微生物的計(jì)數(shù)血球計(jì)數(shù)板法

1、 微生物的計(jì)數(shù)血球計(jì)數(shù)板法【摘要】測定微生物細(xì)胞數(shù)量的方法很多，有分光光度法、顯微直接計(jì)數(shù)法和平板計(jì)數(shù)法。分光光度法比較簡便，易操作，但是會(huì)使數(shù)據(jù)嚴(yán)重偏大。而平板計(jì)數(shù)法則會(huì)使實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)嚴(yán)重偏小。 顯微計(jì)數(shù)法適用于各種含單細(xì)胞菌體的純培養(yǎng)懸浮液，如有雜菌或雜質(zhì)，常不易分辨。菌體較大的酵母菌或霉菌孢子可采用血球計(jì)數(shù)板，一般細(xì)菌則采用彼得羅夫霍澤（Petrof Hausser）細(xì)菌計(jì)數(shù)板。兩種計(jì)數(shù)板的原理和部件相同，只是細(xì)菌計(jì)數(shù)板較薄，可以使用油鏡觀察。而血球計(jì)數(shù)板較厚，不能使用油鏡，計(jì)數(shù)板下部的細(xì)菌不易看清。本實(shí)驗(yàn)采用血球計(jì)數(shù)板法，主要目的是了解血球計(jì)數(shù)板法的構(gòu)造和使用方法，學(xué)會(huì)用血球計(jì)數(shù)板對(duì)酵母菌

2、細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康呐c要求 1、了解微生物計(jì)數(shù)常用的三種方法：分光光度法；平板計(jì)數(shù)法；血球計(jì)數(shù)板法。2、了解血球計(jì)數(shù)板的構(gòu)造和使用方法。3、學(xué)會(huì)用血球計(jì)數(shù)板對(duì)酵母細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。二、基本原理利用血球計(jì)數(shù)板在顯微鏡下直接計(jì)數(shù)，是一種常用的微生物計(jì)數(shù)方法。此法的優(yōu)點(diǎn)是直觀、快速。將經(jīng)過適當(dāng)稀釋的菌懸液（或孢子懸液）放在血球計(jì)數(shù)板載玻片與蓋玻片之間的計(jì)數(shù)室中，在顯微鏡下進(jìn)行計(jì)數(shù)。由于計(jì)數(shù)室的容積是一定的（0.1mm2），所以可以根據(jù)在顯微鏡下觀察到的微生物數(shù)目來換算成單位體積內(nèi)的微生物總數(shù)目。由于此法計(jì)得的是活菌體和死菌體的總和，故又稱為總菌計(jì)數(shù)法。血球計(jì)數(shù)板，通常是一塊特制的載玻片，其上由四條

3、槽構(gòu)成三個(gè)平臺(tái)。中間的平臺(tái)又被一短橫槽隔成兩半，每一邊的平臺(tái)上各刻有一個(gè)方格網(wǎng)，每個(gè)方格網(wǎng)共分九個(gè)大方格，中間的大方格即為計(jì)數(shù)室，微生物的計(jì)數(shù)就在計(jì)數(shù)室中進(jìn)行。 計(jì)數(shù)室的刻度一般有兩種規(guī)格，一種是一個(gè)大方格分成16個(gè)中方格，而每個(gè)中方格又分成25個(gè)小方格；另一種是一個(gè)大方格分成25個(gè)中方格，而每個(gè)中方格又分成16個(gè)小方格。但無論是哪種規(guī)格的計(jì)數(shù)板，每一個(gè)大方格中的小方格數(shù)都是相同的，即1625=400小方格。 每一個(gè)大方格邊長為1mm，則每一大方格的面積為1mm2，蓋上蓋玻片后，載玻片與蓋玻片之間的高度為01mm，所以計(jì)數(shù)室的容積為01mm3。在計(jì)數(shù)時(shí)，通常數(shù)五個(gè)中方格的總菌數(shù)，然后求得每個(gè)中

4、方格的平均值，再乘上16或25，就得出一個(gè)大方格中的總菌數(shù)，然后再換算成1ml菌液中的總菌數(shù)。下面以一個(gè)大方格有25個(gè)中方格的計(jì)數(shù)板為例進(jìn)行計(jì)算：設(shè)五個(gè)中方格中總菌數(shù)為A，菌液稀釋倍數(shù)為B，那么，一個(gè)大方格中的總菌數(shù)因1ml=1cm3=1000mm3， =50000AB（個(gè)）同理，如果是16個(gè)中方格的計(jì)數(shù)板，設(shè)五個(gè)中方格的總菌數(shù)為A，則三、實(shí)驗(yàn)材料1）菌種：釀酒酵母菌2）用品：顯微鏡、血球計(jì)數(shù)板、酒精燈、蓋玻片、接種環(huán)、番紅染液、膠頭滴管。四、實(shí)驗(yàn)方法 1、實(shí)驗(yàn)流程圖 制備稀釋液加樣找計(jì)數(shù)室計(jì)數(shù) 2、實(shí)驗(yàn)步驟1）鏡檢計(jì)數(shù)室：在加樣前，先對(duì)計(jì)數(shù)板的計(jì)數(shù)室進(jìn)行鏡檢。若有污物，則需清洗后才能進(jìn)行計(jì)數(shù)

5、。 2）將釀酒酵母菌懸液進(jìn)行適當(dāng)稀釋，菌液如不濃，可不必稀釋。 3)取潔凈的血球計(jì)數(shù)板一塊，在計(jì)數(shù)區(qū)上蓋上一塊蓋玻片。然后在顯微鏡下找到計(jì)數(shù)室。若計(jì)數(shù)室沾有雜質(zhì)或者菌體，要用蒸餾水沖洗計(jì)數(shù)板，用濾紙吸干其上的水分。然后再放到顯微鏡下找到計(jì)數(shù)室。 4)將酵母菌懸液搖勻，用滴管吸取少許，從計(jì)數(shù)板中間平臺(tái)兩側(cè)的溝槽內(nèi)沿蓋玻片的下邊緣摘入一小滴（不宜過多），讓菌懸液利用液體的表面張力充滿計(jì)數(shù)區(qū)，勿使氣泡產(chǎn)生，并用吸水紙吸去溝槽中流出的多余菌懸液。 5)靜置片刻，先在低倍鏡下找到計(jì)數(shù)區(qū)后，再轉(zhuǎn)換高倍鏡觀察并計(jì)數(shù)。由于生活細(xì)胞的折光率和水的折光率相近，觀察時(shí)應(yīng)減弱光照的強(qiáng)度。 6)計(jì)數(shù)時(shí)若計(jì)數(shù)區(qū)是由16個(gè)

6、大方格組成，按對(duì)角線方位，數(shù)左上、左下、右上、右下的4個(gè)大方格（即100小格）的菌數(shù)。如果是25個(gè)大方格組成的計(jì)數(shù)區(qū)，除數(shù)上述四個(gè)大方格外，還需數(shù)中央l個(gè)大方格的菌數(shù)（即80個(gè)小格）。如菌體位于大方格的雙線上，計(jì)數(shù)時(shí)則數(shù)上線不數(shù)下線，數(shù)左線不數(shù)右線，以減少誤差。本實(shí)驗(yàn)采用25格16格的血球計(jì)數(shù)板。計(jì)數(shù)時(shí)應(yīng)數(shù)5個(gè)大方格。 7)計(jì)數(shù)。每個(gè)樣品重復(fù)計(jì)數(shù)23次（每次數(shù)值不應(yīng)相差過大，否則應(yīng)重新操作），求出每一個(gè)小格中細(xì)胞平均數(shù)（N），按公式計(jì)算出每ml（g）菌懸液所含酵母菌細(xì)胞數(shù)量。 8)測數(shù)完畢，取下蓋玻片，用水將血球計(jì)數(shù)板沖洗干凈，切勿用硬物洗刷或抹擦，以免損壞網(wǎng)格刻度。洗凈后自行晾干或用吹風(fēng)機(jī)吹

7、干，放入盒內(nèi)保存。 9）計(jì)算結(jié)果。 可用以下公式進(jìn)行計(jì)算（1）16格25格的血球計(jì)數(shù)板計(jì)算 HYPERLINK /wiki/%E5%85%AC%E5%BC%8F o 公式 公式：細(xì)胞數(shù)/ml=100小格內(nèi)細(xì)胞個(gè)數(shù)/10040010000稀釋倍數(shù)（2）25格16格的血球計(jì)數(shù)板計(jì)算公式：細(xì)胞數(shù)/ml=80小格內(nèi)細(xì)胞個(gè)數(shù)/8040010000稀釋倍數(shù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果計(jì)算次數(shù)各大格中細(xì)胞數(shù)大格中細(xì)胞總數(shù)稀釋倍數(shù)總菌數(shù)（CFU/mL或g)左上右上左下右下中間第一次3237403944960100960000000六、結(jié)論與分析1、誤差來源本次試驗(yàn)中我們組用的是2號(hào)酵母培養(yǎng)液，是本次試驗(yàn)所用的酵母培養(yǎng)液中濃度最高

8、的培養(yǎng)液。但是經(jīng)過老師分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)仍然偏大的一點(diǎn)。產(chǎn)生這種誤差的原因大概如下：酵母細(xì)胞計(jì)數(shù)的誤差分別來源于技術(shù) HYPERLINK /wiki/%E8%AF%AF%E5%B7%AE o 誤差 t _blank 誤差和固有誤差。其中由于操作人員不注意細(xì)節(jié)， HYPERLINK /wiki/%E5%99%A8%E6%9D%90 o 器材 器材處理、使用不當(dāng)，稀釋不準(zhǔn)確，細(xì)胞識(shí)別錯(cuò)誤等因素所造成的誤差屬技術(shù)誤差；而由于 HYPERLINK /wiki/%E4%BB%AA%E5%99%A8 o 儀器 儀器（計(jì)數(shù)板、蓋片、 HYPERLINK /wiki/%E5%90%B8%E7%AE%A1 o 吸管

9、 t _blank 吸管等）不夠準(zhǔn)確與精密帶來的誤差稱儀器誤差，由于 HYPERLINK /wiki/%E7%BB%86%E8%83%9E o 細(xì)胞 細(xì)胞分布不均勻等因素帶來的細(xì)胞計(jì)數(shù)誤差屬于分布誤差或計(jì)數(shù)域誤差（filederror）。 由于時(shí)間的關(guān)系，實(shí)驗(yàn)計(jì)數(shù)的次數(shù)太少，難以得到準(zhǔn)確均勻的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。在實(shí)驗(yàn)過程中，操作人員也存在一定的不嚴(yán)謹(jǐn)性，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生誤差。由于沒有足夠多的平行數(shù)據(jù)，難以用科學(xué)的計(jì)數(shù)方法進(jìn)行結(jié)果的計(jì)算，因此難以得到比較準(zhǔn)確的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。 因此，搞好酵母細(xì)胞計(jì)數(shù)的質(zhì)量控制一般需采用以下措施。1）避免技術(shù)誤差，糾正儀器誤差所用器材均應(yīng)清潔干燥，計(jì)數(shù)板、血蓋片、微量吸管及刻度

10、吸管的規(guī)格應(yīng)符合要求或經(jīng)過校正。嚴(yán)格操作，從消毒、稀釋、加樣到計(jì)數(shù)都應(yīng) HYPERLINK /wiki/%E8%A7%84%E8%8C%83 o 規(guī)范 規(guī)范，尤其應(yīng)注意的是樣品稀釋要作到充分混勻。必須一次性充滿計(jì)數(shù)室，防止產(chǎn)生氣泡，充入細(xì)胞懸液的量以不超過計(jì)數(shù)室臺(tái)面與蓋玻片之間的矩形邊緣為宜。2）縮小計(jì)數(shù)域誤差或分布誤差由于血細(xì)胞在充入計(jì)數(shù)室后呈隨機(jī)分布或，而我們所能計(jì)數(shù)的細(xì)胞分布范圍是有限的，由此造成的計(jì)數(shù)誤差稱為計(jì)數(shù)域誤差或分布誤差?？s小這種誤差的有效方法就是盡量擴(kuò)大細(xì)胞計(jì)數(shù)范圍和計(jì)數(shù)數(shù)目，一般先進(jìn)行誤差估計(jì)，然后決定所需計(jì)數(shù)的數(shù)目和計(jì)數(shù)范圍，只要能將誤差控制在允許范圍內(nèi)即可。2、不足之處

11、 血球計(jì)數(shù)板在 HYPERLINK /wiki/%E6%98%BE%E5%BE%AE%E9%95%9C o 顯微鏡 t _blank 顯微鏡下直接進(jìn)行測定。它觀察在一定的容積中的 HYPERLINK /wiki/%E5%BE%AE%E7%94%9F%E7%89%A9 o 微生物 t _blank 微生物的個(gè)體數(shù)目，然后推算出含菌數(shù)，簡便快捷。但是在計(jì)數(shù)時(shí)包括死活細(xì)胞均被計(jì)算在內(nèi)，還有微小雜物也被計(jì)算在內(nèi)。這樣得出結(jié)果往往偏高，因此適用于對(duì)形態(tài)個(gè)體較大的 HYPERLINK /wiki/%E8%8F%8C%E4%BD%93 o 菌體 t _blank 菌體或 HYPERLINK /wiki/%E5%AD%A2%E5%AD%90 o 孢子 t _blank 孢子進(jìn)行計(jì)數(shù)。思考題1、試述血球計(jì)數(shù)板的計(jì)數(shù)原理。為什么用兩種規(guī)格不同的計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)同一樣品，結(jié)果是一樣的？ 答：每塊計(jì)數(shù)板由H形凹槽分為2個(gè)同樣的計(jì)數(shù)池 計(jì)數(shù)池兩側(cè)各有一支持柱，將特制的專用蓋玻片覆蓋其上，形成高0.10mm的計(jì)數(shù)池。計(jì)數(shù)池畫有長、寬各3.0mm的方格，分為9個(gè)大方格，每個(gè)大格面積為1.0mm;.容積為0.1mm，中