蛋白質(zhì)工程論文

1、論文蛋白質(zhì)工程第二代遺傳工程技術(shù)背景：目前,蛋白質(zhì)工程技術(shù)日趨成熟,已經(jīng)公認(rèn)是第二代遺傳工程技術(shù)。美國(guó)加利福尼亞州的兩個(gè)生物技術(shù)公司Genentech和Cetus在這個(gè)領(lǐng)域正處于領(lǐng)先地位。工業(yè)上日益需要具有特殊性質(zhì)的新的耐熱、耐酸堿的穩(wěn)定蛋白質(zhì)。酶是特殊類型的蛋白質(zhì),只能在較窄的條件(類似于產(chǎn)酶的動(dòng)物或植物細(xì)胞內(nèi)的條件)范圍內(nèi)起作用。因此,酶很昂貴,容易變性。要獲得穩(wěn)定酶,一個(gè)途徑是蛋白質(zhì)工程。概念：中文名稱：蛋白質(zhì)工程 英文名稱：protein engineering 定義1：按人們意志改變蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能或創(chuàng)造新的蛋白質(zhì)的過(guò)程。包括在體外改造已有的蛋白質(zhì)，化學(xué)合成新的蛋白質(zhì)，通過(guò)基因工程

2、手段改造已有的或創(chuàng)建新的編碼蛋白質(zhì)的基因去合成蛋白質(zhì)等。為獲得的新蛋白具備有意義的新性質(zhì)或新功能，常對(duì)已知的其他蛋白質(zhì)進(jìn)行模式分析或采取分子進(jìn)化等手段。定義2：利用遺傳工程手段，包括用基因的點(diǎn)突變和基因表達(dá)等改造蛋白質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)與功能的技術(shù)。 蛋白質(zhì)工程蛋白質(zhì)工程，是指在基因工程的基礎(chǔ)上，結(jié)合蛋白質(zhì)結(jié)晶學(xué)，計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)和蛋白質(zhì)化學(xué)等多學(xué)科的基礎(chǔ)知識(shí)通過(guò)對(duì)基因的人工定向改造等手段，對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行修飾，改造和拼接以生產(chǎn)出能滿足人類需要的新型蛋白質(zhì)的技術(shù)。研究?jī)?nèi)容：蛋白質(zhì)工程是在基因重組技術(shù)、生物化學(xué)、分子生物學(xué)、分子遺傳學(xué)等學(xué)科的基礎(chǔ)之上，融合了蛋白質(zhì)晶體學(xué)、蛋白質(zhì)動(dòng)力學(xué)、蛋白質(zhì)化學(xué)和計(jì)算機(jī)輔助設(shè)

3、計(jì)等多學(xué)科而發(fā)展起來(lái)的新興研究領(lǐng)域。其內(nèi)容主要有兩個(gè)方面：根據(jù)需要合成具有特定氨基酸序列和空間結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)；確定蛋白質(zhì)化學(xué)組成、空間結(jié)構(gòu)與生物功能之間的關(guān)系。在此基礎(chǔ)之上，實(shí)現(xiàn)從氨基酸序列預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)和生物功能，設(shè)計(jì)合成具有特定生物功能的全新的蛋白質(zhì)，這也是蛋白質(zhì)工程最根本的目標(biāo)之一。原理：蛋白質(zhì)是生命的體現(xiàn)者，離開(kāi)了蛋白質(zhì)，生命將不復(fù)存在。可是，生物體內(nèi)存在的天然蛋白質(zhì)，有的往往不盡人意，需要進(jìn)行改造。由于蛋白質(zhì)是由許多氨基酸按一定順序連接而成的，每一種蛋白質(zhì)有自己獨(dú)特的氨基酸順序，所以改變其中關(guān)鍵的氨基酸就能改變蛋白質(zhì)的性質(zhì)。而氨基酸是由三聯(lián)體密碼決定的，只要改變構(gòu)成遺傳密碼的一個(gè)

4、或兩個(gè)堿基就能達(dá)到改造蛋白質(zhì)的目的。蛋白質(zhì)工程的一個(gè)重要途徑就是根據(jù)人們的需要，對(duì)負(fù)責(zé)編碼某種蛋白質(zhì)的基因重新進(jìn)行設(shè)計(jì)，使合成的蛋白質(zhì)變得更符合人類的需要。這種通過(guò)造成一個(gè)或幾個(gè)堿基定點(diǎn)突變，以達(dá)到修飾蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)目的的技術(shù)，稱為基因定點(diǎn)突變技術(shù)。 蛋白質(zhì)工程是在基因重組技術(shù)、生物化學(xué)、分子生物學(xué)、分子遺傳學(xué)等學(xué)科的基礎(chǔ)之上，融合了蛋白質(zhì)晶體學(xué)、蛋白質(zhì)動(dòng)力學(xué)、蛋白質(zhì)化學(xué)和計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)等多學(xué)科而發(fā)展起來(lái)的新興研究領(lǐng)域。其內(nèi)容主要有蛋白質(zhì)工程原理與技術(shù)兩個(gè)方面：根據(jù)需要合成具有特定氨基酸序列和空間結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)；確定蛋白質(zhì)化學(xué)組成、空間結(jié)構(gòu)與生物功能之間的關(guān)系。在此基礎(chǔ)之上，實(shí)現(xiàn)從氨基酸序列預(yù)測(cè)

5、蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)和生物功能，設(shè)計(jì)合成具有特定生物功能的全新的蛋白質(zhì)，這也是蛋白質(zhì)工程最根本的目標(biāo)之一。 一編輯本段蛋白質(zhì)工程的基本途徑從預(yù)期的蛋白質(zhì)功能出發(fā)設(shè)計(jì)預(yù)期的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)推測(cè)應(yīng)有的氨基酸序列找到相對(duì)應(yīng)的核糖核苷酸序列（RNA）找到相對(duì)應(yīng)的脫氧核糖核苷酸序列（DNA）蛋白質(zhì)工程是指以蛋白質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)規(guī)律及其與生物功能的關(guān)系作為基礎(chǔ)，通過(guò)基因修飾或基因合成，對(duì)現(xiàn)有蛋白質(zhì)進(jìn)行改造，或制造一種新的蛋白質(zhì)，以滿足人類的生產(chǎn)和生活的需求。也就是說(shuō)，蛋白質(zhì)工程是在基因工程的基礎(chǔ)上，延伸出來(lái)的第二代基因工程，是包含多學(xué)科的綜合科技工程領(lǐng)域。二編輯本段研究的核心內(nèi)容蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析蛋白質(zhì)工程的核心內(nèi)容之一就

6、是收集大量的蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)的信息，以便建立結(jié)構(gòu)與功能之間關(guān)系的數(shù)據(jù)庫(kù)，為蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能之間關(guān)系的理論研究奠定基礎(chǔ)。三維空間結(jié)構(gòu)的測(cè)定是驗(yàn)證蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)的假設(shè)即證明是新結(jié)構(gòu)改變了原有生物功能的必需手段。晶體學(xué)的技術(shù)在確定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)方面有了很大發(fā)展，但是最明顯的不足是需要分離出足夠量的純蛋白質(zhì)（幾毫克幾十毫克），制備出單晶體，然后再進(jìn)行繁雜的數(shù)據(jù)收集、計(jì)算和分析。另外，蛋白質(zhì)的晶體狀態(tài)與自然狀態(tài)也不盡相同，在分析的時(shí)候要考慮到這個(gè)問(wèn)題。核磁共振技術(shù)可以分析液態(tài)下的肽鏈結(jié)構(gòu)，這種方法繞過(guò)了結(jié)晶、X射線衍射成像分析等難點(diǎn)，直接分析自然狀態(tài)下的蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)?，F(xiàn)代核磁共振技術(shù)已經(jīng)從一維發(fā)展到三維，在計(jì)算機(jī)

7、的輔助下，可以有效地分析并直接模擬出蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)、蛋白質(zhì)與輔基和底物結(jié)合的情況以及酶催化的動(dòng)態(tài)機(jī)理。從某種意義上講，核磁共振可以更有效地分析蛋白質(zhì)的突變。國(guó)外有許多研究機(jī)構(gòu)正在致力于研究蛋白質(zhì)與核酸、酶抑制劑與蛋白質(zhì)的結(jié)合情況，以開(kāi)發(fā)具有高度專一性的藥用蛋白質(zhì)。三結(jié)構(gòu)、功能的設(shè)計(jì)和預(yù)測(cè)根據(jù)對(duì)天然蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能分析建立起來(lái)的數(shù)據(jù)庫(kù)里的數(shù)據(jù)，可以預(yù)測(cè)一定氨基酸序列肽鏈空間結(jié)構(gòu)和生物功能；反之也可以根據(jù)特定的生物功能，設(shè)計(jì)蛋白質(zhì)的氨基酸序列和空間結(jié)構(gòu)。通過(guò)基因重組等實(shí)驗(yàn)可以直接考察分析結(jié)構(gòu)與功能之間的關(guān)系；也可以通過(guò)分子動(dòng)力學(xué)、分子熱力學(xué)等，根據(jù)能量最低、同一位置不能同時(shí)存在兩個(gè)原子等基本原則

8、分析計(jì)算蛋白質(zhì)分子的立體結(jié)構(gòu)和生物功能。雖然這方面的工作尚在起步階段，但可預(yù)見(jiàn)將來(lái)能建立一套完整的理論來(lái)解釋結(jié)構(gòu)與功能之間的關(guān)系，用以設(shè)計(jì)、預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能。四創(chuàng)造和改造蛋白質(zhì)的改造，從簡(jiǎn)單的物理、化學(xué)法到復(fù)雜的基因重組等等有多種方法。物理、化學(xué)法：對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行變性、復(fù)性處理，修飾蛋白質(zhì)側(cè)鏈官能團(tuán)，分割肽鏈，改變表面電荷分布促進(jìn)蛋白質(zhì)形成一定的立體構(gòu)像等等；生物化學(xué)法：使用蛋白酶選擇性地分割蛋白質(zhì)，利用轉(zhuǎn)糖苷酶、酯酶、酰酶等去除或連接不同化學(xué)基團(tuán)，利用轉(zhuǎn)酰胺酶使蛋白質(zhì)發(fā)生膠連等等。以上方法只能對(duì)相同或相似的基團(tuán)或化學(xué)鍵發(fā)生作用，缺乏特異性，不能針對(duì)特定的部位起作用。采用基因重組技術(shù)或人工

9、合成DNA，不但可以改造蛋白質(zhì)而且可以實(shí)現(xiàn)從頭合成全新的蛋白質(zhì)。 蛋白質(zhì)是由不同氨基酸按一定順序通過(guò)肽鍵連接而成的肽構(gòu)成的。氨基酸序列就是蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)，它決定著蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)和生物功能。而氨基酸序列是由合成蛋白質(zhì)的基因的DNA序列決定的，改變DNA序列就可以改變蛋白質(zhì)的氨基酸序列，實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)的可調(diào)控生物合成。在確定基因序列或氨基酸序列與蛋白質(zhì)功能之間關(guān)系之前，宜采用隨機(jī)誘變，造成堿基對(duì)的缺失、插入或替代，這樣就可以將研究目標(biāo)限定在一定的區(qū)域內(nèi)，從而大大減少基因分析的長(zhǎng)度。一旦目標(biāo)DNA明確以后，就可以運(yùn)用定位突變等技術(shù)來(lái)進(jìn)行研究。 定位突變蛋白質(zhì)中的氨基酸是由基因中的三聯(lián)密碼決定的，只要

10、改變其中的一個(gè)或兩個(gè)就可以改變氨基酸。通常是改變某個(gè)位置的氨基酸，研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、穩(wěn)定性或催化特性。噬菌體M13的生活周期有二個(gè)階段，在噬菌體粒子中其基因組為單鏈，侵入宿主細(xì)胞以后，通過(guò)復(fù)制以雙鏈形式存在。將待研究的基因插入載體M13，制得單鏈模板，人工合成一段寡核苷酸（其中含一個(gè)或幾個(gè)非配對(duì)堿基）作為引物，合成相應(yīng)的互補(bǔ)鏈，用T4連接酶連接成閉環(huán)雙鏈分子。經(jīng)轉(zhuǎn)染大腸桿菌，雙鏈分子在胞內(nèi)分別復(fù)制，因此就得到兩種類型的噬菌斑，含錯(cuò)配堿基的就為突變型。再轉(zhuǎn)入合適的表達(dá)系統(tǒng)合成突變型蛋白質(zhì)。 盒式突變1985年Wells提出的一種基因修飾技術(shù)盒式突變，一次可以在一個(gè)位點(diǎn)上產(chǎn)生20種不同氨基酸的突變體

11、，可以對(duì)蛋白質(zhì)分子中重要氨基酸進(jìn)行“飽和性”分析。利用定位突變?cè)跀M改造的氨基酸密碼兩側(cè)造成兩個(gè)原載體和基因上沒(méi)有的內(nèi)切酶切點(diǎn)，用該內(nèi)切酶消化基因，再用合成的發(fā)生不同變化的雙鏈DNA片段替代被消化的部分。這樣一次處理就可以得到多種突變型基因。 PCR技術(shù)DNA聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)是應(yīng)用最廣泛的基因擴(kuò)增技術(shù)。以研究基因?yàn)槟０澹萌斯ず铣傻墓押塑账幔ê幸粋€(gè)或幾個(gè)非互補(bǔ)的堿基）為引物，直接進(jìn)行基因擴(kuò)增反應(yīng)，就會(huì)產(chǎn)生突變型基因。分離出突變型基因后，在合適的表達(dá)系統(tǒng)中合成突變型蛋白質(zhì)。這種方法直接、快速和高效。高突變率技術(shù)從大量的野生型背景中篩選出突變型是一項(xiàng)耗時(shí)、費(fèi)力的工作。有兩種新的突變方法具有較高的突變

12、率：硫代負(fù)鏈法：核苷酸間磷酸基的氧被硫替代后修飾物（S）dCTP）對(duì)某些內(nèi)切酶有耐性，在有引物和（S）dCTP）存在下合成負(fù)鏈，然后用內(nèi)切酶處理，結(jié)果僅在正鏈上產(chǎn)生“缺蛋白質(zhì)工程口”，用核苷酸外切酶III從35擴(kuò)大缺口并超過(guò)負(fù)鏈上錯(cuò)配的核苷酸，在聚合酶作用下修復(fù)正鏈，就可以得到二條鏈均為突變型的基因；UMP正鏈法：大腸桿菌突變株RZ1032中缺少脲嘧啶糖苷酶和UTP酶，M13在這種宿主中可以用脲嘧啶（U）替代胸腺嘧啶（T）摻入模板而不被修飾。用這種含U的模板產(chǎn)生的突變雙鏈轉(zhuǎn)化正常大腸桿菌，結(jié)果含U的正鏈被寄主降解，而突變型負(fù)鏈保留并復(fù)制。蛋白質(zhì)融合將編碼一種蛋白質(zhì)的部分基因移植到另一種蛋白質(zhì)基

13、因上或?qū)⒉煌鞍踪|(zhì)基因的片段組合在一起，經(jīng)基因克隆和表達(dá)，產(chǎn)生出新的融合蛋白質(zhì)。這種方法可以將不同蛋白質(zhì)的特性集中在一種蛋白質(zhì)上，顯著地改變蛋白質(zhì)的特性?，F(xiàn)在研究的較多的所謂“嵌合抗體”和“人緣化抗體”等，就是采用的這種方法。應(yīng)用：1.提高蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性 葡萄糖異構(gòu)酶（GI）在工業(yè)上應(yīng)用廣泛，為提高其熱穩(wěn)定性，朱國(guó)萍等人在確定第138位甘氨酸(Gly138)為目標(biāo)氨基酸后，用雙引物法對(duì)GI基因進(jìn)行體外定點(diǎn)誘變，以脯氨酸（Pro138）替代Gly138，含突變體的重組質(zhì)粒在大腸桿菌中表達(dá)，結(jié)果突變型GI比野生型的熱半衰期長(zhǎng)一倍；最適反應(yīng)溫度提高1012；酶比活相同。據(jù)分析，Pro替代Gly138

14、后，可能由于引入了一個(gè)吡咯環(huán)，該側(cè)鏈剛好能夠填充于Gly138附近的空洞，使蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)更具剛性，從而提高了酶的熱穩(wěn)定性。 2融合蛋白質(zhì) 腦啡肽(Enk)N端5肽線形結(jié)構(gòu)是與型受體結(jié)合的基本功能區(qū)域，干擾素（IFN）是一種廣譜抗病毒抗腫瘤的細(xì)胞因子。黎孟楓等人化學(xué)合成了EnkN端5肽編碼區(qū)，通過(guò)一連接3肽編碼區(qū)與人1型IFN基因連接，在大腸桿菌中表達(dá)了這一融合蛋白。以體外人結(jié)腸腺癌細(xì)胞和多形膠質(zhì)瘤細(xì)胞為模型，采用3H胸腺嘧啶核苷摻入法證明該融合蛋白抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的活性顯著高于單純的IFN，通過(guò)Naloxone競(jìng)爭(zhēng)阻斷實(shí)驗(yàn)證明，抑制活性的增高確由Enk導(dǎo)向區(qū)介導(dǎo)。 3.蛋白質(zhì)活性的改變 通常

15、飯后3060min，人血液中胰島素的含量達(dá)到高峰，120180min內(nèi)恢復(fù)到基礎(chǔ)水平。而目前臨床上使用的胰島素制劑注射后120min后才出現(xiàn)高峰且持續(xù)180240min，與人生理狀況不符。實(shí)驗(yàn)表明，胰島素在高濃度（大于105mol/L）時(shí)以二聚體形式存在，低濃度時(shí)（小于109mol/L）時(shí)主要以單體形式存在。設(shè)計(jì)速效胰島素原則就是避免胰島素形成聚合體。類胰島素生長(zhǎng)因子I(IGFI)的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)與胰島素具有高度的同源性和三維結(jié)構(gòu)的相似性，但I(xiàn)GFI不形成二聚體。IGFI的B結(jié)構(gòu)域（與胰島素B鏈相對(duì)應(yīng)）中B28B29氨基酸序列與胰島素B鏈的B28B29相比，發(fā)生顛倒。因此，將胰島素B鏈改為B28L

16、ysB29Pro，獲得單體速效胰島素。該速效胰島素已通過(guò)臨床實(shí)驗(yàn)。 4.治癌酶的改造 癌癥的基因治療分二個(gè)方面：藥物作用于癌細(xì)胞，特異性地抑制或殺死癌細(xì)胞；藥物保護(hù)正常細(xì)胞免受化學(xué)藥物的侵害，可以提高化學(xué)治療的劑量。皰癥病毒（HSV）胸腺嘧啶激酶(TK)可以催化胸腺嘧啶和其他結(jié)構(gòu)類似物如GANCICLOVIR和ACYCLOVIR無(wú)環(huán)鳥(niǎo)苷磷酸化。GANCICLOVIR和ACYCLOVIR缺少3端羥基，就可以終止DNA的合成，從而殺死癌細(xì)胞。HSVTK催化GANCICLOVIR和ACYCLOVIR的能力可以通過(guò)基因突變來(lái)提高。從大量的隨機(jī)突變中篩選出一種，在酶活性部位附近有6個(gè)氨基酸被替換，催化能

17、力分別提高43和20倍。O6烷基鳥(niǎo)嘌呤是DNA經(jīng)烷基化劑（包括化療用亞硝基藥物）處理以后形成的主要誘變劑和細(xì)胞毒素，所以這些亞硝基藥物的使用劑量受到限制。O6烷基鳥(niǎo)嘌呤DNA烷基轉(zhuǎn)移酶O6AlkylguanineDNAalkyltransferase(AGT)能夠?qū)ⅧB(niǎo)嘌呤O6上的烷基去除掉，起到保護(hù)作用。通過(guò)反向病毒轉(zhuǎn)染，人類AGT在鼠骨髓細(xì)胞中表達(dá)并起到保護(hù)作用。通過(guò)突變處理，得到一些正突變AGT基因且活性都比野生型的高，經(jīng)檢查發(fā)現(xiàn)一個(gè)突變基因中的第139位脯氨酸被丙氨酸替代。 5. 嵌合抗體和人緣化抗體 免疫球蛋白呈Y型，由二條重鏈和二條輕鏈通過(guò)二硫鍵相互連接而構(gòu)成。每條鏈可分為可變區(qū)（N

18、端）和恒定區(qū)（C端），抗原的吸附位點(diǎn)在可變區(qū)，細(xì)胞毒素或其他功能因子的吸附位點(diǎn)在恒定區(qū)。每個(gè)可變區(qū)中有三個(gè)部分在氨基酸序列上是高度變化，在三維結(jié)構(gòu)上是處在折疊端頭的松散結(jié)構(gòu)（CDR），是抗原的結(jié)合位點(diǎn)，其余部分為CDR的支持結(jié)構(gòu)。不同種屬的CDR結(jié)構(gòu)是保守的，這樣就可以通過(guò)蛋白質(zhì)工程對(duì)抗體進(jìn)行改造。 鼠單克隆抗體被人免疫系統(tǒng)排斥，它潛在的治療作用得不到利用。嵌合抗體就是用人抗體的恒定區(qū)替代鼠單克隆抗體的恒定區(qū)，這樣它的免疫原性就顯著下降。如用于治療直腸結(jié)腸腺癌（COLORECTALADENOCARCINOMA）的單克隆抗體Mab171A。盡管嵌合抗體還存在著免疫原的問(wèn)題，但仍有幾種嵌合抗體通過(guò)了臨床實(shí)驗(yàn)。所謂人緣化抗體就是將抗原吸附區(qū)域嫁接到人抗體上，這樣抗體上的外源肽鏈降低到最小，免疫原性也就最小。但是，僅將CDR轉(zhuǎn)接到人抗體上，其抗原吸附能力很小，必須帶上幾個(gè)框架氨基酸殘基，才能保持原有的吸附力。這樣就存在免疫原性與抗原吸附力