《α-淀粉酶的固定化及淀粉水解作用的檢測》教案

1、PAGE8實(shí)驗(yàn)5-淀粉酶的固定化及淀粉水解作用的檢測【學(xué)習(xí)目標(biāo)】1認(rèn)識(shí)固定化酶的概念，了解固定化酶的方法，學(xué)習(xí)制備固定化-淀粉酶。2了解淀粉酶水解淀粉的過程，能夠進(jìn)行淀粉水解的測定?！窘虒W(xué)重點(diǎn)】制備固定化-淀粉酶；進(jìn)行淀粉水解的測定?！窘虒W(xué)難點(diǎn)】制備固定化-淀粉酶【基礎(chǔ)知識(shí)】一、酶和固定化酶1酶：酶是生物體內(nèi)催化各種反應(yīng)的催化劑。酶作為催化劑與一般的催化劑有共同特點(diǎn)：用量少而催化效率高；不改變化學(xué)反應(yīng)的平衡點(diǎn)，酶本身在反應(yīng)前后也不發(fā)生變化；可降低反應(yīng)的活化能。酶作為生物催化劑的特性有：催化效率高；有高度的專一性；易失活等。通常情況下酶都是在水溶液中催化底物反應(yīng)，因此酶在反應(yīng)系統(tǒng)中是與底物、產(chǎn)物

2、混在一起的，反應(yīng)結(jié)束后，即使仍有較高活力，也很難再回收利用。另外，在水溶液中起作用的酶也給產(chǎn)物進(jìn)一步分離純化帶來了一定困難。2固定化酶：固定化酶又稱固相酶、水不溶性酶，它是將水溶性的酶用物理或化學(xué)的方法固定在某種介質(zhì)上，使之成為不溶于水而又有酶活性的制劑。固定化酶與游離酶相比不但穩(wěn)定性好，而且與底物和產(chǎn)物容易分離，且易于控制，能反復(fù)多次使用，便于運(yùn)輸和貯存，有利于自動(dòng)化生產(chǎn)。因此，固定化酶在工業(yè)、醫(yī)學(xué)和生化分析等方面的應(yīng)用發(fā)展較快。直接使用酶和固定化酶催化的優(yōu)缺點(diǎn)比較類型優(yōu)點(diǎn)不足直接使用酶催化效率高，低耗能、低污染等。對環(huán)境條件非常敏感，容易失活；溶液中的酶很難回收，不能被再次利用，提高了生產(chǎn)

3、成本；反應(yīng)后酶會(huì)混在產(chǎn)物中，可能影響產(chǎn)品質(zhì)量。使用固定化酶酶既能與反應(yīng)物接觸，又能與產(chǎn)物分離，同時(shí)，固定在載體上的酶還可以被反復(fù)利用。一種酶只能催化一種化學(xué)反應(yīng)，而在生產(chǎn)實(shí)踐中，很多產(chǎn)物的形成都通過一系列的酶促反應(yīng)才能得到的。二、固定化酶的制作原理酶固定化的方法由酶的性質(zhì)和載體特性所決定，主要包括：吸附法、共價(jià)偶聯(lián)法、交聯(lián)法和包埋法等。1吸附法：有物理吸附法和離子交換法兩種。物理吸附法是將酶蛋白的分子吸附在惰性載體上，但要選擇不引起變性且能保持一定酶活力的載體，對蛋白質(zhì)有高度吸附能力的有機(jī)硅膠、活性碳和石英砂等。離子交換法是利用蛋白質(zhì)的兩性性質(zhì)，使其帶有電荷的基團(tuán)與離子交換劑形成離子鍵，而被交

4、換結(jié)合至交換劑上。2共價(jià)偶聯(lián)法（載體偶聯(lián)法）：酶蛋白的一些基團(tuán)，包括羧基末端、氨基末端等，在溫和的條件下能與載體共價(jià)結(jié)合，從而被固定。但結(jié)合的部位必須不是酶的活性中心，也不是維持其空間結(jié)構(gòu)的必需基團(tuán)。這種結(jié)合穩(wěn)定性好，酶不易脫落，可使用較長時(shí)間。3交聯(lián)法：是指通過雙功能試劑，將酶和酶聯(lián)結(jié)成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的方法，交聯(lián)法使用的交聯(lián)劑是戊二醛等水溶性化合物。4包埋法：是指將酶包裹在多孔的載體中，如將酶包裹在聚丙烯酰胺凝膠等高分子凝膠中，或包裹在硝酸纖維素等半透性高分子膜中。前者包埋成格子型，后者包埋成微膠囊型。【實(shí)驗(yàn)操作】實(shí)驗(yàn)原理：本實(shí)驗(yàn)是用吸附法將a-淀粉酶固定在石英砂上，一定濃度的淀粉溶液經(jīng)過固定化酶

5、柱后，可使淀粉水解成糊精，用淀粉指示劑溶液測試，流出物呈紅色表明水解產(chǎn)物糊精生成。設(shè)備及用品：5ml塑料注射器、50ml燒杯、滴管、自行車用氣門心及夾子、注射器架、試管及微量離心管3支。材料：-淀粉酶的固定化:在燒杯中將5mg-淀粉酶溶于4ml蒸餾水中由于酶不純,可能有些不溶物。再加入5g石英砂,不時(shí)攪拌,30min后裝入1支下端接有氣門心并用夾子封住的注射器中石英砂體積約4ml。用10倍體積的蒸餾水洗滌此注射器以除去未吸附的游離淀粉酶,流速為1ml/min。可溶性淀粉溶液:取50ml可溶性淀粉溶于100ml熱水中,攪拌均勻。5mmol/LKI-I2溶液：稱取碘和碘化鉀。加蒸餾水100ml完全

6、溶解后裝入滴瓶中。步驟：將灌注了固定化酶的注射器放在注射器架上,用滴管滴加淀粉溶液,使淀粉溶液以min的流速過柱。在流出5ml后接收流出液,加入12滴KI-I2溶液,觀察顏色用水稀釋1倍后再觀察顏色。實(shí)驗(yàn)后,用10倍柱體積的蒸餾水洗滌此柱,放置在4冰箱中,幾天后再重復(fù)上述實(shí)驗(yàn),看是否有相同的結(jié)果。實(shí)驗(yàn)反思：如何證明洗滌固定化酶柱的流出液中沒有淀粉酶可在試管中加入1ml可溶性淀粉，再加幾滴淀粉酶柱流出液，保溫幾分鐘后用碘液檢驗(yàn)。如仍顯藍(lán)色，則流出液中沒有淀粉酶了?！竞诵慕庾x】1酶與固定化酶一樣嗎相對酶而言，固定化酶有什么優(yōu)點(diǎn)呢不完全相同，固定化酶是酶的衍生物。酶是活細(xì)胞產(chǎn)生的具有催化作用的一類有

7、機(jī)物，它是生物體內(nèi)各種化學(xué)反應(yīng)的催化劑，而固定化酶是將水溶性的酶用物理或化學(xué)方法固定在某種介質(zhì)上，使之成為不溶于水而又有酶活性的制劑。固定化酶的優(yōu)點(diǎn)：使酶固定化后有一定的機(jī)械強(qiáng)度，催化反應(yīng)的過程可管道化、連續(xù)化和自動(dòng)化。酶不溶解在催化反應(yīng)的溶液中，產(chǎn)物更易純化。固定化酶可反復(fù)使用，更經(jīng)濟(jì)，更利于工廠化生產(chǎn)。固定化酶提高了酶的穩(wěn)定性，可較長時(shí)間地貯存和使用。固相酶是在20世紀(jì)60年代發(fā)展起來的一項(xiàng)技術(shù)，很快就得到了廣泛的應(yīng)用。2如何證明洗滌固定化淀粉酶柱的流出液中沒有淀粉酶可在試管中加入1mL可溶性淀粉溶液，再加入幾滴淀粉酶柱的流出液，混合后用手握住試管增加溫度，幾分鐘后加12滴KII2指示劑，

8、如仍顯藍(lán)色，即流出液中沒有淀粉酶了。用固定在石英砂上的淀粉酶柱再作用于淀粉溶液，使其自柱中流出，作用的結(jié)果才能表明是淀粉酶的固相酶作用的結(jié)果。3固定化酶有哪些用途呢1固相酶在工業(yè)上的應(yīng)用氨基酸?；腹滔嗝缚墒笵型和L型氨基酸拆分，用于生產(chǎn)L型氨基酸。柚苷酶固相酶用于果汁脫苦。蛋白酶固相酶用于制造蛋白水解液。木瓜蛋白酶固相酶用于啤酒澄清。葡萄糖異構(gòu)酶固相酶用于制造果糖，果糖是最甜的糖，制備的糖溶液可大大提高糖液的甜度。2固相酶在化學(xué)分析和臨床診斷上的應(yīng)用用尿酶固相酶可測定血液或尿中的尿素含量。3固相酶在醫(yī)藥上的應(yīng)用苯丙酮尿癥患者是由于體內(nèi)缺少苯丙氨酸羥化酶，不能使苯丙氨酸轉(zhuǎn)變成氨基酸，使苯丙氨酸

9、變成苯丙酮酸和苯乳酸而隨尿排出。這種病人智力發(fā)育遲緩，又稱精神幼稚病。如將苯丙氨酸羥化酶及其輔酶制成不溶酶，注射到患者體內(nèi)，可有效治療苯丙酮尿病。亞洲有15%的人體內(nèi)缺少乳糖酶，不能水解牛乳中的乳糖，乳糖進(jìn)入腸道后異常發(fā)酵，引起腹瀉腹痛。這種現(xiàn)象大約在飲用后十幾小時(shí)發(fā)生。有的人進(jìn)入老年后缺少乳糖酶，也會(huì)發(fā)生上述現(xiàn)象。因此，可以用乳糖酶固相酶在體外或體內(nèi)水解乳糖。4耐高溫的淀粉酶有哪些可能的用途在實(shí)際生產(chǎn)中，總希望反應(yīng)的時(shí)間愈短愈好，這就要提高反應(yīng)溫度。通常生產(chǎn)上淀粉酶是一次性使用的，加溫雖在短時(shí)間內(nèi)會(huì)使酶變性失活，但沒有關(guān)系，只要使淀粉在短時(shí)間內(nèi)水解即可。尋找耐高溫的淀粉酶的目的是在高溫下使淀粉水解快，而且酶不會(huì)因高溫而在短時(shí)間內(nèi)變性。在發(fā)酵生產(chǎn)中使用的往往是植物淀粉，如青霉素發(fā)酵、丙酮丁醇發(fā)酵、乙醇發(fā)酵生產(chǎn)啤酒等都要水解淀粉。所以耐高溫淀粉酶用途廣泛。液體后再接收流出液用于鑒定因?yàn)楣潭ɑ钢械拿概c流經(jīng)柱子的淀粉反應(yīng)需要一定的時(shí)間，剛開始流出的液體中由于反應(yīng)時(shí)間過短，糊精未生成或生成的量太少，所以不利于后面的顏色鑒定。6本實(shí)驗(yàn)中為什么選用石英砂來固定化酶固定化酶有許多方法，本實(shí)驗(yàn)