豐富環(huán)境對(duì)擬老性癡呆大鼠學(xué)習(xí)記憶和神經(jīng)元突觸可塑性影響研究培訓(xùn)課件

1、豐富環(huán)境對(duì)擬老性癡呆大鼠學(xué)習(xí)記憶和神經(jīng)元突觸可塑性影響研究豐富環(huán)境對(duì)擬老性癡呆大鼠學(xué)習(xí)記憶和神經(jīng)元突觸可塑性影響研究 研究背景 老年性癡呆即阿爾茨海默病(Alzheimer disease ,AD) 是老年人最常見的以進(jìn)行性癡呆為特征的神經(jīng)系統(tǒng)退行性變性疾病。目前臨床上治療老年癡呆缺乏有效的措施。近年來流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，單純生活方式的改變可以影響AD的發(fā)生和進(jìn)展，但機(jī)理不清楚。2豐富環(huán)境對(duì)擬老性癡呆大鼠學(xué)習(xí)記憶和神經(jīng)元突觸可塑性影響研究 研究背景 老年 豐富環(huán)境（EE）干預(yù)作為生活方式改變的一種形式，可促進(jìn)腦損傷及神經(jīng)變性疾病的恢復(fù)，包括外傷性顱腦損傷，癲癇持續(xù)狀態(tài)，帕金森病等。3豐富環(huán)境對(duì)擬

2、老性癡呆大鼠學(xué)習(xí)記憶和神經(jīng)元突觸可塑性影響研究 豐富環(huán)境（EE）干預(yù)作為生活方式改變的一種形式 豐富環(huán)境：1947年美國人Hebb提出豐富環(huán)境的概念，這一模式被廣泛用來研究環(huán)境對(duì)腦功能的影響，包括對(duì)正常動(dòng)物模型以及各種中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷模型的研究。 1978年豐富環(huán)境首次被定義為：復(fù)雜的無生命物與社會(huì)刺激的復(fù)合體。即動(dòng)物的飼養(yǎng)環(huán)境空間增大，內(nèi)置物體豐富而新奇,成員較多，不僅提供了多感官刺激和運(yùn)動(dòng)的機(jī)會(huì)，而且賦予了相互間社交行為的可能。4豐富環(huán)境對(duì)擬老性癡呆大鼠學(xué)習(xí)記憶和神經(jīng)元突觸可塑性影響研究 突觸可塑性：突觸可塑性是神經(jīng)可塑性的主要表現(xiàn)，可分為結(jié)構(gòu)可塑性和功能可塑性。突觸結(jié)構(gòu)可塑性指突觸形態(tài)的

3、改變以及新的突觸連接形成和傳遞功能的建立，是一種持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)的可塑性。突觸功能可塑性指突觸的反復(fù)活動(dòng)引致突觸傳遞效率的增加或降低5豐富環(huán)境對(duì)擬老性癡呆大鼠學(xué)習(xí)記憶和神經(jīng)元突觸可塑性影響研究 突觸可塑性：突觸可塑性 突觸的數(shù)密度(Nv)、平均面積(S)、面密度(Sv)被認(rèn)為是突觸可塑性形態(tài)學(xué)研究的可靠參數(shù) 突觸素的表達(dá)和突觸的形成是一致的，突觸素是突觸發(fā)生的一個(gè)重要標(biāo)志，突觸重建時(shí)突觸素含量明顯增多6豐富環(huán)境對(duì)擬老性癡呆大鼠學(xué)習(xí)記憶和神經(jīng)元突觸可塑性影響研究 突觸的數(shù)密度(Nv)、平均面積(S)、面密度(Sv)被 老年性癡呆最主要的病理改變是腦內(nèi)膽堿能神經(jīng)系統(tǒng)損傷及膽堿能神經(jīng)元丟失，也是造成學(xué)習(xí)

4、記憶能力下降的直接原因，因此本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用鵝膏蕈氨酸基底前腦注射，破壞模型動(dòng)物腦內(nèi)膽堿能神經(jīng)系統(tǒng)，造成膽堿能神經(jīng)元丟失，可模擬老年性癡呆7豐富環(huán)境對(duì)擬老性癡呆大鼠學(xué)習(xí)記憶和神經(jīng)元突觸可塑性影響研究 老年性癡呆最主要的病理改變是腦內(nèi)膽堿能神經(jīng)系統(tǒng) 本課題采用鵝膏蕈氨酸基底核前腦注射破壞模型動(dòng)物，造成膽堿能神經(jīng)元丟失 ，以模擬老年性癡呆，從神經(jīng)行為學(xué)、組織形態(tài)學(xué)、生物化學(xué)、分子生物學(xué)角度探討豐富環(huán)境對(duì)AD大鼠學(xué)習(xí)記憶及神經(jīng)元突觸可塑性影響，旨在揭示豐富環(huán)境干預(yù)AD作用機(jī)制，為豐富環(huán)境治療AD臨床推廣應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)8豐富環(huán)境對(duì)擬老性癡呆大鼠學(xué)習(xí)記憶和神經(jīng)元突觸可塑性影響研究 本課題采用鵝膏蕈氨酸基底核

5、前腦注射破壞模型動(dòng)物，造成膽堿能技術(shù)路線9豐富環(huán)境對(duì)擬老性癡呆大鼠學(xué)習(xí)記憶和神經(jīng)元突觸可塑性影響研究技術(shù)路線9豐富環(huán)境對(duì)擬老性癡呆大鼠學(xué)習(xí)記憶和神經(jīng)元突觸可塑性研究方法1、材料及豐富環(huán)境準(zhǔn)備Wistar大鼠，40只，雄性，體重160180g,清潔級(jí),隨機(jī)分為標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境正常組、標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境模型組，豐富環(huán)境模型組，豐富環(huán)境正常組各10只10豐富環(huán)境對(duì)擬老性癡呆大鼠學(xué)習(xí)記憶和神經(jīng)元突觸可塑性影響研究研究方法1、材料及豐富環(huán)境準(zhǔn)備10豐富環(huán)境對(duì)擬老性癡呆大鼠學(xué)豐富環(huán)境模型參照文獻(xiàn)加以改進(jìn)，鼠籠規(guī)格為120cm100cm60cm，籠內(nèi)設(shè)有金屬制小橋和斜架、直徑3cm隧道(聚氯乙烯樹脂材料制成)、塑料跑籠、金屬

6、鏈條、各種形狀及顏色的塑料玩具(球、盒、鈴檔等)和木制積木，每2-3d清潔并更換1次。籠內(nèi)安裝有L形隧道、塑料轉(zhuǎn)輪、小球等玩具，每籠5只，持續(xù)時(shí)間為28 d。11豐富環(huán)境對(duì)擬老性癡呆大鼠學(xué)習(xí)記憶和神經(jīng)元突觸可塑性影響研究豐富環(huán)境模型參照文獻(xiàn)加以改進(jìn)，鼠籠規(guī)格為120cm100c12豐富環(huán)境對(duì)擬老性癡呆大鼠學(xué)習(xí)記憶和神經(jīng)元突觸可塑性影響研究12豐富環(huán)境對(duì)擬老性癡呆大鼠學(xué)習(xí)記憶和神經(jīng)元突觸可塑性影響研豐富環(huán)境對(duì)擬老性癡呆大鼠學(xué)習(xí)記憶和神經(jīng)元突觸可塑性影響研究培訓(xùn)課件2、 動(dòng)物模型制作將大鼠用10%水合氯醛麻醉，腦立體定位儀固定平顱頭位，參照大鼠腦定位圖譜,在前囟前(AP)0.8mm、中線旁開(ML

7、)3.0mm處，距顱骨表面深度(DV)7.5mm雙側(cè)各注鵝膏蕈氨酸（購自sigma公司）1l(10g/L溶于0.5 M PBS中)，標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境對(duì)照組注射等量PBS14豐富環(huán)境對(duì)擬老性癡呆大鼠學(xué)習(xí)記憶和神經(jīng)元突觸可塑性影響研究2、 動(dòng)物模型制作14豐富環(huán)境對(duì)擬老性癡呆大鼠學(xué)習(xí)記憶和神經(jīng)3 指標(biāo)檢測(cè)3.1 采用物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)（ORT）和物體位置實(shí)驗(yàn)(OLT)評(píng)價(jià)大鼠的非空間學(xué)習(xí)、記憶能力，兩種測(cè)試任務(wù)沒有任何刺激源，不會(huì)影響動(dòng)物的自主活動(dòng)物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)是利用嚙齒類動(dòng)物喜歡對(duì)新的物體進(jìn)行探測(cè)的行為來判斷動(dòng)物是否記住了先前遇過的物體，如果記住了舊的物體，則動(dòng)物應(yīng)對(duì)舊的物體的探索時(shí)間少于新的物體15豐富環(huán)境對(duì)

8、擬老性癡呆大鼠學(xué)習(xí)記憶和神經(jīng)元突觸可塑性影響研究3 指標(biāo)檢測(cè)物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)是利用嚙齒類動(dòng)物喜歡對(duì)新的物體進(jìn)行探物體辨識(shí)實(shí)驗(yàn)（ORT）示意圖16豐富環(huán)境對(duì)擬老性癡呆大鼠學(xué)習(xí)記憶和神經(jīng)元突觸可塑性影響研究物體辨識(shí)實(shí)驗(yàn)（ORT）示意圖16豐富環(huán)境對(duì)擬老性癡呆大鼠學(xué)習(xí)物體位置辨識(shí)實(shí)驗(yàn)（OLT）示意圖17豐富環(huán)境對(duì)擬老性癡呆大鼠學(xué)習(xí)記憶和神經(jīng)元突觸可塑性影響研究物體位置辨識(shí)實(shí)驗(yàn)（OLT）示意圖17豐富環(huán)境對(duì)擬老性癡呆大鼠結(jié)果以辨識(shí)指數(shù)表示，越高即表示動(dòng)物的學(xué)習(xí)記憶能力越好，反之學(xué)習(xí)記憶能力差。辨識(shí)指數(shù)（DI）計(jì)算公式：DI = (Tn Tf) / (Tf + Tn)其中Tn代表大鼠在識(shí)別期探索新物體的時(shí)間

9、，Tf代表大鼠在識(shí)別期探索舊物體的時(shí)間。18豐富環(huán)境對(duì)擬老性癡呆大鼠學(xué)習(xí)記憶和神經(jīng)元突觸可塑性影響研究結(jié)果以辨識(shí)指數(shù)表示，越高即表示動(dòng)物的學(xué)習(xí)記憶能力越好，反之學(xué)3.2 海馬突觸形態(tài)可塑性檢測(cè) （1）電鏡標(biāo)本制備及觀察 3%戊巴比妥麻醉斷頭剝腦取海馬固定丙酮梯度脫水浸透包埋切片(厚600A0)230目銅網(wǎng)撈片3%檸檬酸鉛+0.1%醋酸鈾雙重電子染色觀察突觸Nv、Sv，S 19豐富環(huán)境對(duì)擬老性癡呆大鼠學(xué)習(xí)記憶和神經(jīng)元突觸可塑性影響研究3.2 海馬突觸形態(tài)可塑性檢測(cè)19豐富環(huán)境對(duì)擬老性癡呆大鼠學(xué) 突觸的數(shù)密度(NV)即單位參照系體積中突觸的數(shù)目，是揭示參與某一神經(jīng)活動(dòng)過程的神經(jīng)元接點(diǎn)數(shù)目的直接指標(biāo)

10、。 突觸的面密度(SV)為單位參照系體積中的突觸面積，突觸數(shù)量和大小的綜合性指標(biāo)，反映的是突觸連接帶表面積在組織中的密度 平均面積(S)為突觸連接帶的平均面積20豐富環(huán)境對(duì)擬老性癡呆大鼠學(xué)習(xí)記憶和神經(jīng)元突觸可塑性影響研究20豐富環(huán)境對(duì)擬老性癡呆大鼠學(xué)習(xí)記憶和神經(jīng)元突觸可塑性影響研（2）組織切片制備 麻醉取左側(cè)大腦半球福爾馬林固定脫水透明石蠟包埋切片21豐富環(huán)境對(duì)擬老性癡呆大鼠學(xué)習(xí)記憶和神經(jīng)元突觸可塑性影響研究（2）組織切片制備21豐富環(huán)境對(duì)擬老性癡呆大鼠學(xué)習(xí)記憶和神經(jīng)取腦：每組隨機(jī)取7只大鼠麻醉，斷頭處死，在冰臺(tái)上快速取出腦組織，分離出左側(cè)大腦半球，將附著在腦組織上的腦膜剝離干凈后，從前額開始

11、冠狀位將腦組織切成從前至后切成4部分22豐富環(huán)境對(duì)擬老性癡呆大鼠學(xué)習(xí)記憶和神經(jīng)元突觸可塑性影響研究取腦：每組隨機(jī)取7只大鼠麻醉，斷頭處死，在冰臺(tái)上快速取出腦組（3）免疫組織化學(xué)反應(yīng) 滴加3%過氧化氫甲醇溶液，室溫孵育10 min,PBS沖洗加非免疫性動(dòng)物血清，室溫孵育30min加突觸素抗體，4C孵育24h,PBS沖洗滴加第二抗體，室溫孵育30min,PBS沖洗加鏈親和素過氧化物酶溶液，室溫孵育30 min,PBS洗3次DAB顯色3-10 min貼片、常規(guī)脫水、透明封片 23豐富環(huán)境對(duì)擬老性癡呆大鼠學(xué)習(xí)記憶和神經(jīng)元突觸可塑性影響研究（3）免疫組織化學(xué)反應(yīng)23豐富環(huán)境對(duì)擬老性癡呆大鼠學(xué)習(xí)記憶和 陰

12、性對(duì)照組省去第一抗體，其余步驟相同。 在全自動(dòng)圖像分析系統(tǒng)測(cè)定海馬突觸素免疫反應(yīng)物的光密度值(OD值)，同時(shí)在相同的光學(xué)條件下測(cè)定相應(yīng)每張切片胼胝體OD值作背景，免疫反應(yīng)物的OD值減去背景OD值得到校正OD值，即免疫反應(yīng)物的光密度值24豐富環(huán)境對(duì)擬老性癡呆大鼠學(xué)習(xí)記憶和神經(jīng)元突觸可塑性影響研究 陰性對(duì)照組省去第一抗體，其余步驟相同。 24豐富環(huán)境對(duì) 預(yù)期目標(biāo) 豐富環(huán)境可能會(huì)改善擬老年癡呆(AD)大鼠學(xué)習(xí)記憶，增強(qiáng)海馬突觸的可塑性，促進(jìn)突觸結(jié)構(gòu)重建。豐富環(huán)境可成為AD重要治療手段。25豐富環(huán)境對(duì)擬老性癡呆大鼠學(xué)習(xí)記憶和神經(jīng)元突觸可塑性影響研究 預(yù)期目標(biāo) 豐富 研究進(jìn)度2011年3月2011年6月 模型制作、神經(jīng)行為學(xué)測(cè)定。 2011年7月2011年10月 檢測(cè)