應(yīng)用變性高效液相色譜技術(shù)檢測(cè)肥大細(xì)胞病ckit基因突變

1、應(yīng)用變性高效液相色譜技能檢測(cè)胖大細(xì)胞病c-kit基因突變【摘要】本研究檢測(cè)7例胖大細(xì)胞病患者-kit基因激酶編碼區(qū)突變環(huán)境，以探究該基因變異在胖大細(xì)胞病診斷及治療中的意義。應(yīng)用PR測(cè)定、變性高效液相色譜技能及DNA測(cè)序要領(lǐng)對(duì)患者舉行-kit基因外顯子17外顯子19突變檢測(cè)。結(jié)果表白：1例患者外顯子17擴(kuò)增產(chǎn)物在DHPL中出現(xiàn)非常色譜峰，測(cè)序結(jié)果表如今外顯子17出現(xiàn)AT突變，即D816V；另2例患者外顯子18/19經(jīng)DHPL檢測(cè)，結(jié)果表現(xiàn)1個(gè)分外的色譜峰，測(cè)序結(jié)果證著實(shí)外顯子18出現(xiàn)G改變，為同義突變L862L。結(jié)論：變性高效液相色譜技能是一種高效、可靠的突變檢測(cè)要領(lǐng)，-kit基因突變檢測(cè)對(duì)胖大

2、細(xì)胞病臨床治療有引導(dǎo)意義?！娟P(guān)鍵詞】變性高效液相色譜；-kit基因突變；D816V；L862L；胖大細(xì)胞病AppliatinfDenaturingHighPerfraneLiquidhratgraphytutatinDetetinfthe-kitGeneinastytsisKeyrdsdenaturinghighperfraneliquidhratgraphy;-kitgeneutatin;D816V;L862L;astytsis胖大細(xì)胞病是指體內(nèi)胖大細(xì)胞非常增生的一種疾病，包羅皮膚型胖大細(xì)胞并體系性胖大細(xì)胞并胖大細(xì)胞肉瘤及胖大細(xì)胞白血病等數(shù)種范例。體系性胖大細(xì)胞病systeiastelldi

3、sease,SD)以滿身多器官構(gòu)造中胖大細(xì)胞浸潤(rùn)及增生為特性，少數(shù)患者可在慢性SD的底子上產(chǎn)生胖大細(xì)胞白血玻原癌基因-kit的編碼產(chǎn)物-kit卵白是干細(xì)胞/胖大細(xì)胞生長(zhǎng)因子的受體ste/astellgrthfatrreeptr)，在胖大細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育中有緊張作用。-kitD816V突變，即產(chǎn)生在外顯子17的腺嘌呤胸腺嘧啶點(diǎn)突變，導(dǎo)致肽鏈816位點(diǎn)的天冬氨酸D被纈氨酸V取代，是成人散發(fā)性胖大細(xì)胞病的特性和重要病因，產(chǎn)生于約莫60%的患者1。以往對(duì)該病無(wú)殊效治療要領(lǐng)，比年來(lái)部門胖大細(xì)胞病患者經(jīng)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)按捺劑伊馬替尼治療后得到了精良結(jié)果，但有D816V突變的患者那么對(duì)伊馬替尼耐藥2。故檢測(cè)胖大細(xì)胞病

4、的-kit基因突變對(duì)付選擇治療方案、斷定預(yù)后有緊張意義。我們用變性高效液相色譜技能(denaturinghighperfraneliquidhratgraphy，DHPL)對(duì)7例體系性胖大細(xì)胞病患者的-kit基因外顯子17-19全上舉行突變掃描，以確定D816V的產(chǎn)生率，猜測(cè)患者對(duì)伊馬替尼的療效，并在這3個(gè)編碼激酶區(qū)的外顯子中檢測(cè)是否有其他的突變。質(zhì)料和要領(lǐng)病例7例體系性胖大細(xì)胞病患者系英國(guó)Haersith病院及Barthle病院患者。男4例，女3例，中位年事48歲29-74歲。DNA提取標(biāo)本取自患者骨髓2l或外周血5l，通例酚/氯仿法提取基因組DNA，于-20保存?zhèn)溆?。突變檢測(cè)應(yīng)用DHPL技

5、能舉行突變檢測(cè)。DHPL技能是比年來(lái)用于挑選DNA布局變異的一項(xiàng)新技能，其原理是：在DNA部門變性環(huán)境下，當(dāng)活動(dòng)相緩沖液B中的乙腈梯度增長(zhǎng)時(shí)，有錯(cuò)配的異源雙鏈會(huì)早于同源雙鏈從AVE體系的結(jié)實(shí)相中被洗脫出來(lái)而被紫外檢測(cè)體系檢測(cè)到非常的色譜峰。但假設(shè)突變是純合子或半合子，那么無(wú)法形成異源雙鏈。以是我們將全部待測(cè)樣本別離與野生型的正凡人胎盤DNASiga公司產(chǎn)物等量混淆后變性及遲鈍復(fù)性，假設(shè)待測(cè)DNA中有突變存在，將在復(fù)性時(shí)形成自身同源雙鏈的同時(shí)與正常DNA形成異源雜合雙鏈，進(jìn)而表現(xiàn)出非常的色譜峰。引物方案與合成各引物序列均選在內(nèi)含子部位且距剪接點(diǎn)40-60bp以包管擴(kuò)增全長(zhǎng)待測(cè)外顯子及剪接地區(qū)，因

6、內(nèi)含子18較短，故外顯子18、內(nèi)含子18及外顯子19利用1對(duì)引物同時(shí)擴(kuò)增。引物由美國(guó)Siga公司合成。引物序列如下：外顯子17：上游5-GTGAAATATTAAGGGT-3；卑劣5-GTGTGATAT-TAGAAGG-3。外顯子18/19：上游5-GAAAGAGATTATAAG-3；卑劣5-ATAAATTGGGTTT-3?；蚪MDNA擴(kuò)增反響體系為75l，構(gòu)成為：上游及卑劣引物(100pl/l)各0.375l，dNTP(20l/L)0.75l，10緩沖液7.5l，ApliTaqGldDNA聚合酶(5U/l)0.375l，DNA100ng,gl2(25l/L)4.5l。PR條件為：95預(yù)變性5分

7、鐘；94變性1分鐘，外顯子1758退火1分鐘、外顯子18/1962退火1分鐘，72延伸1分鐘，擴(kuò)增33個(gè)循環(huán)；末了72延伸10分鐘。擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度外顯子17為412bp，外顯子18/19為495bp。取擴(kuò)增產(chǎn)物5l1.5%瓊脂糖凝膠100V電泳30分鐘，溴化乙錠染色，紫外闡發(fā)成像體系不雅察電泳結(jié)果并打櫻DHPL檢測(cè)將上述擴(kuò)增后的患者DNA20l別離與人胎盤正常比較DNA20l混淆，95變性5分鐘，然后遲鈍復(fù)性每分鐘低落1.5至室溫。之后將各待測(cè)樣本置于AVE色譜儀Transgen-i公司產(chǎn)物，美國(guó)的96孔板上，輸入DNA序列；按照軟件NavigatrTransgeni的提示選擇最正確運(yùn)行溫度：外

8、顯子17為56及57，外顯子18/19為58及60，在該運(yùn)行溫度下DNA片斷的1%-50%將解旋形成單鏈DNA即DNA部門變性?；顒?dòng)相的構(gòu)成為緩沖液A：100l/LTEAA(三乙銨乙酸酯，triethylaniuaetate)，pH7.0，0.1l/LEDTA(色譜純)；緩沖液B：100l/LTEAA及25%乙腈(aetnitrile)，pH7.0，均為美國(guó)Transgeni公司產(chǎn)物。最正確緩沖液梯度亦由軟件Navigatr設(shè)定：外顯子17緩沖液B起始含量為57.3%，外顯子18/19緩沖液B起始含量為58.5%；每分鐘緩沖液B含量進(jìn)步2%以形成緩沖液梯度，梯度形成時(shí)間為4分鐘。設(shè)定每份標(biāo)本進(jìn)

9、樣量為8l，以流速為0.9l/in運(yùn)行樣本，分散柱保存時(shí)間為6.3分鐘。另取人胎盤DNA40l做為陰性比較。紫外線檢測(cè)波長(zhǎng)為260n，運(yùn)行結(jié)果在色譜儀上表現(xiàn)并打櫻對(duì)表現(xiàn)非常色譜峰的樣本將舉行DNA序列測(cè)定。測(cè)序結(jié)果討論-kit基因位于染色體412，全長(zhǎng)約102.42kb，共包羅21個(gè)外顯子；其RNA全長(zhǎng)4813bp，編碼由976個(gè)氨基酸構(gòu)成的145kD的卵白質(zhì)-kitD117。-kit是一種受體酪氨酸激酶(reeptrtyrsinekinase,RTK)，屬于第型RTK成員之一，在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)體系中具有緊張作用，與細(xì)胞增殖分化嚴(yán)密相干。-kit的RNA可在造血干/祖細(xì)胞、胖大細(xì)胞、生殖細(xì)胞、玄色素

10、細(xì)胞及胃腸道起搏細(xì)胞中表達(dá)，激酶的活性對(duì)這些細(xì)胞的生長(zhǎng)是必不成少的3。-kit與其配體干細(xì)胞因子結(jié)合后產(chǎn)生二聚體化及自身磷酸化，進(jìn)而激活激酶及卑劣信號(hào)分子，通過(guò)多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路調(diào)治核內(nèi)基因的運(yùn)動(dòng)。-kit基因的突變將導(dǎo)致-kit受體連續(xù)激活，進(jìn)而使信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路連續(xù)激活，細(xì)胞處于連續(xù)增殖狀態(tài)，是胖大細(xì)胞病產(chǎn)生的分子生物學(xué)基矗的產(chǎn)生于胖大細(xì)胞病的-kit激酶區(qū)的突變位于外顯子17，重要為D816V改變，尚有D816Y天冬氨酸酪氨酸、D816F天冬氨酸苯丙氨酸、D816H天冬氨酸組氨酸及D820G天冬氨酸甘氨酸突變4。D816V突變可導(dǎo)致-kit酪氨酸激酶活性增長(zhǎng)10倍、激酶與ATP的結(jié)合本領(lǐng)增長(zhǎng)9

11、倍。少數(shù)患者有-kit編碼細(xì)胞內(nèi)近膜區(qū)序列的突變4。信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)按捺劑(signaltransdutininhibitr)伊馬替尼格列衛(wèi)，Gleeve,STI571對(duì)慢性粒細(xì)胞白血病的治療獲得了令人煽動(dòng)的精良結(jié)果，創(chuàng)始了分子靶向治療腫瘤的新紀(jì)元5。伊馬替尼是由瑞士諾華公司開拓的一種酪氨酸激酶按捺劑，不但高效按捺全部的ABL激酶，還以相似的特異性及活性按捺-kit及PDGFR。-kit激活的胖大細(xì)胞并胃腸道基質(zhì)瘤gastrintestinalstraltuur等用該藥治療后均獲得了精良結(jié)果6，7。但胖大細(xì)胞病D816V突變者那么對(duì)伊馬替尼耐藥，而野生型及-kit細(xì)胞內(nèi)近膜區(qū)突變者對(duì)伊馬替尼敏感。D8

12、16V突變者對(duì)伊馬替尼耐藥的機(jī)制大概由于突變型-kit對(duì)ATP的過(guò)高的親和力或由于D816V改變了-kit激酶激活環(huán)的空間構(gòu)象，致使突變型-kit無(wú)法與伊馬替尼結(jié)合，因此伊馬替尼無(wú)法發(fā)揮作用。DHPL技能是一種高通量、主動(dòng)化篩查DNA突變的技能，如今正以其高效、高特異性、敏感性及相對(duì)價(jià)廉的長(zhǎng)處得到了日益普及的應(yīng)用8-10。在我們的研究中，DHPL色譜圖有改變的樣本經(jīng)測(cè)序均表現(xiàn)DNA有變異；在我們的前期事情中曾用該要領(lǐng)檢測(cè)了大量樣本，特異性及敏感性均靠近100%，提示該要領(lǐng)是一種高效、可靠的突變檢測(cè)要領(lǐng)。該要領(lǐng)的不敷之處是無(wú)法得出詳細(xì)的突變位點(diǎn)及突變范例，還需DNA測(cè)序要領(lǐng)證明。本組患者突變檢測(cè)結(jié)果表現(xiàn)，1例患者為D816V陽(yáng)性，估計(jì)對(duì)伊馬替尼耐藥，故未用該藥予以治療；在別的6例中的5例患者用伊馬替尼治療后病情均獲得了差異程度的緩解，另1例患者因病癥較輕尚未用