病毒感染實(shí)驗(yàn)診斷

1、病毒感染實(shí)驗(yàn)診斷第1頁(yè)，共63頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)40分，星期五然后根據(jù)可疑病毒的生物學(xué)特點(diǎn)、機(jī)體免疫應(yīng)答和臨床過(guò)程，以及病人當(dāng)前所處的時(shí)機(jī)，確定實(shí)驗(yàn)診斷方法。第2頁(yè)，共63頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)40分，星期五1.對(duì)潛伏期短，發(fā)病時(shí)尚無(wú)抗體產(chǎn) 生，可選擇測(cè)定病毒顆粒、病毒 抗原或核酸。第3頁(yè)，共63頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)40分，星期五2.對(duì)潛伏期超過(guò)十天的感染，可 檢測(cè)特異性的IgM抗體來(lái)進(jìn)行早 期快速診斷，及區(qū)別初次和再 次感染。第4頁(yè)，共63頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)40分，星期五3.對(duì)可在體內(nèi)形成持續(xù)感染或潛伏 感染的病毒，可檢測(cè)急性期和恢 復(fù)期雙份

2、血清的IgG抗體有無(wú)4倍 以上升高，或直接檢測(cè)病毒核酸。第5頁(yè)，共63頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)40分，星期五4.對(duì)原因不明或有新病毒感染時(shí)， 應(yīng)采集標(biāo)本進(jìn)行病毒分離，同 時(shí)應(yīng)采取雙份血清以確認(rèn)分離 的病毒為病原體。第6頁(yè)，共63頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)40分，星期五5.對(duì)同一癥狀可有多種病毒引起的 情況，應(yīng)同時(shí)檢測(cè)幾種相關(guān)病毒 的病毒顆粒、抗原或抗體，6.對(duì)由多個(gè)型別組成的病毒可測(cè)定 它們的共同抗原。 第7頁(yè)，共63頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)40分，星期五第一節(jié)標(biāo)本采集與運(yùn)送 一、標(biāo)本的采集1.采樣時(shí)間 盡可能在發(fā)病的初期， 急性期或患者人院的當(dāng)天進(jìn)行。 第8頁(yè)，共63頁(yè)

3、，2022年，5月20日，8點(diǎn)40分，星期五2.標(biāo)本種類(lèi)的選擇 根據(jù)臨床感染 的癥狀及流行病學(xué)資料，判斷可 能感染病毒種類(lèi)，選擇相應(yīng)部位 采取標(biāo)本。 第9頁(yè)，共63頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)40分，星期五常見(jiàn)分離病毒標(biāo)本的選擇 病毒咽拭子糞便血液腦脊液唾液 組織 柯薩奇A和B組 +心 單純皰疹病毒 +腦膜 腮腺炎病毒 +流感病毒 +輪狀病毒 +HAV+HIV+ 精液第10頁(yè)，共63頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)40分，星期五3常見(jiàn)標(biāo)本的采集方法 (1)血液：以無(wú)菌取抗凝血10ml。 抗凝選用100nml肝素鈉。 用于分離CMV、HSV，、黃病 毒、EBV、HIV-1及新生兒腸 道病毒。

4、第11頁(yè)，共63頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)40分，星期五(2)腦脊液：以無(wú)菌取腦脊液 12ml，冰浴立即送檢。 在4可存放72h。用于分 離柯薩奇病毒、ECHO病毒、 腸道病毒、腮腺炎病毒。第12頁(yè)，共63頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)40分，星期五(3)宮頸或陰道拭子：采取病灶部 位分泌物，或?qū)⑹米由烊藢m頸 約lcm停留5秒取出，冰浴立即 送檢。用于分離 HSV、CMV。第13頁(yè)，共63頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)40分，星期五(4)糞便標(biāo)本：取24糞便加 10ml運(yùn)送液立即送檢，用于 分離腺病毒、腸道病毒和輪 狀病毒。第14頁(yè)，共63頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)40分，星期

5、五(5)含漱液：用無(wú)菌生理鹽水讓 患者含漱。用于分離流感病 毒、副流感病毒、鼻病毒、 RSV等。 第15頁(yè)，共63頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)40分，星期五(6)喉拭子：用壓舌板避免唾液 污染，用拭子采取咽喉部表 面。用于分離腺病毒、CMV、 腸道病毒、HSV、流感病毒等。第16頁(yè)，共63頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)40分，星期五(7)尿道拭子及尿液標(biāo)本：尿道拭 子伸人尿道4cm轉(zhuǎn)動(dòng)3次，以獲 得較多的上皮細(xì)胞，用于分離 CMV和HSV。(8)尸檢標(biāo)本：死亡后盡早采集各 種器官，分別使用器械和容器。 第17頁(yè)，共63頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)40分，星期五二、標(biāo)本的運(yùn)送和保存病毒

6、抵抗力弱，室溫中容易滅活，用于分離培養(yǎng)的標(biāo)本要盡快送檢，4下數(shù)或-70。凍存液中加入甘油或二甲基亞砜(DMSO)等作保護(hù)。第18頁(yè)，共63頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)40分，星期五病毒傳送培養(yǎng)基以Hanks液為基礎(chǔ)加滅活的小牛血清。為抑制細(xì)菌生長(zhǎng)加青霉素100Uml和鏈霉素100gml，為了抑制真菌的生長(zhǎng)加入25gml二性霉素B或40gml制霉菌素。 第19頁(yè)，共63頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)40分，星期五第二節(jié) 病毒分離與鑒定 一、病毒的分離方法1.組織細(xì)胞培養(yǎng) 根據(jù)細(xì)胞的來(lái)源、 特性和傳代次數(shù)分為：(1)原代細(xì)胞培養(yǎng)：將細(xì)胞懸液。 加入營(yíng)養(yǎng)液培養(yǎng)。形成的單 層細(xì)胞，稱(chēng)之為原代細(xì)胞

7、。 第20頁(yè)，共63頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)40分，星期五(2)二倍體細(xì)胞株：仍保持二倍體 特性。壽命一般為4050代， 如人胚肺細(xì)胞。廣泛用于病毒 分離和疫苗制備。第21頁(yè)，共63頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)40分，星期五(3)傳代細(xì)胞系：來(lái)于腫瘤細(xì)胞， 染色體特征類(lèi)似腫瘤細(xì)胞。 常用的有人宮頸癌細(xì)胞(Hela)、 人喉上皮癌細(xì)胞(Hep-2)。第22頁(yè)，共63頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)40分，星期五2雞胚接種 雞胚是用于分離粘 病毒科、皰疹病毒、痘類(lèi)病毒 的較為理想的材料。 第23頁(yè)，共63頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)40分，星期五3動(dòng)物接種 動(dòng)物對(duì)病毒的敏感 性是不

8、同的，選擇合適動(dòng)物十 分重要。小鼠、乳鼠、家兔、 豚鼠、猴等常用于分離病毒。 第24頁(yè)，共63頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)40分，星期五常用于病毒分離的細(xì)胞 細(xì)胞種類(lèi)可分離的病毒 原代細(xì)胞 非洲綠猴腎細(xì)胞 人單核細(xì)胞 人胚腎、肺細(xì)胞 恒河猴獼猴腎細(xì)胞HSV、RSV、VZV、腮腺炎病毒、風(fēng)疹病毒 HIV、HTLV、HHV-6腮腺炎病毒、腺病毒ECHO、脊髓灰質(zhì)炎病毒、柯薩奇A、B組、RSV 二倍體細(xì)胞株 人胚肺成纖維細(xì)胞株 WI-38、MRC5 CMV、VZV、鼻病毒腮腺炎病毒、腺病毒 傳代細(xì)胞系 Hela Hep-2 Vero 柯薩奇A、B組、RSV腺病毒、RSVHSV、RSV、風(fēng)疹病毒

9、、輪狀病毒、麻疹病毒第25頁(yè)，共63頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)40分，星期五三、病毒的鑒定 必須通過(guò)全面了解其特性才能得到鑒定。1.根據(jù)臨床特點(diǎn)，流行病學(xué)資 料，標(biāo)本來(lái)源，大致了解病 毒的一些特性，有助于確認(rèn) 病毒的種類(lèi)。第26頁(yè)，共63頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)40分，星期五2.動(dòng)物感染范圍及特點(diǎn) 病毒感 染動(dòng)物的范圍、發(fā)病的潛伏期。3.細(xì)胞培養(yǎng)特點(diǎn)。 綜合上述資料作出鑒定。第27頁(yè)，共63頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)40分，星期五病毒鑒定的方法1.細(xì)胞培養(yǎng)的結(jié)果觀(guān)察 病毒增殖后導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生:細(xì)胞病 變效應(yīng)(CPE)。細(xì)胞腫大，變圓堆積 成葡萄狀，細(xì)胞溶解出現(xiàn)空斑，細(xì)胞 融合

10、形成多核巨細(xì)胞，胞漿內(nèi)或核內(nèi) 出現(xiàn)嗜酸性或嗜堿性包涵體等；第28頁(yè)，共63頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)40分，星期五不出現(xiàn)細(xì)胞病變現(xiàn)象。細(xì)胞培養(yǎng)液pH的變化。 第29頁(yè)，共63頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)40分，星期五2.中和試驗(yàn)病毒與特異性抗體進(jìn)行免疫反應(yīng)，使病毒失去感染性，在細(xì)胞培養(yǎng)和活的機(jī)體內(nèi)不出現(xiàn)病變的試驗(yàn)。常用細(xì)胞培養(yǎng)進(jìn)行中和試驗(yàn)。如果特異性抗體能中和病毒，使之失去感染性，不出現(xiàn)細(xì)胞病變效應(yīng)，則該病毒為特異性抗體的同型病毒，第30頁(yè)，共63頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)40分，星期五用于病毒的分型診斷最具敏感和準(zhǔn)確性。也可用于檢查患者病后或人工免疫后，機(jī)體血清中抗體增加情況

11、。 第31頁(yè)，共63頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)40分，星期五3.空斑或蝕斑形成試驗(yàn) 空斑是指在單層細(xì)胞中被病毒感染引 起死亡的細(xì)胞區(qū)域，周?chē)换罴?xì)胞包 圍。一般而言，一個(gè)空斑是由一個(gè)感染 性病毒顆粒感染所引起的。不同的病毒 引起的空斑形態(tài)和大小不同?？蛇M(jìn)行病 毒顆粒的計(jì)數(shù)、純化，結(jié)合中和試驗(yàn)可 進(jìn)行病毒的鑒定。第32頁(yè)，共63頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)40分，星期五4.干擾現(xiàn)象 某些病毒間存在著干擾現(xiàn)象， 如某些型別的鼻病毒能干擾 以后進(jìn)入的副流感病毒的增 殖，從而阻抑后者的紅細(xì)胞 吸附作用。第33頁(yè)，共63頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)40分，星期五5.紅細(xì)胞吸附及吸附抑制試驗(yàn)

12、正粘病毒，副粘病毒感染的宿主細(xì)胞，病毒增殖后產(chǎn)生細(xì)胞病變，但在細(xì)胞表面含有病毒某些抗原成分(血凝素)，能吸附雞、豚鼠或猴紅細(xì)胞。第34頁(yè)，共63頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)40分，星期五可作為初步鑒定。如果在培養(yǎng)瓶中加入相應(yīng)的血凝素抗血清后，不出現(xiàn)紅細(xì)胞吸附現(xiàn)象，是為紅細(xì)胞吸附抑制試驗(yàn)陽(yáng)性，可作為病毒鑒定的依據(jù)。第35頁(yè)，共63頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)40分，星期五4血凝試驗(yàn)及血凝抑制試驗(yàn) 某些病毒可與一定種類(lèi)的哺乳 動(dòng)物或禽類(lèi)的紅細(xì)胞產(chǎn)生血凝 現(xiàn)象。加入相應(yīng)的血凝素抗體 可抑制血凝現(xiàn)象的發(fā)生，是為 血凝抑制試驗(yàn)?？勺鳛椴《拘?別確定的依據(jù)。第36頁(yè)，共63頁(yè)，2022年，5月20

13、日，8點(diǎn)40分，星期五5病毒的大小及形態(tài) 可用電子顯微鏡觀(guān)察病毒的 大小及形態(tài)。第37頁(yè)，共63頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)40分，星期五6核酸類(lèi)型鑒別及序列測(cè)定 利用5溴-2-脫氧尿苷(BUDR)抑 制DNA復(fù)制的特性，在細(xì)胞培養(yǎng)液中 加入該物質(zhì)，可抑制DNA病毒的復(fù)制 和增殖，抑制細(xì)胞病變的出現(xiàn)，但對(duì) RNA病毒無(wú)抑制作用，以此判斷病毒 核酸類(lèi)型。第38頁(yè)，共63頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)40分，星期五對(duì)病毒核酸特異序列或全序列的堿基排列測(cè)定或 DNA雜交、DNA-RNA雜交來(lái)鑒定病毒。第39頁(yè)，共63頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)40分，星期五 7耐酸試驗(yàn) 腸道病毒對(duì)酸有耐受

14、力，而 鼻病毒在酸性環(huán)境下易被滅活。 第40頁(yè)，共63頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)40分，星期五8乙醚敏感試驗(yàn) 病毒外圍如有類(lèi)脂包膜，則易 被乙醚破壞，而失去感染性，不 能感染細(xì)胞?？勺鳛椴《臼欠窬?有類(lèi)脂包膜的依據(jù)，也可用氯仿 或去膽酸鈉代替乙醚進(jìn)行試驗(yàn)。 第41頁(yè)，共63頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)40分，星期五9免疫熒光抗體染色 將感染細(xì)胞固定，用特異抗血 清熒光標(biāo)記染色，在熒光顯微鏡 下，可見(jiàn)細(xì)胞內(nèi)熒光，即可確定 型別。 第42頁(yè)，共63頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)40分，星期五第三節(jié)病毒感染快速診斷通過(guò)測(cè)定病毒的特異標(biāo)志成分，如特殊形態(tài)、特異的抗原成分及病毒的核酸，早期確

15、認(rèn)病毒的感染，是病毒學(xué)診斷的重大發(fā)展。 第43頁(yè)，共63頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)40分，星期五一、形態(tài)學(xué)檢查1光學(xué)顯微鏡 觀(guān)察病毒感染細(xì)胞出現(xiàn)的包涵體。 根據(jù)特點(diǎn)可作出輔助診斷?？袢?病毒在腦細(xì)胞出現(xiàn)嗜酸性的圓形或 橢圓形包涵體，稱(chēng)為內(nèi)基小體。巨 細(xì)胞病毒在上皮細(xì)胞的細(xì)胞核內(nèi)出 現(xiàn)周?chē)@有一輪暈似“貓頭鷹眼”樣 大型嗜酸性包涵體。第44頁(yè)，共63頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)40分，星期五2電子顯微鏡檢查 (1)電鏡直接檢查：早期病毒感染標(biāo) 本的病毒顆粒。如“秋季瀉”患兒 糞便中的輪狀病毒、甲肝患者糞 便中的HAV，皰疹病毒的皰疹液， HBV患者血清，均可觀(guān)察到特征性 病毒顆粒。

16、第45頁(yè)，共63頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)40分，星期五(2)免疫電鏡檢查：在標(biāo)本中加入 抗體。使病毒聚集成塊負(fù)染觀(guān) 察，更易發(fā)現(xiàn)病毒體，靈敏度 可提高100倍。第46頁(yè)，共63頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)40分，星期五 二、病毒抗原檢測(cè) 病毒抗原是病毒特異性的標(biāo)志， 通過(guò)免疫學(xué)技術(shù)檢測(cè)標(biāo)本中特 異性抗原存在，可以早期診斷 病毒感染。第47頁(yè)，共63頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)40分，星期五1免疫熒光技術(shù) 適合于型別少， 細(xì)胞培養(yǎng)難以成功的病毒，如流 感病毒、副流感病毒、皰疹病毒、 巨細(xì)胞病毒、腺病毒等。肝活檢 組織中的肝炎病毒、神經(jīng)組織中 的單純皰疹病毒、腦組織中的狂 犬病毒或

17、其他脫落細(xì)胞和活檢組 織中的病毒抗原檢測(cè)。第48頁(yè)，共63頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)40分，星期五2酶免疫技術(shù) 有酶免疫組化和 酶免疫吸附(ELlSA)試驗(yàn)法。測(cè) 定標(biāo)本中游離的抗原或抗體。 如檢測(cè)乙型肝炎病毒的表面抗 原(HBsAg)，HIV感染病人的P24 抗體等。第49頁(yè)，共63頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)40分，星期五3.其他技術(shù) 如固相放射免疫技術(shù)、 發(fā)光免疫分析技術(shù)、膠體金標(biāo)記 的免疫層析技術(shù)等。第50頁(yè)，共63頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)40分，星期五三、早期抗體檢測(cè) 檢測(cè)病毒感染機(jī)體后產(chǎn)生的早期特異性抗體，如測(cè)定特異性IgM可以快速明確診斷各種病毒引起的新生兒先天

18、性感染，測(cè)定HAV感染后抗HAV的IgM抗體可以明確診斷HA等。第51頁(yè)，共63頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)40分，星期五四、病毒核酸檢測(cè) 只要有完整的特異基因片段存在， 就可進(jìn)行診斷。第52頁(yè)，共63頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)40分，星期五1斑點(diǎn)雜交法 將待測(cè)的DNA或RNA直接點(diǎn)在雜交濾膜上，變性后，用標(biāo)記的核酸探針進(jìn)行雜交。用32p或131I同位素標(biāo)記的探針通過(guò)放射白顯影，可直接觀(guān)察?，F(xiàn)用地高辛、生物素等非同位素物質(zhì)標(biāo)記，然后采用酶反應(yīng)或酶免疫技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)，已被越來(lái)越多的實(shí)驗(yàn)室廣泛使用。第53頁(yè)，共63頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)40分，星期五2固相雜交技術(shù) 將核酸探針包被

19、聚苯乙烯微孔 板中，加人待測(cè)的核酸序列和 標(biāo)記的指示探針雜交液中進(jìn)行 雜交，洗滌后，用酶免疫技術(shù) 進(jìn)行檢測(cè)。第54頁(yè)，共63頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)40分，星期五3.原位分子雜交技術(shù) 在細(xì)胞原位暴露DNA或RNA，加入標(biāo)記特異核酸探針進(jìn)行雜交。通過(guò)顯色技術(shù)可顯示特定雜交探針在細(xì)胞內(nèi)的位置和核酸的數(shù)量。第55頁(yè)，共63頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)40分，星期五4.Southern印跡和Northern印跡法 Southern印跡法用于DNA的雜交。提取 DNA,用內(nèi)切酶切割后，進(jìn)行瓊脂糖電泳 按分子量使DNA分開(kāi)，將DNA移至硝酸纖 維膜上，用標(biāo)記探針進(jìn)行雜交?？梢詸z 測(cè)病毒DNA特異序列。 Northern印跡法用于RNA雜交分析。將 瓊脂糖電泳后的RNA移至DBM膜上，用標(biāo) 記探針進(jìn)行雜交。用于檢測(cè)RNA或mRNA。第56頁(yè)，共63頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)40分，星期五 5聚合酶鏈反應(yīng)(PCR) 選擇病毒的特異保守片段作為靶基因，進(jìn)行引物設(shè)計(jì)和擴(kuò)增可診斷病毒性感染。選擇病毒的易變區(qū)，結(jié)合RFLP，測(cè)序等技術(shù)可以對(duì)病毒進(jìn)行分型和突變的研究。第57頁(yè)，共63