混合色素的分離測(cè)定

1、混合色素的分離測(cè)定混合色素的分離測(cè)定不同種類(lèi)的園藝產(chǎn)品因含有不同質(zhì)和量的色素物質(zhì)而表現(xiàn)出各種各樣鮮美的色澤。色素 大多沒(méi)有直接的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，但可刺激人們的食欲，有利于食物的消化吸收；同時(shí)，花色是切 花最重要的觀賞指標(biāo)之一。色澤在一定程度上反映了園藝產(chǎn)品的新鮮程度、成熟度和品質(zhì)變 化等，是品質(zhì)評(píng)價(jià)的重要指標(biāo)。果蔬的色素主要有葉綠素、類(lèi)胡蘿卜素和花青素。其中葉綠素與類(lèi)胡蘿卜素為非水溶性 色素，花青素為水溶性色素。葉綠素使果蔬呈現(xiàn)綠色，其性能穩(wěn)定，在貯藏過(guò)程中葉綠素受 葉綠素水解酶、酸和氧的作用而分解消失。類(lèi)胡蘿卜素主要有胡蘿卜素、番茄紅素、番茄黃 素、辣椒黃素、辣椒紅素、葉黃素等。當(dāng)果蔬進(jìn)入成熟階段

2、時(shí)，這類(lèi)色素的含量增加，使其 顯示出特有的色彩。花青素在果蔬中多以花青苷的形式存在，常表現(xiàn)為紫、藍(lán)、紅等色?；?青素在日光下形成，生長(zhǎng)在背陰處的蔬菜，花青素含量會(huì)受影響。天然食品及食品原料多數(shù)本身具有特有的色澤和香味，人們?cè)陂L(zhǎng)期的生活習(xí)慣中也認(rèn)識(shí) 了各種食品應(yīng)有的色澤，食品的色澤已經(jīng)成為食品的一個(gè)重要感官指標(biāo)。然而，食品在保存 及加工過(guò)程中，其色澤往往會(huì)有不同程度的變化，為了改善食品的色澤，使食品盡可能恢復(fù) 原來(lái)的顏色，除采取一定護(hù)色措施外，往往還得添加一定量的食用色素，進(jìn)行著色。食用色素就來(lái)源可分成兩大類(lèi)：天然色素和合成色素對(duì)合成色素在測(cè)定時(shí)采用的幾大步驟如下：樣品前處理f提純f分離f鑒別（

3、何種色素）f定量（此色素含量是否超標(biāo)）一、前處理方法有：前處理不外乎是將樣品打漿或者將著色部分用刀刮下，定容、吸附、解 吸等方法處理；二、提純的方法（1）羊毛染色法：此法應(yīng)用較廣泛，主要是簡(jiǎn)單，材料容易弄到，操作也方便。缺點(diǎn)為： 要在熱的酸性條件下吸附色素，用氨溶液解吸色素時(shí)，往往色素起變化。當(dāng)溶液中含量低時(shí)（色素含量低），用羊毛染色法吸附色素不完全，回收率低；（2）聚酰胺粉法：此法是分離兩種以上的色素，是目前比較理想的方法，因?yàn)槭称分写蠖?數(shù)使用拼色。聚酰胺粉在酸性溶液中能與人工合成色素牢固地結(jié)合，并能在很稀的溶液中吸 附色素，但對(duì)天然色素的吸附不緊密，能被甲醇-甲酸洗脫下來(lái)；（3）離子交換

4、法（4）分子篩分離法三、目前分離方法（1）濾紙層析法；（2）薄層層析法；（3）柱層析法；（4）電泳法四、色素鑒定方法（1）采用紙層析法進(jìn)行定性（與標(biāo)準(zhǔn)樣進(jìn)行對(duì)照Rf）；（2）采用薄層層析、比色的方法進(jìn)行定量。目前，在食品行業(yè)中使用單一色素已經(jīng)比較少，大多數(shù)使用復(fù)合色素方可達(dá)到比較滿意色澤， 因而給分析工作者帶來(lái)一定困難。目前合成色素的測(cè)定方法主要有：（1）薄層層析法；（2）高 效液相色譜法。一、薄層層析法（聚酰胺粉法）1、原理聚酰胺是具有二極性的化合物，在酸性條件下與水溶性酸性染料結(jié)合，而與天然色素、蛋白 質(zhì)、脂肪、淀粉等物質(zhì)分離，然后再在堿性條件下解吸色素，再在薄層層析法進(jìn)行分離鑒別， 與標(biāo)

5、準(zhǔn)比較定性、定量（紙層析進(jìn)行定性，薄層層析進(jìn)行定量）。2、操作步驟食品其形態(tài)是千變?nèi)f化的，添加在食品中的色素方式亦是各種各樣的，有的拼色加入，有的 加在食品的表層幾個(gè)色素點(diǎn)，有的覆蓋一層色素，有的用色素和雞蛋，很形象地作成傳說(shuō)中 的故事、動(dòng)物、花卉以及象征豐收、延年益壽、節(jié)日愉快、生日快樂(lè)等附在食品的最顯眼的 地方，屬于這類(lèi)食品的有中式糕點(diǎn)、西式糕點(diǎn)，還有飲料、小食品等色素的測(cè)定。樣品不同， 處理方法則就不一樣。樣品表面色素的測(cè)定如中式、西式、生日蛋糕、節(jié)日壽糕一類(lèi)，首先將代表性的樣品整體稱(chēng)重，記錄重量，然后 分別取下相同著色部分，進(jìn)行提取和分離，不要將部分著色樣品和整個(gè)或大部分不著色樣品 混

6、在一起。如果這樣，分離就困難，而且增加分離誤差，使結(jié)果偏差大，例如一塊蛋糕重500g， 取下色素部分經(jīng)測(cè)定是50mg，表示500g重的含量即萬(wàn)分之一。樣品外皮色素的測(cè)定如兒童食品中的糖豆、朱古力豆、紅心果等樣品，只需將外表皮色素用少量的水溶下來(lái)（在 用水溶解之前，先稱(chēng)重量并記錄），并定容一定體積（將沒(méi)有色素的樣品棄去），供檢驗(yàn)用， 其計(jì)算與上面一樣。 非酒精性飲料中色素的測(cè)定（各種汽水、桔子汁等）（1）吸附吸50ml樣一與燒杯中一在電爐上加熱至沸一不斷攪拌除CO廣加1g聚酰胺粉（60C活化1小 時(shí)）一充分?jǐn)嚢枰皇股赝耆痪埘０贩畚揭挥貌际下┒愤^(guò)濾一用80C熱水20ml洗沉淀 物一用甲醇-甲

7、酸（6 : 4） 20ml再洗沉淀物（除天然色素）一直到濾下來(lái)溶液無(wú)色一再用80C 熱水150ml分次洗沉淀物。（2）解吸在不抽濾條件下，將9 : 1乙醇氨液加在沉淀物中使吸附在聚酰胺粉上的色素全部解脫下來(lái)， 收集于蒸發(fā)器中，水浴中濃液到5ml左右，加3滴20%檸檬酸溶液（使色素穩(wěn)定），定容10ml， 供薄層點(diǎn)樣用。（3）注意事項(xiàng)樣品在加入聚酰胺粉之前，要用20%的檸檬酸調(diào)節(jié)pH=4 （聚酰胺粉末在弱酸性溶液中對(duì)色素 吸附力強(qiáng)，吸附亦完全）。如果樣品不含天然色素，除CO后直接加聚酰胺吸附。2對(duì)各種糖果色素的測(cè)定1）樣品處理硬糖（不含蛋白質(zhì)、淀粉）粉碎稱(chēng)樣3gf加50ml水溶解一再加30%檸檬酸

8、3滴調(diào)pH=4軟糖（含淀粉高果飴）除外層冰糖屑一切碎一加50ml熱水溶解一用20%檸檬酸調(diào)pH=4 一加淀粉酶1ml （消化淀粉）一90C水浴15分鐘一溶液中出現(xiàn)沉淀物直到變清奶糖一加9 : 1乙醇氨溶液溶解一用1 ： 10H2SO4調(diào)pH-加1%鎢酸鈉使蛋白質(zhì)沉淀，奶脂凝集沉淀一布氏漏斗抽濾2 42）吸附色素1g聚酰胺粉+糖液一70C水浴一攪拌使之充分吸附一用布氏漏斗抽濾一用80C水洗漏斗上的 沉淀物一再用丙酮洗（除油脂，硬糖不必）一再用80C水洗沉淀物一洗到pH與原水相同3）解吸色素沉淀物用乙醇氨解吸液全部解吸一收集于蒸發(fā)皿中一水浴濃液到4ml一加20%檸檬酸3滴一用 水定容10ml 一留

9、做點(diǎn)樣用（單一色素直接比色，拼色要分離，先定性后定量）肉和肉制品中色素的測(cè)定1）前處理稱(chēng)處理樣一加海砂3g和20ml丙酮一于研缽中一起研一除去脂肪和水分一除去丙酮2）解吸樣液中的色素將上面沉淀物放入布氏漏斗一用解吸液從肉蛋白中使色素全部解吸下來(lái)一加熱到70C一用1:10H2SO4調(diào)PH再加1ml10%鎢酸鈉一使蛋白質(zhì)全部凝聚沉淀一用布氏漏斗抽濾一用70C水 20ml洗漏斗一收集全部濾液3）吸附樣液中的色素稱(chēng)1g聚酰胺粉+上面的濾液一攪拌一抽濾一用水洗漏斗中沉淀物一直到濾水與原水PH相同4）解吸樣液中色素（與非酒精性飲料相同）果脯類(lèi)色素的測(cè)定1）處理取樣研碎后稱(chēng)2g加50ml水一加熱70C使溶解

10、2）吸附吸附劑1g+上述液一抽濾一用70C熱水洗沉淀物3）除天然色素用甲醇-甲酸（6 : 4）混合液解吸天然色素一直到濾液無(wú)色為止一再加甲醇10ml進(jìn)一步除天 然色素一 70C熱水洗，不斷攪拌4）解吸用解吸液解吸樣品沉淀物中全部人工合成色素一濃液解吸液（甲醇、氨）直到無(wú)甲醇、氨時(shí) 一用1：10H2SO4調(diào)pH=4一再按上述加吸附劑操作重復(fù)1-2次，把天然色素全部去凈為止，最 后解吸、定容同上。各種加工蔬菜中色素的測(cè)定這一類(lèi)色素測(cè)定按理論應(yīng)該以蜜餞的操作來(lái)處理，但在實(shí)驗(yàn)中這些樣品膠體過(guò)多，使解吸、 過(guò)濾等操作非常困難，所以我們應(yīng)該按下述方法進(jìn)行：取樣20g（十菜2g），加入100ml 80% 的

11、乙醇溶液，浸泡2小時(shí)，再以含有1%氨水的70%乙醇反復(fù)浸出，合并浸出液，直到色素全 部被洗脫下來(lái)，置70-80r水浴上，將全部浸出液濃縮，待氨全部逸出去（沒(méi)有氨味），調(diào) pH=4,加1g聚酰胺吸附，然后用布氏漏斗過(guò)濾，以200ml 70-80C水洗滌漏斗的聚酰胺粉， 然后用甲醇-甲酸洗脫天然色素。以上操作同蜜餞中色素的測(cè)定方法。提純色素溶液的紙層析定性為了判斷樣品中存在有幾種色素以及是什么色素，必須進(jìn)行紙層析進(jìn)行鑒定。經(jīng)濃縮后樣品色素溶液一于新華中速層析濾紙上點(diǎn)樣一點(diǎn)樣量3-5微升（若樣品含量低可取 出1ml在濃縮至0.2ml再點(diǎn)樣）一點(diǎn)樣點(diǎn)的直徑應(yīng)不超過(guò)2毫米為宜一點(diǎn)樣線距底邊2厘米 一樣點(diǎn)

12、間距離以及左右紙邊各距2厘米一用展開(kāi)劑展開(kāi)一測(cè)量各色素點(diǎn)的Rf值一于標(biāo)準(zhǔn)色素 Rf值對(duì)照一確定何種色素（以標(biāo)準(zhǔn)色素斑點(diǎn)Rf值衡量樣品各色素斑點(diǎn)的Rf值是否于標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn) 在同一條直線上，色素的顏色是否完全一致，就可確定樣品色素屬于何種色素。Rf （比移值）二斑點(diǎn)移動(dòng)距離/溶劑前沿距離所使用的展開(kāi)劑有：1）正丁醇：無(wú)水乙醇：1%氨水二6 ： 2 ： 32）正丁醇：毗啶：1%氨水二6 ： 3 ： 43）異丁醇：無(wú)水乙醇：水二3 ： 2 ： 2提純色素溶液的薄層分離和定量經(jīng)過(guò)紙層析定性之后，含有一種色素的樣液定容之后，離心即可定量；含有兩種以上的復(fù)合 色素的樣品溶液，需要經(jīng)過(guò)薄層分離為單色素后，再用比色法

13、分別定量，測(cè)定出各種色素的 含量。具體步驟是：薄層板制板一點(diǎn)樣層析一比色一標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制一計(jì)算含量1）薄層板制備聚酰胺粉1g于研缽中一加15ml 75%甲酸一攪拌，使聚酰胺全部溶解一加7.5g硅膠G-研磨 1分鐘一立即涂板（玻璃板要求光滑平整，先用水洗凈，干燥后用酒精擦拭干凈，涂板時(shí)可 用涂本器或手工玻璃涂布）一可涂15X10厘米玻璃板三塊（厚度為0.25-0.3毫米）一玻璃 板放入盛有少量水的大玻璃缸中一蓋好蓋子一使玻璃板中的甲酸由缸底的水吸取一放2-3小 時(shí)一取出玻璃板一于空氣中風(fēng)十一于60-65C烘箱30分鐘一放入干燥器中備用2）點(diǎn)樣層析用點(diǎn)樣管（毛細(xì)管、微量注射器）將濃縮并定容的樣液點(diǎn)在

14、薄層板上一基線距底邊2厘米一 點(diǎn)成與底邊平行的條狀一兩端距邊各為2厘米，點(diǎn)樣量一般為0.4ml 一點(diǎn)樣時(shí)要用電吹風(fēng)機(jī) 邊點(diǎn)邊吹十一然后進(jìn)行展層析展層缸先用溶劑系流30分鐘一再把點(diǎn)好樣的薄層板放入展析缸用上行法展開(kāi)一薄板下端浸 入溶液0.5-1厘米一大約1小時(shí)看色素已明顯分開(kāi)后一即可取出薄板一晾十對(duì)溶劑系流的選擇是：a）分離胭脂紅、莧菜紅、新紅、檸檬黃、桔黃、靛藍(lán)等用正丁醇：毗 啶：5%氨水=6 : 6 : 4（這種展開(kāi)劑主要分離靛藍(lán)，因?yàn)榈逅{(lán)上升很快，其它上升很慢）；b）分 離檸檬黃、胭脂紅、莧菜紅、檸檬黃、桔黃等時(shí)用展開(kāi)劑為2.5%檸檬酸鈉：氨水=4 : 3 （檸 檬黃上升很快，其它上升慢）

15、；c）對(duì)于分離兩種紅色素（莧菜紅、胭脂紅）的食品用甲醇： 乙二胺：氨水=10 ： 3 ： 4 （主要是莧菜紅與胭脂紅上升快，其它色素上升慢）。3）比色定量將薄層板展開(kāi)后f用小刀分別將各條色斑刮下移入砂芯漏斗f用乙醇氨溶液解吸抽濾f于 水浴上蒸發(fā)到無(wú)氨味一定容10mlf分別測(cè)出消光值E （根據(jù)各種色素的最大吸收波長(zhǎng)測(cè)定其 光密度）f從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出相應(yīng)的各色素含量.4）標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備先配成標(biāo)準(zhǔn)色素貯備液（100微克/ml），稱(chēng)0.1g標(biāo)準(zhǔn)色素加水稀釋至1000ml10ml比色管123456789標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用 液0.10.20.30.40.50.60.70.80.9加水分別加水至10ml相當(dāng)于“ g/

16、ml015102030405060分別測(cè)出EO-E9的消光值以水為參比，以色素濃度為橫生標(biāo)，消光值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。 以水為參比，PH值為6，各色素的最大吸收波長(zhǎng)為下：胭脂紅508納米；檸檬黃428納米；莧菜紅520納米；晚霞黃485納米；赤蘚紅528納米；靛藍(lán)610納米；注意事項(xiàng)1）上述兩個(gè)公式若乘以1/100，即由mg/kg變?yōu)閹?萬(wàn)。例如胭脂紅含量為80mg/kg即0.8/ 萬(wàn)；2）聚酰胺粉吸附要求預(yù)先活化，并要求在一定的溫度、pH和一定的作用時(shí)間下進(jìn)行， 操作時(shí)要注意。聚酰胺在酸性條件下吸附色素牢固，用水洗滌聚酰胺粉以除去可溶性物質(zhì)， 要求水偏酸性（pH=4），防止聚酰胺上色素在

17、洗滌過(guò)程中脫落下來(lái)；3）樣品的前處理和提純過(guò)程很重要，要充分去除雜質(zhì)（油脂、蛋白質(zhì)、淀粉、糖）以免影響 吸附及層析效果。一般能溶解在水中的物質(zhì)，如食鹽、糖、味精、香精等，在用酸性水洗滌聚酰胺粉時(shí)都能除 去，還有明膠、果膠也可以通過(guò)大量水除去；對(duì)油脂類(lèi)可以用丙酮或石油醚洗滌脫脂，如果 油脂含量很高，可在研缽中用丙酮、海砂研磨除去；對(duì)于樣品中蛋白質(zhì)、淀粉含量高時(shí)，可 用蛋白酶或鎢酸鈉、淀粉酶水解后除去；對(duì)于天然色素可用6 : 4甲醇-甲酸除去；4）紙層析定性時(shí)不可皺折，邊緣應(yīng)剪齊，不可有毛邊，而且要注意紙的橫、豎向，應(yīng)順紋 上行，展開(kāi)較好，否則結(jié)果不規(guī)律；5）在濃縮樣液時(shí)應(yīng)控制水浴溫度70-80r

18、，應(yīng)使緩慢蒸發(fā)，勿濺出皿外，防止色素干結(jié)在 蒸發(fā)皿的壁上（應(yīng)經(jīng)常搖動(dòng)蒸發(fā)皿）；6）靛藍(lán)褪色由深蘭色一淺蘭色一黃色一無(wú)色。靛藍(lán)褪色是由于光、氧、溫度高、PH等多種 因素的影響，測(cè)定靛藍(lán)時(shí)要注意上述因素的影響；7）展開(kāi)劑使用時(shí)最好2天換一次，以保證分離效果，放置時(shí)間過(guò)長(zhǎng)造成濃度和極性都起變 化，影響分離效果；8）漏斗用完后要洗凈，先用濃HCl20ml少量多次洗，然后用水多次沖洗，否則影響下一個(gè)樣 品的吸附或解吸作用；9）聚酰胺粉可回收使用。使用過(guò)的聚酰胺收集于干凈的燒杯中，用0.5%NaOH溶液浸泡24 小時(shí)之后水泵抽十，倒回?zé)?.1NHC1泡30分鐘，然后再用水泵抽干，用水洗全中性， 置6

19、0 r烘箱烘干備用；10）比色時(shí)樣液要求清晰，若混濁使E增大，影響結(jié)果，如果混濁可離心也可放置。二.柱層析分離色素（一）實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶W(xué)習(xí)用吸附層析法分離葉子色素的基本原理和操作技術(shù)。（二）實(shí)驗(yàn)原理層析法是一種物理分離方法。柱層析法是層析方法中的一個(gè)類(lèi)型，分為吸附柱層析法和分配 柱層析法。本實(shí)驗(yàn)僅介紹吸附柱層析法。如圖所示。它們都是毗咯衍生物與吸附柱層析法是分離、純化和鑒定有機(jī)物的重要方法。它是根據(jù)混合物中各組分的分子結(jié)構(gòu) 和性質(zhì)（極性）來(lái)選擇合適的吸附劑和洗脫劑，從而利用吸附劑對(duì)各組分吸附能力的不同及 各組分在洗脫劑中的溶解性能不同達(dá)到分離目的。吸附柱層析法通常是在玻璃層析柱中裝入 表面積很大、經(jīng)

20、過(guò)活化的多孔性或粉狀固體吸附劑（常用的吸附劑有氧化鋁、硅膠等）。當(dāng) 混合物溶液流過(guò)吸附柱時(shí)，各組分同時(shí)被吸附在柱的上端，然后從柱頂不斷加入溶劑（洗脫 劑）洗脫。由于不同化合物吸附能力不同，從而隨著溶劑下移的速度不同，于是混合物中各 組分按吸附劑對(duì)它們所吸附的強(qiáng)弱順序在柱中自上而下形成了若干色帶， 在洗脫過(guò)程中，柱中連續(xù)不斷地發(fā)生吸附和溶解的交替現(xiàn) 象。被吸附的組分被溶解吸出來(lái)，隨著溶劑向下移動(dòng)，又 遇到新的吸附劑顆粒，把組分從溶液中吸附出來(lái)，而繼續(xù) 流下的新溶劑又使組分溶解而向下移動(dòng)，這樣經(jīng)過(guò)適當(dāng)時(shí) 間移動(dòng)后，各種組分就可以完全分開(kāi)，繼續(xù)用溶劑洗脫， 吸附能力最弱的組分隨溶劑首先流出，再繼續(xù)加

21、溶劑直至 各組分依次全部由柱中洗出為止，分別收集各組分。如圖所示。它們都是毗咯衍生物與綠色植物如菠菜葉中含有葉綠素（綠）、胡蘿卜素（橙） 和葉黃素（黃）等多種天然色素。葉綠素存在兩種結(jié)構(gòu)相 似的形式即葉綠素 a（C55 H72O5N4Mg）和葉綠素b（C 55H7O6N4Mg），其差別僅是a中一個(gè)甲基被b中的甲?；〈＝饘冁V的絡(luò)合物，是植物進(jìn)行光合作用所必需的催化劑。植物中葉綠素a的含量通常是b的 3倍。盡管葉綠素分子中含有一些極性基團(tuán)，但大的烴基結(jié)構(gòu)使它易溶于醚、石油醚等一些 非極性的溶劑。胡蘿卜素（C40H56）是具有長(zhǎng)鏈結(jié)構(gòu)的共軛多烯。它有三種異構(gòu)體，即a-, P -和Y -胡 蘿卜

22、素，其中& -異構(gòu)體含量最多，也最重要。在生物體內(nèi)，p -體受酶催化氧化即形成 維生素A。目前& -胡蘿卜素已可進(jìn)行工業(yè)生產(chǎn)，可作為維生素A使用，也可作為食品工 業(yè)中的色素。葉黃素（C40H56O2）是胡蘿卜素的羥基衍生物，它在綠葉中的含量通常是胡蘿卜素的兩倍。與胡蘿卜素相比，葉黃素較易溶于醇而在石油醚中溶解度較小。本實(shí)驗(yàn)是用活性氧化鋁作吸附劑，分離菠菜中胡蘿卜素、葉黃素、葉綠素a和葉綠素b。（三）主要試劑與儀器 儀器：研缽、布氏漏斗、圓底燒瓶、直形冷凝管、層析柱，抽濾瓶，燒杯，鐵架臺(tái)，脫脂棉 試劑：中性氧化鋁，甲醇，石油醚（60-90 C），丙酮，乙酸乙酯，菠菜葉，95%乙醇，0.05% 甲

23、基橙與亞甲藍(lán)的乙醇溶液。（四）操作步驟菠菜色素的提取稱(chēng)取2g洗凈后的新鮮的菠菜葉，用剪刀剪碎并與10mL甲醇拌勻，在研缽中研磨約5min 然后用布氏漏斗抽濾菠菜汁，棄去濾渣。將菠菜汁放回研缽，每次用10mL 3:2 （體積比）的石油醚-甲醇混合液萃取兩次，每次需加以研磨并且抽濾。合 并深綠色萃取液，轉(zhuǎn)入分液漏斗，每次用5mL水洗滌兩次，以除 去萃取液中的甲醇。洗滌時(shí)要輕輕旋蕩，以防止產(chǎn)生乳化。棄去水 -甲醇層，石油醚層用無(wú)水硫酸鈉干燥后濾入圓底燒瓶，在水浴上 蒸去大部分石油醚全體積約為1mL為止。裝柱 取一支潔凈干燥的層析柱玻管，自柱口塞入少許脫脂棉 并用長(zhǎng)玻棒推至柱底壓平（塞時(shí)不宜太緊）。然

24、后從柱口小心裝入 活性氧化鋁（160-200目，于300- 400C活化3-4小時(shí)），邊裝 邊用手指敲打?qū)游鲋固钛b緊密均勻，直至氧化鋁粉柱高達(dá)10 厘米時(shí)為止。再在柱頂加入一薄層脫脂棉花（約0.5cm厚）。將此 層析柱固定在鐵架臺(tái)上，下面接一個(gè)抽濾瓶，裝置如圖所示。加樣 打開(kāi)層析柱下端活塞，將抽濾瓶與水泵相連，抽氣減壓。用小燒杯從柱口沿管壁小心加入95%乙醇流出（切勿把氧化鋁表面沖亂）。當(dāng)柱頂尚留有1-2ml 乙醇時(shí)，停止減壓，加入混合溶液1ml （要預(yù)先準(zhǔn)備好）。待色素全部進(jìn)入柱體后，在柱頂 小心加洗脫劑一石油醚-丙酮溶液9:1 （體積比）。打開(kāi)活塞，讓洗脫劑逐滴放出，層析 即開(kāi)始進(jìn)行，

25、用錐形瓶收集。當(dāng)?shù)谝粋€(gè)有色成分即將滴出時(shí)，取另一錐形瓶收集，得橙黃色 溶液，它就是胡蘿卜素。用石油醚-丙酮7:3 （體積比）作洗脫劑，分出第二個(gè)黃色帶， 它是葉黃素（1 ）。再用丁醇-乙醇-水3:1:1 （體積比）洗脫葉綠素a （藍(lán)綠色） 和葉綠素b （黃綠色）。洗脫、分離待混合物的上液面與柱上端棉花層的上面相平時(shí)，慢慢加入95%乙醇，并抽 氣減壓，在柱上可以看到橙色和藍(lán)綠色的色帶。待乙醇液面降至離棉花層數(shù)毫米時(shí)，再繼續(xù) 加入乙醇洗脫，每次加入約2-3ml，直至一種染料被完全洗脫為止（此時(shí)滴下之洗脫劑應(yīng)無(wú) 色）。第一種染料洗脫完后，停止抽氣。將抽濾瓶中的乙醇溶液倒入回收瓶中。改用水作洗 脫劑，

26、繼續(xù)抽氣減壓，可將第二種染料洗出。實(shí)驗(yàn)完畢，繼續(xù)抽氣減壓至吸附劑被抽十，然后將吸附劑（氧化鋁）倒入指定的容器中，并 把層析柱洗凈倒立于鐵架臺(tái)上晾十。柱效和色帶的薄層檢測(cè)取三塊硅膠薄層板，劃好起始線，用不同的平口毛細(xì)管點(diǎn)樣4。每塊板上點(diǎn)兩個(gè)樣，其中一 個(gè)是混合色素濃縮液，另一個(gè)分別是第一、第二、第三色帶。仍用體積比為1:3的石油二氯 甲烷混合液作展開(kāi)劑展開(kāi)。比較各色帶的Rf值，指出各色帶是何化合物。觀察各色帶點(diǎn)樣展 開(kāi)后是否有新的斑點(diǎn)產(chǎn)生，推估柱層析分離是否達(dá)到了預(yù)期效果。紅色素的紅外光譜鑒定和紫外吸收將柱中分得的紅色帶濃縮蒸發(fā)至干，充分干燥后用漠化鉀壓片法作紅外光譜圖，與紅色素純 樣品的譜圖相

27、比較，并說(shuō)明在31003600 cm-1區(qū)域中為什么沒(méi)有吸收峰。用自己分得的紅色素作紫外光譜，確定久max。五.注意事項(xiàng)層析柱裝填緊密與否，對(duì)分離效果影響很大。若柱中留有氣泡或各部分松緊不勻（更不能 有斷層）時(shí)，會(huì)影響滲透速度和顯色的均勻。在吸附柱上端加入脫脂棉是為了加樣品和洗脫劑時(shí)不致把吸附劑沖起，影響分離效果；在 吸附柱下端加入脫脂棉是為了防止吸附劑細(xì)粒流出。為了保持吸附柱的均一性，應(yīng)該使整個(gè)吸附劑浸泡在溶劑或溶液中，即從第一次注入乙醇 起直至實(shí)驗(yàn)完畢，絕不能讓柱內(nèi)液體之液面降至棉花層之下。否則當(dāng)柱中溶劑或溶液流干時(shí)， 會(huì)使柱身十裂。若再重新加入溶劑，會(huì)使吸附柱的各部分不均勻而影響分離效果

28、。思考題為什么極性較大的物質(zhì)要用極性較大的溶劑洗脫？層析柱中若留有空氣或裝填不勻，會(huì)怎樣影響分離效果？如何避免？試比較葉綠素、葉黃素和胡蘿卜素三種色素的極性，為什么胡蘿卜素在層析柱中移動(dòng)最 快？三、高效液相色譜法1、食品中合成著色劑的測(cè)定原理食品中人工合成著色劑用聚酰胺吸附法或液一液分配法提取，制成水溶液，注入高效液相色 譜儀，經(jīng)反相色譜分離，根據(jù)保留時(shí)間定性和與峰面積比較進(jìn)行定量。最小檢出量，新紅5ng、 檸檬黃4ng、莧菜紅6ng、胭脂紅8ng、日落黃7ng、赤蘚紅18ng、亮藍(lán)26ng，當(dāng)進(jìn)樣量相當(dāng) 0.025g 時(shí)最低檢出濃度分別為 0.2mg/k； 0.16mg/kg； 0.24mg

29、/kg； 0.32mg/kg； 0.28mg/k；0.72mg/k； 1.04mg/ko2、食品中合成著色劑的測(cè)定 試劑正己烷 鹽酸 乙酸 甲醇：經(jīng)濾膜(0.5cm)過(guò)濾聚酰胺粉(尼龍6)：過(guò)200目篩 乙酸銨溶液(0.02mol/L)：稱(chēng)取1.54g乙酸銨，加水全1000mL，溶解，經(jīng)濾膜(0.45cm)過(guò)濾氨水：量取氨水2mL，加水至100mL，混勻氨水一乙酸銨溶液(0.02mol/L)：量取氨水0.5mL，加乙酸銨溶液(0.02mol/L)至1000mL，混 習(xí)甲醇一甲酸(6 + 4)溶液：量取甲醇60mL，甲酸40mL，混勻檸檬酸溶液：稱(chēng)取20g檸檬酸(C6H8O7-H2O)，加水至1

30、00mL，溶解混勻無(wú)水乙醇一氨水一水(7 + 2+1)溶液：量取無(wú)水乙醇70mL、氨水20mL、水10mL，混勻三正辛胺正丁醇溶液(5%):量取三正辛胺5mL，加正丁醇至100mL，混勻飽和硫酸鈉溶液硫酸鈉溶液(2g/L) pH6的水：水加檸檬酸溶液調(diào)pH值到6合成著色劑標(biāo)準(zhǔn)溶液：準(zhǔn)確稱(chēng)取按其純度折算為100%質(zhì)量的檸檬黃、日落黃、莧菜紅、胭脂 紅、新紅、赤蘚紅、亮藍(lán)、靛藍(lán)各0.100g，置100mL容量瓶中，加pH6水到刻度。配成水溶 液(1.00mg/mL)合成著色劑標(biāo)準(zhǔn)使用液：臨用時(shí)上述溶液(或?qū)?. 16)加水稀釋20倍，經(jīng)濾膜(0. 45?m) 過(guò)濾。配成每毫升相當(dāng)50. 0?g的合成著色劑。3、食品中合成著色劑的測(cè)定 儀器高效液相色譜儀，帶紫外檢測(cè)器，254nm波長(zhǎng)。5、食品中合成著色劑的測(cè)定 分析步驟5.1樣品處理5.1.1桔子汁、果味水、果于露汽水等：稱(chēng)取20. 040. 0g，放入100mL燒杯中。含二氧 化碳樣品加熱驅(qū)除二氧化碳。5.1.2配制酒類(lèi)：稱(chēng)取20. 040. 0g，放100m