醫(yī)學(xué)碩士答辯歐琴答辯課件

1、EBV LMP2 B細(xì)胞表位的預(yù)測(cè)、克隆、表達(dá)及其融合蛋白免疫原性的初步研究溫州醫(yī)學(xué)院2004級(jí)碩士學(xué)位論文答辯答辯人：歐 琴導(dǎo) 師：張麗芳 教授 夏克棟 教授專 業(yè)：病原生物學(xué)2007.5.17醫(yī)學(xué)碩士答辯歐琴答辯1EBV LMP2 B細(xì)胞表位的預(yù)測(cè)、克隆、表達(dá)及其融合蛋白免主 要 內(nèi) 容 研究背景 研究目的 研究方案 結(jié) 果 分析與討論 結(jié) 論醫(yī)學(xué)碩士答辯歐琴答辯2主 要 內(nèi) 容醫(yī)學(xué)碩士答辯歐琴答辯2研 究 背 景 EB病毒(Epstein-Barr virua,EBV)屬于皰疹病毒科。引起的主要疾病包括傳染性單核細(xì)胞增多癥、移植后淋巴細(xì)胞增多癥(PTLD)、霍奇金病、Burkitt淋巴瘤

2、以及鼻咽癌(NPC)。醫(yī)學(xué)碩士答辯歐琴答辯3研 究 背 景 EB病毒(Eps研 究 背 景 腫瘤 亞型 EBV陽(yáng)性率表1 EBV相關(guān)的增生性疾病Burkitt淋巴瘤 E-BL 100% S-BL 15%-85% AIDS-BL 100%NPC 低分化或未分化 100霍奇金病 mc/ld 80%-90% ns 30T細(xì)胞淋巴瘤 fatal IM 100% AILD 40%淋巴母細(xì)胞瘤 fatal IM 100% 與器官移植相關(guān) 100 與AIDS相關(guān) 70-80% 醫(yī)學(xué)碩士答辯歐琴答辯4研 究 背 景 腫瘤 研 究 背 景 LMP2不是轉(zhuǎn)化基因，維持EBV潛伏感染。 LMP2成為NPC等EBV相

3、關(guān)腫瘤治療的理想 靶抗原之一。 醫(yī)學(xué)碩士答辯歐琴答辯5研 究 背 景 LMP2不是轉(zhuǎn)化基因，維持EB研 究 背 景表位疫苗是目前研制感染性疾病與惡性腫瘤疫苗的方向。多表位疫苗能選擇性誘導(dǎo)多價(jià)、多特異性應(yīng)答和控制免疫應(yīng)答類型。醫(yī)學(xué)碩士答辯歐琴答辯6研 究 背 景表位疫苗是目前研制感染性疾病與惡性腫瘤疫研 究 背 景 NPC患者血清中能檢測(cè)LMP2抗體。 B細(xì)胞表位的研究為單克隆抗體的制備提供更充分的依據(jù)，以B細(xì)胞表位為基礎(chǔ)的多肽 抗原可用于血清學(xué)檢測(cè)。 醫(yī)學(xué)碩士答辯歐琴答辯7研 究 背 景 NPC患者血清中能檢測(cè)LM研 究 目 的 1. 預(yù)測(cè)EBV LMP2的B細(xì)胞表位，可為其單克隆抗體的制備及

4、表位疫苗設(shè)計(jì)等研究提供理論依據(jù)。 2. 分別構(gòu)建含預(yù)測(cè)B細(xì)胞表位多肽的原核重組質(zhì)粒，采用6個(gè)組氨酸標(biāo)簽(His.tag)表達(dá)表位融合蛋白，并用Ni-NTA樹脂親和層析法分別純化表位融合蛋白。 3. 將純化的蛋白分別免疫小鼠，檢測(cè)其誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生的特異性IgG抗體；選擇抗原性強(qiáng)的融合蛋白作包被抗原，用ELISA檢測(cè)NPC組、CA疾病對(duì)照組和健康對(duì)照組的血清特異性抗體。為B細(xì)胞表位多肽的免疫原性和抗原性及其在NPC血清學(xué)診斷中的應(yīng)用價(jià)值進(jìn)行初步探討。 醫(yī)學(xué)碩士答辯歐琴答辯8研 究 目 的 1. 預(yù)測(cè)EBV LMP研 究 方 案一、EBV LMP2的二級(jí)結(jié)構(gòu)分析和B細(xì)胞表位預(yù)測(cè)醫(yī)學(xué)碩士答辯歐琴答辯9研

5、 究 方 案一、EBV LMP2的二級(jí)結(jié)構(gòu)分析醫(yī)學(xué)碩研 究 方 案采用EXPASY服務(wù)器提供的SwissProt蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)檢索LMP2完整蛋白質(zhì)的氨基酸序列 (http:/);采用EXPASY服務(wù)器提供的SOPMA、GOR、nnPredict、HNN方法預(yù)測(cè)LMP2二級(jí)結(jié)構(gòu)(http:/tools) ；采用EXPASY服務(wù)器提供的SOSUI方法預(yù)測(cè)LMP2跨膜區(qū)域(http:/tools) ；采用EXPASY服務(wù)器提供的Hopp&Woods、Emini、Jameson-Wolf、Zimmerman方法預(yù)測(cè)LMP2的親水性、表面可及性、抗原性、極性及柔韌性參數(shù)() ；對(duì)上述方法預(yù)測(cè)的結(jié)果進(jìn)行綜

6、合分析，推斷LMP2的B細(xì)胞表位，并用吳玉章等建立的抗原性指數(shù)(AI) 綜合評(píng)判EBV LMP2的B細(xì)胞優(yōu)勢(shì)表位。醫(yī)學(xué)碩士答辯歐琴答辯10研 究 方 案采用EXPASY服務(wù)器提供的SwissP研 究 方 案二、EBV LMP2 B細(xì)胞表位的克隆、表達(dá)及其融合蛋白的純化醫(yī)學(xué)碩士答辯歐琴答辯11研 究 方 案二、EBV LMP2 B細(xì)胞表位的克隆、研 究 方 案引物設(shè)計(jì)與合成退火獲得目的基因pET32a (+)/EBV-LMP2 B細(xì)胞表位重組質(zhì)粒的構(gòu)建純化、連接、轉(zhuǎn)化DH5大腸桿菌轉(zhuǎn)化BL21大腸桿菌，誘導(dǎo)、表達(dá)、純化表位融合蛋白SDS、Western blot分析pET32a (+)質(zhì)粒酶切酶

7、切、測(cè)序鑒定醫(yī)學(xué)碩士答辯歐琴答辯12研 究 方 案引物設(shè)計(jì)與合成退火獲得目的基因pET32研 究 方 案引物 堿基序列 酶切位點(diǎn)OZLF-67 5TCGAGTTACAGCAGGCTGTTAA BamHI AGGGCGGATCTTCGATGCGG 3OZLF-68 5GATCCCGCATCGAAGATCCGCC XhoI CTTTAACAGCCTGCTGTAAC 3 OZLF-69 5TCGAGTTAAGTGAGATTTAAGGTG 3 BamHI OZLF-70 5GATCCACCTTAAATCTCACTTAAC 3 XhoI OZLF-71 5TCGAGTTAATTCGGGATAAATTC

8、BamHI TGTGCTGGACAATGATTTG 3 OZLF-72 5GATCCAAATCATTGTCCAGCACA XhoI GAATTTATCCCGAATTAAC 3 醫(yī)學(xué)碩士答辯歐琴答辯13研 究 方 案引物 圖1 pET32a/B細(xì)胞表位的重組質(zhì)粒圖研 究 方 案醫(yī)學(xué)碩士答辯歐琴答辯14圖1 pET32a/B細(xì)胞表位的重組質(zhì)粒圖研 究 方 研 究 方 案層析純化蛋白：灌 膠Buffer B液調(diào)節(jié)吸光度和透光度樣本處理樣本加入層析柱中，收集濾液Buffer B液洗滌，至A0.01，收集濾液Buffer D液洗滌，至A0.01，收集濾液Buffer E液洗滌，至A0.01，收集濾液樣本

9、收集SDS分析濾液中目的蛋白分布情況Buffer B: 8M尿素(pH8.0)Buffer D: 8M尿素(pH6.8)Buffer E: 8M尿素(pH4.0)醫(yī)學(xué)碩士答辯歐琴答辯15研 究 方 案層析純化蛋白：灌 膠Buffer 研 究 方 案三、EBV LMP2 B細(xì)胞表位融合蛋白免疫原性的初步研究及血清學(xué)檢測(cè)醫(yī)學(xué)碩士答辯歐琴答辯16研 究 方 案三、EBV LMP2 B細(xì)胞表位融合蛋白研 究 方 案動(dòng)物：ICR小鼠免疫方式：背部皮下多點(diǎn)注射采血方式：眶靜脈采血，3只/組表2 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 組別 數(shù)量(只) 蛋白 劑量(ug/只) 注射時(shí)間 取血時(shí)間 9 ozlf-67 50 0、2、3

10、W 2、3、6W 9 ozlf-69 50 0、2、3W 2、3、6W 9 ozlf-71 50 0、2、3W 2、3、6W 9 is蛋白 50 0、2、3W 2、3、6W 9 PBS 0、2、3W 2、3、6W 醫(yī)學(xué)碩士答辯歐琴答辯17研 究 方 案動(dòng)物：ICR小鼠表2 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 研 究 方 案ELISA檢測(cè)：以純化的融合蛋白作包被抗原以B95.8細(xì)胞作包被抗原選擇抗原性強(qiáng)的融合蛋白作包被抗原，檢測(cè)NPC組、CA疾病對(duì)照組和健康對(duì)照組的血清特異性抗體醫(yī)學(xué)碩士答辯歐琴答辯18研 究 方 案ELISA檢測(cè)：以純化的融合蛋白作包被抗結(jié) 果一、EBV LMP2的二級(jí)結(jié)構(gòu) 分析和B細(xì)胞表位預(yù)測(cè)醫(yī)學(xué)

11、碩士答辯歐琴答辯19結(jié) 果一、EBV LMP2的二級(jí)結(jié)構(gòu) 結(jié) 果H:-螺旋；e:-片層；c:無(wú)規(guī)卷曲；-:未預(yù)測(cè)結(jié)構(gòu)；t:-轉(zhuǎn)角 圖2 EBV LMP2二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)醫(yī)學(xué)碩士答辯歐琴答辯20結(jié) 果H:-螺旋；e:-片層；c:無(wú)規(guī)卷曲；-:未結(jié) 果aa 144150 202208 265268 318322 375390 445455 圖2 按SOSUI程序預(yù)測(cè)EBV LMP2蛋白跨膜區(qū)膜內(nèi)區(qū)域跨膜區(qū)膜外區(qū)域醫(yī)學(xué)碩士答辯歐琴答辯21結(jié) 果aa 144150 202208 結(jié) 果圖3 各種不同參數(shù)對(duì)EBV LMP2的預(yù)測(cè)結(jié)果a.親水性參數(shù) b.極性參數(shù) c.柔韌性參數(shù)d.表面可及性 e.抗原性醫(yī)學(xué)碩

12、士答辯歐琴答辯22結(jié) 果圖3 各種不同參數(shù)對(duì)EBV LMP2的預(yù)測(cè)結(jié)果 二級(jí)結(jié)構(gòu) 1082,89108,116126,142149,198206,288295,317321, 339348,379389,414422,481497 膜外區(qū)域 144150,202208,265268,318322,375390,445455 親水性 1526,3641,4360,6574,9096,101119,176179,199205, 236242,414416,483492 表面可及性 1318,2022,2532,3964,6782,9092,95112,114116,73 178 199201,20

13、3204,235240,378380,383384,416 420,484 496 抗原性 1083,88109,111121,174179,198207,235241,290293,340 348,380387,413421,471476,483491 極性 2023,4555,5759,6574,9094,102117,198203,234342,483491 柔韌性 1085,89121,199205,218222,236244,289296,342347,370 378,381383,385388,412420,483493預(yù)測(cè)方法 預(yù)測(cè)結(jié)果結(jié) 果表3 應(yīng)用不同方法預(yù)測(cè)EBV LMP2

14、 蛋白B細(xì)胞表位的肽段位置醫(yī)學(xué)碩士答辯歐琴答辯23 二級(jí)結(jié)構(gòu) 1082,89108,116結(jié) 果 145150 TASVST 0.005 199209 RIEDPPFNSLL 0.037 318322 TLNLT 0.036 381391 KSLSSTEFIPN 0.028 B細(xì)胞表位區(qū)域 氨基酸序列 抗原性指數(shù)表4 EBV LMP2的B細(xì)胞表位優(yōu)勢(shì)區(qū)域的平均抗原性指數(shù) 醫(yī)學(xué)碩士答辯歐琴答辯24結(jié) 果 145150 二、EBV LMP2 B細(xì)胞表位的克隆、 表達(dá)及其融合蛋白的純化結(jié) 果醫(yī)學(xué)碩士答辯歐琴答辯25二、EBV LMP2 B細(xì)胞表位的克隆、結(jié) 果醫(yī)學(xué)碩士結(jié) 果圖4 重組質(zhì)粒pET32a

15、/ozlf-67酶切鑒定1:DNA/Hind DNA Marker;2. pET32a/ozlf-67; 3:pET32a/ozlf-67/EcoR I;4:pET32a(+); 5:pET32a(+)/EcoR I圖5 重組質(zhì)粒pET32a/ozlf-69酶切鑒定1:DNA/Hind DNA Marker;2. pET32a/ozlf-69; 3:pET32a/ozlf-69/EcoR I;4:pET32a(+); 5:pET32a(+)/EcoR I圖6 重組質(zhì)粒pET32a/ozlf-71酶切鑒定1:DNA/Hind DNA Marker;2. pET32a/ozlf-71; 3:pET

16、32a/ozlf-71/EcoR I;4:pET32a(+); 5:pET32a(+)/EcoR I重組質(zhì)粒酶切鑒定醫(yī)學(xué)碩士答辯歐琴答辯26結(jié) 果重組質(zhì)粒酶切鑒定醫(yī)學(xué)碩士答辯歐琴答辯26結(jié) 果測(cè)序結(jié)果圖7 3個(gè)重組的目的基因的測(cè)序圖醫(yī)學(xué)碩士答辯歐琴答辯27結(jié) 果測(cè)序結(jié)果圖7 3個(gè)重組的目的基因的測(cè)序圖醫(yī)學(xué)碩結(jié) 果B細(xì)胞表位融合蛋白鑒定圖8 B細(xì)胞表位融合蛋白表達(dá)產(chǎn)物SDS和Western-Blot分析1:蛋白分子標(biāo)準(zhǔn)物；2:IPTG誘導(dǎo)重組質(zhì)粒pET32a/ozlf-67蛋白表達(dá)；3:IPTG誘導(dǎo)重組質(zhì)粒pET32a/ozlf-69蛋白表達(dá)；4:IPTG誘導(dǎo)重組質(zhì)粒pET32a/ozlf-71

17、蛋白表達(dá)；5:IPTG誘導(dǎo)重組質(zhì)粒pET32a蛋白表達(dá)；6: BL21醫(yī)學(xué)碩士答辯歐琴答辯28結(jié) 果B細(xì)胞表位融合蛋白鑒定圖8 B細(xì)胞表位融合蛋白結(jié) 果ozlf-67、ozlf-69、ozlf-71融合蛋白和His蛋白的純化圖9 純化的ozlf-67蛋白SDS電泳分析1：蛋白分子標(biāo)準(zhǔn)物；2：樣品穿透液；3：Buffer B液濾液；4：Buffer C液濾液；5-7：Buffer E液濾液圖10 純化的ozlf-69蛋白SDS電泳分析1：蛋白分子標(biāo)準(zhǔn)物；2：樣品穿透液；3：Buffer B液濾液；4：Buffer C液濾液；5-8：Buffer E液濾液醫(yī)學(xué)碩士答辯歐琴答辯29結(jié) 果ozlf-6

18、7、ozlf-69、ozlf-71融圖11 純化的ozlf-71蛋白SDS電泳分析1：蛋白分子標(biāo)準(zhǔn)物；2：樣品穿透液；3：Buffer B液濾液；4：Buffer C液濾液；5-6：Buffer E液濾液圖12 純化的His蛋白SDS電泳分析1：蛋白分子標(biāo)準(zhǔn)物；2：樣品穿透液；3：Buffer B液濾液；4：Buffer C液濾液；5：Buffer E液濾液結(jié) 果醫(yī)學(xué)碩士答辯歐琴答辯30圖11 純化的ozlf-71蛋白SDS電泳分析圖1結(jié) 果三、EBV LMP2 B細(xì)胞表位融合 蛋白免疫原性的初步研究醫(yī)學(xué)碩士答辯歐琴答辯31結(jié) 果三、EBV LMP2 B細(xì)胞表位融合醫(yī)學(xué)碩士答結(jié) 果圖13 不同

19、免疫原在不同時(shí)間的抗體均值（XSD）醫(yī)學(xué)碩士答辯歐琴答辯32結(jié) 果圖13 不同免疫原在不同時(shí)間的抗體均值（X 分別包被3種表位融合蛋白o(hù)zlf-67、ozlf-69和ozlf-71，分別檢測(cè)3種表位融合蛋白的免疫血清與His蛋白免疫血清的抗體效價(jià)差異。 結(jié) 果圖14 多肽表位誘導(dǎo)鼠免疫血清的抗體效價(jià)的ELISA檢測(cè)結(jié)果* ：與His蛋白免疫組比較*醫(yī)學(xué)碩士答辯歐琴答辯33 分別包被3種表位融合蛋白o(hù)zlf-67、oz結(jié) 果 B95.8細(xì)胞作為包被抗原，ELISA檢測(cè)3種表位融合蛋白免疫小鼠制備的鼠血清抗體效價(jià)。 圖15 B95.8細(xì)胞包被ELISA檢測(cè)鼠免疫血清抗體效價(jià)* ：與His蛋白免疫組

20、比較*醫(yī)學(xué)碩士答辯歐琴答辯34結(jié) 果 B95.8細(xì)胞作為包被抗結(jié) 果 選用Ozlf-67融合蛋白為診斷抗原，ELISA檢測(cè)NPC組、CA疾病對(duì)照組及健康對(duì)照組血清特異性IgG抗體。 圖16 ozlf-67蛋白包被ELISA檢測(cè)病人血清抗體效價(jià)* ：與正常組比較*醫(yī)學(xué)碩士答辯歐琴答辯35結(jié) 果 選用Ozlf-67融合蛋白為診斷結(jié) 果分組 份數(shù) A值 陽(yáng)性 陰性 陽(yáng)性率 NPC組 48 0.866 0.231 34 13 70.8 CA組 68 0.140 0.106 4 64 5.9 正常組 68 0.184 0.067 0 68 0表5 ozlf-67蛋白包被ELISA檢測(cè)病人血清抗體陽(yáng)性率

21、*與正常組比較*醫(yī)學(xué)碩士答辯歐琴答辯36結(jié) 果分組 份數(shù) A值 分 析 與 討 論 預(yù)測(cè)的B 細(xì)胞表位是線性B 細(xì)胞表位，主要的參數(shù)有二級(jí)結(jié)構(gòu)、跨膜區(qū)、親水性、表面可及性、抗原性以及柔韌性等，抗原性和親水性是形成表位的首要條件，因而優(yōu)勢(shì)表位的形成是多種因素綜合作用的結(jié)果。醫(yī)學(xué)碩士答辯歐琴答辯37分 析 與 討 論 預(yù)測(cè)的B 細(xì)胞表位分 析 與 討 論 采用分子生物學(xué)方法分別得到了包含預(yù)測(cè)表位片段的重組質(zhì)粒，并得到了融合蛋白，為進(jìn)一步表位融合蛋白的免疫學(xué)檢測(cè)奠定基礎(chǔ)。 醫(yī)學(xué)碩士答辯歐琴答辯38分 析 與 討 論 采用分子生物學(xué)方法分分 析 與 討 論3種表位融合蛋白均具有良好的免疫原性B細(xì)胞表位多肽均能誘導(dǎo)產(chǎn)生特異性抗體以B95.8細(xì)胞作為抗原包被酶標(biāo)板， B細(xì)胞表位 融合蛋白誘導(dǎo)的小鼠免疫血清與EBV抗原特異性結(jié)合，但抗體效價(jià)較低，可能是由于單個(gè)表位 肽的結(jié)合能力較弱。醫(yī)學(xué)碩士答辯歐琴答辯39分 析 與 討 論3種表位融合蛋白均具有良好的免疫原分 析 與 討 論 選用Ozlf67融合蛋白為診斷抗原，ELISA檢測(cè)NPC患者血清特異性抗體，用于NPC的血清學(xué)診斷試劑的研制具有臨床應(yīng)用價(jià)值。醫(yī)學(xué)碩士答辯歐