激發(fā)態(tài)（較高能級），然后再返回到基態(tài)，并釋放光子的過程。根據(jù)形成激發(fā)態(tài)分子的能量來源不同可分為:光照發(fā)光、生物發(fā)光、化學發(fā)光等。第26頁，共42頁，2022年，5月20日，9點45分，星期四（4）發(fā)光免疫分析技術化學發(fā)光免疫分析(chemiluminescence immunoassay,CLIA)：將具有高靈敏度的化學發(fā)光測

13、定技術與高特異性的免疫反應相結合，用于各種抗原、半抗原、抗體、激素、酶、脂肪酸、維生素和藥物等的檢測分析技術。是繼放免分析、酶免分析、熒光免疫分析之后發(fā)展起來的一項最新免疫測定技術。常用化學發(fā)光劑有直接化學發(fā)光劑和酶促反應發(fā)光劑。直接化學發(fā)光劑：吖啶酯，三聯(lián)吡啶釕 酶促反應發(fā)光劑：魯米諾及其衍生物，AMPPD第27頁，共42頁，2022年，5月20日，9點45分，星期四（4）發(fā)光免疫分析技術化學發(fā)光免疫技術基本原理：用參與催化某一化學發(fā)光反應的酶如辣根過氧化物酶（HRP）或堿性磷酸酶(ALP)來標記抗原或抗體，在與待測標本中相應的抗原(抗體)發(fā)生免疫反應后，形成固相包被抗體-待測抗原-酶標記抗

14、體復合物，經(jīng)洗滌后，加入底物(發(fā)光劑)，酶催化和分解底物發(fā)光，由光量子閱讀系統(tǒng)接收，光電倍增管將光信號轉變?yōu)殡娦盘柌⒓右苑糯?，再把它們傳送至計算機數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，計算出測定物的濃度。第28頁，共42頁，2022年，5月20日，9點45分，星期四辣根過氧化物酶標記化學發(fā)光-直接競爭法第29頁，共42頁，2022年，5月20日，9點45分，星期四辣根過氧化物酶標記化學發(fā)光-雙抗體夾心法第30頁，共42頁，2022年，5月20日，9點45分，星期四幾種標記免疫分析技術比較檢測方法檢測范圍生化、常規(guī)免疫mgg（10-3 10-6 g）熒光免疫、酶免疫gng（10-6 10-9 g）放射免疫、發(fā)光免疫ng

15、pg（10-9 10-12 g）PCRpgfg（10-12 10-15 g）第31頁，共42頁，2022年，5月20日，9點45分，星期四第三節(jié) 免疫生物傳感器免疫生物傳感器（immune-biosensor）是生物技術與微電子技術結合，利用生物體內(nèi)抗原、抗體轉移性結合而導致電化學變化的設備裝置。免疫傳感器分為兩類：利用競爭酶免疫反應原理設計：例如：黃曲霉毒素傳感器：氧化極和黃曲霉抗體膜組成檢測農(nóng)、獸殘留，微生物等利用親和性設計：例如：農(nóng)獸藥品種檢測食品添加劑、營養(yǎng)素（氨基酸、脂肪酸和糖類）以及農(nóng)獸藥等污染物。第32頁，共42頁，2022年，5月20日，9點45分，星期四免疫生物傳感器原理示意

16、圖緩沖液抗體生物傳感和傳輸元件檢測器廢液缸計算機待測樣品（酶標抗原）底物泵第33頁，共42頁，2022年，5月20日，9點45分，星期四第四節(jié) 免疫膠體金標記技術膠體金（colloidalgold）是由金鹽被還原成原金后形成的金顆粒懸液。膠體金顆粒由一個基礎金核及包圍在外的雙例子層構成，緊連在金核（Au）表面的是內(nèi)層負離子（AuCl2-），外層離子層H+則分散在膠體間溶液中，以維持膠體金游離于溶膠間的懸液狀態(tài)。免疫金：膠體金可與免疫活性物質（抗體或抗原）結合形成膠體金結合物，常稱為免疫金復合物（肉眼可見的紅色）。第34頁，共42頁，2022年，5月20日，9點45分，星期四第四節(jié) 免疫膠體金標

17、記技術檢測原理 ：以膠體金作為示蹤標記物，以微孔濾膜為固相載體，包被已知抗原或抗體，加入待測樣品后，經(jīng)濾膜毛細管作用，使標本中的抗原或抗體與膜上包被的抗體或抗原結合，膠體金結合物大量聚集時，肉眼可見紅色或粉紅色斑點，用于定性或半定量的快速免疫檢測。第35頁，共42頁，2022年，5月20日，9點45分，星期四檢測結果以血吸蟲抗體檢測試紙條為例 第36頁，共42頁，2022年，5月20日，9點45分，星期四第五節(jié) 免疫親和色譜免疫親和色譜（Immmuno affinity chromatography, IAC）是以抗原抗體的特異性、可逆性免疫結合反應為原理的色譜技術。特點：特異性強，結合容量大

18、，洗脫條件溫和，色譜柱可以方便地再生使用應用：作為免疫凈化柱，適用于復雜樣本中痕量農(nóng)獸藥殘留的分離分析。步驟：加樣洗滌洗脫 詳見下圖第37頁，共42頁，2022年，5月20日，9點45分，星期四免疫親和色譜柱示意圖第38頁，共42頁，2022年，5月20日，9點45分，星期四第六節(jié) 免疫印跡技術 免疫印跡(immunoblotting)又稱蛋白質印跡(Western blotting)，是一種借助特異性抗體鑒定抗原的有效方法。該法是在凝膠電泳和固相免疫測定技術基礎上發(fā)展起來的一種新的免疫生化技術。 將含有目標蛋白(抗原)的樣品首先用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS)或非變性電泳(Native)等分離后，通過轉移電泳原位轉印至硝酸纖維素膜或其它膜的表面，然后將膜表面的蛋白質再用抗原抗體反應進行特異性檢測。 第39頁，共42頁，2022年，5月20日，9點45分，星期四舉例 例如，將經(jīng)SDS分離的蛋白質帶轉移到膜上后，膜用