第五章分子生物學(xué)研究法核酸技術(shù)

1、第五章 分子生物學(xué)研究法 三. 核酸 操作技術(shù) 核酸的凝膠電泳 p. 173 1) 基本原理: 在生理條件下, 核酸分子的糖-磷酸骨架中的磷酸基團是呈 離子化狀態(tài), 所以DNA和RNA多核苷酸鏈?zhǔn)菐ж?fù)電的, 把 這些核酸分子放置在電場中, 它們就會向正電極的方向移動。 遷移: 核酸分子在電場中的移動。 電泳的遷移率: 核酸分子在電場中的遷移速度。在一定的電場 強度下, 遷移率取決于核酸分子本身的大小和形 狀(超螺旋結(jié)構(gòu)、開環(huán)、線性的DNA）。 這就是應(yīng)用凝膠技術(shù)分離DNA片段的基本原理。 第五章 分子生物學(xué)研究法 三. 核酸操作技術(shù) 2) 瓊脂糖/聚丙烯酰胺凝膠介質(zhì) - 瓊脂糖是一種線性多糖聚

2、合物, 將瓊脂糖加熱到熔點后冷卻凝 固便會形成帶有孔隙的電泳介質(zhì), 其孔隙的大小和膠的濃度有 關(guān), 濃度越高, 孔隙越小, 其分辨能力越強, 反之則越弱。 - 聚丙烯酰胺凝膠是丙烯酰胺單體和甲叉雙丙烯酰胺交聯(lián)劑在催化劑(如過硫酸銨) 作用下形成的凝膠。 - 瓊脂糖凝膠分辨DNA片段的范圍是: 0.2 50kb之間; 聚丙烯酰胺凝膠分辨DNA片段范圍是: 1-1000bp之間。 第五章 分子生物學(xué)研究法 三. 核酸操作技術(shù) 表: 瓊脂糖及聚丙烯酰胺凝膠分辨 DNA片段的能力_ 凝膠類型及濃度 分離DNA片段的范圍 (bp)_ 0.3%瓊脂糖 50 000-1 000 0.7%瓊脂糖 20 000

3、-1 000 1.4%瓊脂糖 6 000-300 2%瓊脂糖 300 4%聚丙烯酰胺 1 000-100 10%聚丙烯酰胺 500-25 20%聚丙烯酰胺 50-1_第五章 分子生物學(xué)研究法 三.核酸操作技術(shù) 3） 核酸染色與檢測 染色劑：溴化乙錠( ethidium bromide, 簡稱EtBr) 它的分子呈扁平狀，可以插入到DNA或RNA分子的相 鄰堿基之間；在紫外光照射下, 它呈現(xiàn)出桔黃色熒光, 熒光 強度與DNA片段的大小(或數(shù)量)成正比。 嵌入的EtBr分子 EtBr正常DNA雙鏈嵌入了EtBr的DNA雙鏈圖: 溴化乙錠對DNA分子的插入作用第五章 分子生物學(xué)研究法 三.核酸操作技

4、術(shù) （1）染色方法 在熔膠冷卻到 50時, 將EtBr加入膠中, 當(dāng)DNA分子在 凝膠介質(zhì)中移動時能夠吸收EtBr, 但EtBr不能與凝膠介質(zhì) 相結(jié)合, 多余的EtBr則進入到電泳緩沖液中。 把含有DNA分子的凝膠膠板浸泡在EtBr溶液中片刻, 然后將 膠取出, 并放置在紫外光下進行觀察。 （2） 檢測 將染色凝膠放置在紫外光下觀察, 即可檢測出凝膠介質(zhì)中 DNA帶位置。 如果在加樣時, 其中一個樣品槽中加入DNA標(biāo) 記物，通過與標(biāo)準(zhǔn)DNA的譜帶位置相比較, 便可推測出目的 DNA片段的大小, 同時還可以估計出DNA的濃度。第五章 分子生物學(xué)研究法 三.核酸操作技術(shù) 質(zhì)粒DNA酶切驗證圖譜第五

5、章 分子生物學(xué)研究法 三.核酸操作技術(shù) - Gold View I型核酸染色劑 是一種可代替溴化乙錠（EB）的新型DNA染料，其靈敏 度與EB相當(dāng)，使用方法與之完全相同。在紫外燈下雙鏈 DNA呈現(xiàn)綠色熒光，而單鏈DNA呈紅色熒光。 Super Green I型核酸染色劑 GeneFinder 核酸染色劑 溴化乙錠的無毒代替物：第五章 分子生物學(xué)研究法 三.核酸操作技術(shù) 4） 脈沖電場凝膠電泳(PFGE) p.174 圖5-6 適用于分離50kb以上的DNA超大片段。 原理: 在脈沖式交變電場中, DNA分子的遷移方向隨著電場方 向的周期變化而不斷改變。在標(biāo)準(zhǔn)的PFGE中, 第一個脈 沖的電場方

6、向與核酸移動方向成45夾角, 而第二個脈 沖的場方向與核酸移動方向在另一側(cè)成45夾角, 由于 凝膠質(zhì)的電場方向的變化, 使得DNA分子能夠隨時調(diào)整 其移動方向，以適應(yīng)凝膠孔隙的無規(guī)則變化 。第五章 分子生物學(xué)研究法 三.核酸操作技術(shù) 圖: 在脈沖凝膠電泳中的等高壓均勻電場獲得的染色體DNA電泳圖譜 家蠶病原白僵菌至少有 6條染色體,估算其大小在 2.57.2Mbp之間,3種分離菌株間存在多型性。 第五章 分子生物學(xué)研究法 三.核酸操作技術(shù) 2. 核酸的分子雜交 就是將待測定核苷酸序列的單鏈DNA或RNA與探針混合，如 果DNA或RNA片段中含有與探針互補的序列, 那么其相應(yīng)的同 源區(qū)段就會形成

7、雙鏈結(jié)構(gòu), 反之。 探針: 是指經(jīng)過特殊化合物標(biāo)記的特定的核苷酸序列。 - DNA分子雜交 （DNA印跡雜交 , Southern blotting) - RNA分子雜交 (RNA印跡雜交 , Northern blotting) 第五章 分子生物學(xué)研究法 三.核酸操作技術(shù) 1）DNA分子雜交技術(shù)- Southern blotting 用于檢測DNA片段中是否存在與探針同源的序列 因此，可以用于分析外源基因在宿主染色體DNA中的整合 等情況。12345CKSouthern bloting第五章 分子生物學(xué)研究法 三.核酸操作技術(shù) （1） DNA印跡雜交原理 - 基因組DNA的限制性酶切及片段的

8、瓊脂糖凝膠電泳分離 - 堿處理使待測定的DNA片段變性 - 固定在濾膜表面（轉(zhuǎn)膜） - 加入經(jīng)標(biāo)記的單鏈探針進行雜交 - 如果待測定的DNA片段存在與探針同源的序列, 他們可通過 堿基互補作用形成雙鏈, 根據(jù)探針標(biāo)記物的特性對雜交結(jié)果 進行檢測。第五章 分子生物學(xué)研究法 三.核酸操作技術(shù) （2） 濾膜的種類及選擇 濾膜必須具備如下特點: 能很好地與 DNA (RNA) 分子結(jié)合 不影響DNA片段與探針雜交 對探針及其他物質(zhì)的非特異性吸附力小 具有良好的機械性 常用濾膜有: 硝酸纖維素膜 只能與單鏈DNA/RNA在高鹽條件下結(jié)合, 膜與DNA片段以疏水性結(jié)合, 烘干后結(jié)合能力強。 但不適于電轉(zhuǎn)移

9、法；對小于200bp的片段結(jié)合力差；膜不 可重復(fù)使用。 尼龍膜* 二乙氨基乙基纖維素濾膜第五章 分子生物學(xué)研究法 三.核酸操作技術(shù) （3） DNA探針的種類 放射性 (32P) 和非放射性探針 均勻標(biāo)記和末端標(biāo)記探針 第五章 分子生物學(xué)研究法 三.核酸操作技術(shù) - 非放射性標(biāo)記物 生物素(biotin): 是一種水溶性B族維生素, 又稱維生素H。 特點：既能與核苷酸、核酸發(fā)生偶聯(lián)反應(yīng) 又可與抗生物素蛋白/抗體等結(jié)合 偶聯(lián)反應(yīng)：是通過生物素與dUTP分子中嘧啶堿基的 第5位的碳原子之間的碳鏈共價結(jié)合,形成 biotin-11-dUTP 和 biotin-16-dUTP復(fù)合物。 第五章 分子生物學(xué)

10、研究法 三.核酸操作技術(shù) 制備生物素標(biāo)記探針：生物素- dUTP可取代dTTP而被 整合進DNA探針 生物素標(biāo)記的探針雜交結(jié)果可通過下列兩種途徑檢出： 生物素-抗生物素蛋白的親和系統(tǒng) 生物素-抗生物素抗體的免疫系統(tǒng)第五章 分子生物學(xué)研究法 三.核酸操作技術(shù) 用生物素標(biāo)記DNA探針-呈色/熒光法檢測雜交信號技術(shù)硝酸纖維濾膜靶標(biāo)DNAPPPPPP生色或熒光誘發(fā)物質(zhì)P呈色或發(fā)出熒光堿性磷酸酯酶鏈球菌抗生物素蛋白生物素 (biotin)生物素標(biāo)記的探針圖: 用呈色法或熒光法檢測核酸雜交信號圖13-9 生物素標(biāo)記探針檢測核酸過程示意圖 第五章 分子生物學(xué)研究法 三.核酸操作技術(shù) （4） DNA 分子雜交

11、方法 - Southern 斑點雜交 將經(jīng)變性處理的DNA樣品直接點在濾膜 上, 固定后與探針雜交 缺點：假陽性出現(xiàn)頻率高 用于快速檢測基因的整合情況 - Southern 印跡雜交 基因組DNA經(jīng)酶切、電泳分離 、變性、 印跡轉(zhuǎn)移、固定后與探針雜交和檢測 用檢測基因的整合和拷貝數(shù)等情況 - Southern 原位雜交 是將變性染色體固定在玻片上與探針 進行雜交。 用于檢測基因在染色體上整合的位置第五章 分子生物學(xué)研究法 三.核酸操作技術(shù) 基因組DNADNA限制片段凝膠電泳分離 DNA變性DNA印跡轉(zhuǎn)移 固定、雜交 檢測 酶切Southern 印跡雜交過程圖13-10 Southern印跡雜交

12、過程 Southern 原位雜交第五章 分子生物學(xué)研究法 三.核酸操作技術(shù) 2) RNA分子雜交技術(shù)- Northern blotting Northern雜交是指用從生物細胞中提取的總 RNA 或 mRNA 與探針分子雜交 因此， 可用于分析外源基因在受體生物中的轉(zhuǎn)錄情況第五章 分子生物學(xué)研究法 三.核酸操作技術(shù) (1) RNA 印跡雜交原理 檢測原理和步驟與Southern印跡雜交大致相同 不同之處： 應(yīng)用變性瓊脂糖凝膠電泳分離不同大小的RNA分子 變性瓊脂糖凝膠：在膠液中加入變性劑 甲醛 常用變性劑 乙二醛*等 * 乙二醛的兩個乙醛基團可與鳥嘌呤的亞氨基團反應(yīng)，形成環(huán)狀衍生 物以維持RN

13、A的變性狀態(tài)。 第五章 分子生物學(xué)研究法 三.核酸操作技術(shù) 為什么要使用變性瓊脂糖凝膠介質(zhì)？ 因為只有在變性條件下電泳，破壞RNA的空間結(jié)構(gòu), 才能 使RNA在凝膠介質(zhì)中的遷移距離與其分子質(zhì)量對數(shù)值成正比。 第五章 分子生物學(xué)研究法 三.核酸操作技術(shù) RNA Secondary Structure第五章 分子生物學(xué)研究法 三.核酸操作技術(shù) (2) RNA印跡雜交方法 - Northern斑點雜交 用于快速檢測目的基因轉(zhuǎn)錄情況, 但不能檢測出轉(zhuǎn)錄的 mRNA片段大小。 - Northern印跡雜交 用于檢測目的基因轉(zhuǎn)錄情況, 同時可以檢測出 mRNA轉(zhuǎn) 錄本的大小及其轉(zhuǎn)錄水平等。 第五章 分子生

14、物學(xué)研究法 三.核酸操作技術(shù) 例: Northern 印跡雜交結(jié)果 圖: DcLEA1 基因在胡蘿卜體細胞胚發(fā)育的不同階 段的表達 上圖為Northern 雜交結(jié)果, 下圖為總RNA電泳圖(10ug/泳道) 泳道1. 調(diào)控狀態(tài)下的體細胞胚 泳道2-5. 分別為解調(diào)控12、24、36、48h 的體細胞胚 28s18s第五章 分子生物學(xué)研究法 三.核酸操作技術(shù) 注意： 細胞中的總RNA包括：mRNA 占 1-5% rRNA 80-85% tRNA和sRNA 14-19% rRNA電泳后可以觀察到3條特征條帶：28S 18S 5S * 因此， rRNA的特征條帶是用來鑒定總RNA純度和 完整性的重要

15、參數(shù)第五章 分子生物學(xué)研究法 三.核酸操作技術(shù) RNA印跡雜交中注意的兩點: 電泳凝膠中不加 EtBr, 因EtBr與RNA結(jié)合后遷移速 率下降。 所有的器皿、水和試劑必須經(jīng)RNase滅活處理，防 止RNA的降解。 第五章 分子生物學(xué)研究法 三.核酸操作技術(shù) 內(nèi)容回顧： 凝膠電泳技術(shù) 難點：大于50 kb片段的電泳分離。 Sourthern雜交技術(shù) 難點：酶切和變性。 Northern雜交技術(shù) 難點：去除RNase；跑變性膠。 第五章 分子生物學(xué)研究法 四. 基因擴增 聚合酶鏈反應(yīng) (polymerase chain reaction, PCR)技術(shù) 是模擬體內(nèi)DNA復(fù)制過程, 在體外快速擴增

16、特定DNA 序列的方法。 第五章 分子生物學(xué)研究法 四. 基因擴增 1) 發(fā)展歷史1985年，美國科學(xué)家Kary Mullis在高速公路的啟發(fā)下，經(jīng)過兩年的努力，發(fā)明了PCR技術(shù)。1988年初，Keohanog通過對酶的改進，提高了擴增的真實性。1988年，Saiki等人水生嗜熱桿菌內(nèi)提取到一種耐熱的DNA聚合酶，使得PCR技術(shù)的擴增效率大大提高。1993年， Kary Mullis因此而獲得諾貝爾化學(xué)獎。 第五章 分子生物學(xué)研究法 四. 基因擴增 2) PCR反應(yīng)原理 DNA聚合酶能夠以引物3-OH為起點， 催化dNTP按模板順序，合成與模板互補的新鏈。PCR反應(yīng)的過程，即DNA解鏈、引物與

17、模板DNA結(jié)合、鏈的延伸可以被不斷重復(fù)。經(jīng)多次循環(huán)之后，反應(yīng)混合物中所含有的雙鏈DNA分子數(shù)達到2n，能滿足進一步遺傳分析的需要。 擴增體系包括： 模板DNA （單、雙鏈DNA） 引物 4種等量混合的dNTP DNA聚合酶 DNA聚合酶的緩沖液 P.177 圖5-9第五章 分子生物學(xué)研究法 四. 基因擴增 3) 模板DNA的制備 PCR對模板DNA的質(zhì)量要求不高, 可用： 細胞裂解液 提取的染色體DNA 質(zhì)粒DNA4) DNA聚合酶 Taq DNA聚合酶（來自Thermus aquatics） 特點：53的聚合酶活性 53的核酸外切酶活性 無35的核酸外切酶活性 擴增的DNA片段在3有一個突出

18、的A堿基?？梢赃x用“T” 載體進行擴增片段的克隆，常用的載體有pGEM-T ，質(zhì)粒兩末端突出的T與片段兩端突出的A互補。 第五章 分子生物學(xué)研究法 四. 基因擴增 pfu DNA聚合酶 （來自激烈熱球菌Pyrococcus fariosus） 特點： 53的聚合酶活性 53的核酸外切酶活性 35的核酸外切酶活性 擴增的DNA片段為平末端。可用開環(huán)(EcoR V單酶切)的pBluescript質(zhì)?？寺?。第五章 分子生物學(xué)研究法 四. 基因擴增 第五章 分子生物學(xué)研究法 四. 基因擴增 5) PCR循環(huán)參數(shù) _ 溫度 反應(yīng)時間 循環(huán)數(shù)_ 預(yù)變性 94-95C 45s-5min，取決于模板的復(fù)雜性

19、1 (a) 變性 94-95C 取決于聚合酶的種類 (b) 退火(anneal) 取決于引物的 長度、GC含量 取決于聚合酶種類 及引物與模板的 25-30 配對程度 (c) 延伸 72 C 取決于被擴增片段大小 完成 72 C 5-10 min, 取決于聚合酶種類 1_第五章 分子生物學(xué)研究法 四. 基因擴增 例: PCR參數(shù) 反應(yīng)體系 階段 溫度 時間 循環(huán)數(shù)DNA模板 1l 預(yù)變性 94 45 1 引物 1 1l (50ng/ l) 引物 2 1l (50ng/ l) 變性 94 45 dNTPs 1l (10mM/每種) 退火 45 25Pfu 緩沖液 5 l 延伸 72 Pfu聚合酶

20、 0.5 l H2O 40.5 l 完成 72 10 min 1Tm = 55 ; PCR擴增產(chǎn)物長度是 3044 bp。Pfu DNA聚合酶， 每擴增1000bp需要 1-2min。50 6 min第五章 分子生物學(xué)研究法 四. 基因擴增 6) 擴增產(chǎn)物檢測 用瓊脂糖凝膠電泳或聚丙烯酰胺凝膠電泳（片段小于100bp）。檢測是否有特異性擴增產(chǎn)物, 與標(biāo)準(zhǔn)DNA分子片段（DNA Marker）相比較， 判斷擴增片段的大小是否正確 。 第五章 分子生物學(xué)研究法 四. 基因擴增 例: PCR擴增產(chǎn)物的電泳檢測 圖: DcLEA1 基因PCR鑒定 泳道 1-9： 不同樣本PCR擴增產(chǎn)物 泳道 M： 分

21、子量標(biāo)記 泳道 10： 陰性對照856bp1 2 3 4 5 6 7 M 8 9 10Kb215.04.22.01.51.30.90.5第五章 分子生物學(xué)研究法 四. 基因擴增 7) 引物設(shè)計及合成 用于PCR擴增的引物，一般為15-30個核苷酸，主要通過人工合成獲得。 引物設(shè)計的基本原則: 引物中的(G+C)含量應(yīng)在45-65%; 4種堿基應(yīng)隨機分布, 避免單一堿基的連續(xù)排列； 防止引物內(nèi)部形成二級結(jié)構(gòu) (loop); 兩引物之間不應(yīng)發(fā)生互補, 尤其在引物的3端要避免“二聚物” 的形成； 如需引入酶切位點，酶切位點通常放在引物的近5端。一般情況下, 引物的設(shè)計應(yīng)利用計算機軟件進行。 第五章

22、分子生物學(xué)研究法 四. 基因擴增 2. 反轉(zhuǎn)錄-PCR (reverse transcribed-PCR，RT-PCR)技術(shù) 用于 cDNA（complementary DNA，互補DNA）的合成。 1） 原理 是以提取的總RNA 或 mRNA為模板進行反轉(zhuǎn)錄合成 第一鏈cDNA, 并以此為模板，進行PCR擴增。 第五章 分子生物學(xué)研究法 四. 基因擴增 RT-PCR反應(yīng)包括： cDNA 的合成 兩個部分 cDNA 的擴增 第五章 分子生物學(xué)研究法 四. 基因擴增 2） 第一鏈cDNA 的合成 p. 187 - 以mRNA為模板 - DNA引物 - 由反轉(zhuǎn)錄酶催化 - 四種等量混合的 dNTP

23、 使用什么引物?第五章 分子生物學(xué)研究法 四. 基因擴增 以olig(dT)為引物 合成mRNA的第一條cDNA鏈。 P. 187 5 AAAAAA 3mRNA 3 TTTTTTT 5cDNA 反轉(zhuǎn)錄酶 olig(dT)引物 mRNA 3端的互補序列為引物 5 AAAAAA 3mRNA 3 5 cDNA 反轉(zhuǎn)錄酶 特異引物 隨機引物RT-PCR過程示意圖第五章 分子生物學(xué)研究法 四. 基因擴增 3）第二鏈cDNA合成 - 以第一鏈cDNA為模板 - 引物 - 由DNA聚合酶催化 - dNTP引物從何而來?第五章 分子生物學(xué)研究法 四. 基因擴增 cDNA第二鏈的合成方法有兩種: 自身引導(dǎo)法 -

24、 第一條cDNA鏈合成后，cDNA:RNA 雜交鏈變性； - 利用單鏈cDNA 3 端能夠形成一短的發(fā)夾結(jié)構(gòu)，為第 二條cDNA鏈的合成提供引物； - 由大腸桿菌DNA聚合酶 Klenow片段催化合成第二 條cDNA鏈； - 用對單鏈特異性的S1核酸酶切除末端的發(fā)夾結(jié)構(gòu)，得 到cDNA雙鏈。 缺點：合成反應(yīng)較難控制，而且用S1核酸酶切割發(fā)夾結(jié)構(gòu) 時會導(dǎo)致末端序列的缺失，因而該方法目前很少使用。 第五章 分子生物學(xué)研究法 四. 基因擴增 置換合成法 第一條cDNA鏈合成后，產(chǎn)生的cDNA:mRNA 雜交鏈無 需變性。 - 用RNase H酶切割雜交鏈中的mRNA 鏈，在mRNA鏈上 造成切口和缺

25、口，利用一系列小的RNA片段為引物。 - 由大腸桿菌DNA聚合酶催化合成第二條cDNA鏈。 - 最后由DNA連接酶將小的cDNA片段連接成完整的 cDNA鏈。 第五章 分子生物學(xué)研究法 四. 基因擴增 RNase H： - 是一種核糖核酸內(nèi)切酶，特異性水解DNA：RNA雜交鏈 中RNA鏈。 - 該酶對單鏈的核酸、雙鏈DNA或雙鏈RNA沒有作用。 第五章 分子生物學(xué)研究法 四. 基因擴增 置換合成法的優(yōu)點: - 非常高效。 - 直接利用第一鏈反應(yīng)產(chǎn)物，無須進一步處理 和純化。 - 不必使用S1核酸酶來切割雙鏈cDNA中的單鏈 發(fā)夾環(huán)，能保持cDNA序列的完整性。 是目前合成cDNA常采用的方法。

26、第五章 分子生物學(xué)研究法 四. 基因擴增 cDNA的擴增 以cDNA單鏈或雙鏈為模板，在特異性引物的引導(dǎo)下，進行PCR擴增。第五章 分子生物學(xué)研究法 四. 基因擴增 4） cDNA文庫的構(gòu)建 p. 188 cDNA文庫： 從真核生物的組織或細胞中提取各種RNA，通過RT-PCR合成cDNA，將雙鏈cDNA分別和適當(dāng)載體連接后，轉(zhuǎn)化宿主細胞，所獲得菌落或噬菌體的集合即為該生物的cDNA文庫。 克隆載體：cDNA的長度一般在0.5-8 kb。 常用載體有：質(zhì)粒載體和噬菌體載體。 cDNA文庫的構(gòu)建過程cDNA文庫的用途： - 可用于真核生物基因的克隆、表達和調(diào)控的分析; - 比較cDNA和相應(yīng)基因

27、組DNA序列差異可確定內(nèi)含子存在和了解轉(zhuǎn)錄后加工等一系列問題。第五章 分子生物學(xué)研究法 四. 基因擴增 3. 反向PCR (reverse PCR) 用于擴增已知 DNA 區(qū)段之外的末知序列。 原理: 先用一種已知 DNA 區(qū)段上沒有切割位點的限制性內(nèi)切 酶, 從已知 DNA 區(qū)段有一定距離的兩側(cè)位置切割 DNA 分子, 然后將這些片段作分子內(nèi)連接成環(huán)形。根據(jù)己知 的靶 DNA 序列按向外延伸的要求設(shè)計一對引物, 保證 被擴增的是位于靶 DNA 區(qū)段兩側(cè)的末知 DNA 序列。 第五章 分子生物學(xué)研究法 四. 基因擴增 引物 1引物 2引物 1引物 2圖: 反向 PCR 的基本 操作程序引物 2

28、第五章 分子生物學(xué)研究法 五. 核苷酸序列分析 Sanger雙脫氧鏈終止法 (Sanger和Coulson，1977)Maxam-Gilbert DNA化學(xué)降解法 (Maxam 和Gilbert，1977)DNA自動測序法質(zhì)譜法單分子測序法原子探針顯微鏡測序法流式細胞儀測序法大規(guī)模平行測序法、 DNA 芯片法 經(jīng)典方法 新方法第五章 分子生物學(xué)研究法 五. 核苷酸序列分析 1. Sanger 雙脫氧鏈終止法（引物合成法） 1） 原理: 利用 DNA聚合酶在體外合成DNA時，能夠?qū)?2, 3- ddNTP（雙脫氧核糖核苷三磷酸）摻入 到寡核苷酸鏈的3-末端這一特點設(shè)計。 第五章 分子生物學(xué)研究法

29、 五. 核苷酸序列分析 第五章 分子生物學(xué)研究法 五. 核苷酸序列分析535533ddNTP 摻入到DNA合成反應(yīng)后導(dǎo)致反應(yīng)終止 正常的DNA合成反應(yīng)第五章 分子生物學(xué)研究法 五. 核苷酸序列分析 在測序反應(yīng)體系中加入： - 模板DNA (3 5 的單鏈) - 特異性引物 （帶標(biāo)記的） - DNA聚合酶 （測序酶） - dATP、dTTP、dGTP、dCTP和一種ddNTP 在合成反應(yīng)中，當(dāng)這種2 , 3- 雙脫氧ddNTP加到寡核 苷酸鏈生長末端, 由于ddNTP沒有3 -OH基團, 寡核苷 酸鏈不能繼續(xù)延長。 在同一反應(yīng)中, 將會合成出不同長度的DNA片段混合物， 這些片段具有相同 的5-

30、末端和以ddNTP結(jié)束的3 -末端。第五章 分子生物學(xué)研究法 五. 核苷酸序列分析 將這種混合物加到可以區(qū)分長度僅差一個核苷酸的不同 DNA片段的變性凝膠中進行電泳分離, 就可以獲得一系列 全部以3-末端ddNTP為終止殘基的DNA片段的電泳圖譜。 通過放射自顯影的方法檢測單鏈DNA片段的放射性條帶, 就可以直接讀出DNA的核苷酸順序。 第五章 分子生物學(xué)研究法 五. 核苷酸序列分析 雙脫氧鏈終止法測序的基本原理和過程 凝膠電泳方向3AGTTGCTA5測序膠的判讀*放射性標(biāo)記(測序酶) 第五章 分子生物學(xué)研究法 五. 核苷酸序列分析 2. Maxam-Gilbert DNA化學(xué)降解法 1） 原

31、理: 用化學(xué)試劑處理末端帶有放射性標(biāo)記的DNA片段，造成堿基的特異性切割，由此在同一反應(yīng)中產(chǎn)生具有共同起點(放射性標(biāo)記末端)到發(fā)生化學(xué)切割位點的一組長度不同的DNA片段。反應(yīng)混合物經(jīng)凝膠電泳分離和放射自顯影之后, 便可根據(jù)X光片底板上所顯現(xiàn)的相應(yīng)譜帶, 讀出DNA片段的核苷酸順序。第五章 分子生物學(xué)研究法 五. 核苷酸序列分析 2） 方法 （1）DNA樣品制備 首先要對待測定的單鏈DNA片段的5 端作末端標(biāo)記 。 （2）堿基切割常用的化學(xué)試劑: 硫酸二甲酯 - 在酸性條件下, 對G特異性切割 - 在中性條件下, 它作用于 G+A。 肼 又稱聯(lián)氨 (NH2NH2) - 在堿性條件下, 它能夠作用

32、于 T+C. - 在 NH2NH2+鹽的條件下, 對C特異性切割。 第五章 分子生物學(xué)研究法 五. 核苷酸序列分析 硫酸二甲酯酸性 中性 肼堿性 + 鹽 32P圖: Maxam-Gilbert DNA 化學(xué)降解 法原理第五章 分子生物學(xué)研究法 五. 核苷酸序列分析 Sanger 雙脫氧鏈終止法和Maxam-Gilbert化學(xué)降解法這兩種序列測定技 術(shù)原理大同小異。 它們都是生成互相獨立的若干組帶放射性標(biāo)記的寡核苷酸，每組寡核苷酸都有固定的起點，但卻隨機終止于特定的一種核苷酸殘基上。 由于DNA上的每一個堿基出現(xiàn)在可變終止端的機會均等, 因此上述每一 組產(chǎn)物都是一些長短不同的寡核苷酸混合物。然后

33、在可以區(qū)分長度僅差一個核苷酸的不同DNA分子的條件下，對各組寡核苷酸進行電泳分析，即可以從凝膠的放射自顯影膠片上直接讀出DNA上的核苷酸序列。第五章 分子生物學(xué)研究法 五. 核苷酸序列分析 3. DNA序列自動分析法 原理: - 基于 Sanger 雙脫氧鏈終止法的原理，使用四種不同的 熒光染料分別標(biāo)記 ddATP、ddTTP、ddCTP、ddGTP 。 - 這四種熒光染料在激光激發(fā)下發(fā)出不同波長的熒光，因 而每一種熒光代表一種堿基。 - 延伸中的 DNA 互補鏈分別終止于不同熒光標(biāo)記的 ddATP、 ddTTP、ddCTP、ddGTP 。 - 熒光檢測系統(tǒng)將熒光信號轉(zhuǎn)換為電信號, 經(jīng)過數(shù)據(jù)處

34、理系統(tǒng) 處理, 最后把所測得的序列直接打印出來 。 第五章 分子生物學(xué)研究法 五. 核苷酸序列分析 第五章 分子生物學(xué)研究法 五. 核苷酸序列分析 ddAddGddTddGddCddCddAddCddGddT激光激發(fā)熒光信號AGTGCCACGT電泳鏈終止反應(yīng)第五章 分子生物學(xué)研究法 五. 核苷酸序列分析 4. DNA 雜交測序法（芯片測序） 原理: 利用一組己知序列的寡核苷酸短序列作為探針, 同某一特 定的較長的靶 DNA分子進行雜交, 從而測定其核苷酸的序 列。雜交測序法(SBH)： 應(yīng)用一套已知序列的寡核苷酸探針去尋找靶DNA鏈上的互補序列，靶DNA上的序列根據(jù)雜交情況來確定。12-mer

35、的靶DNA序列：AGCCTAGCTGAA靶DNA的互補序列運用八聚體探針微型高密度寡核苷酸點陣的制備第五章 分子生物學(xué)研究法 六. DNA與蛋白質(zhì)相互作用研究 凝膠阻滯試驗 (DNA遷移率變動試驗) 用于體外研究DNA與蛋白質(zhì)相互作用的一種特殊的凝膠電泳技術(shù)。 原理: 在凝膠電泳中, 由于電場的作用, 裸露的DNA向正極方 向移動的距離與其相對分子質(zhì)量的對數(shù)成反比。如果 此時DNA分子與某種蛋白質(zhì)結(jié)合, 那么它的相對分子 質(zhì)量增大, 它在凝膠中的遷移作用便會受到阻滯, 在同 樣的電泳電壓和時間內(nèi)向正極移動的距離也就相應(yīng)縮 短。 第五章 分子生物學(xué)研究法 六. DNA與蛋白質(zhì)相互作用研究 (a)

36、 (b) (c)圖: 在凝膠阻滯 實驗中競爭 DNA與標(biāo)記 DNA之間的 競爭作用 凝膠電泳放射自顯影特異性蛋白質(zhì)標(biāo)記DNA競爭DNA蛋白質(zhì)與競爭DNA結(jié)合蛋白質(zhì)與標(biāo)記DNA 結(jié)合阻滯條帶阻滯條帶第五章 分子生物學(xué)研究法 六. DNA與蛋白質(zhì)相互作用研究 2. DNase I 足跡試驗 ( DNA foot-printing assay) 原理: 先將待檢測的雙鏈 DNA 分子用32P作末端標(biāo)記, 并用 限制性內(nèi)切酶去掉其中的一個末端, 得到只有一個末 端標(biāo)記的雙鏈DNA分子, 然后與蛋白質(zhì)混合。 在標(biāo)記的DNA樣品 (對照）和蛋白質(zhì)、標(biāo)記DNA混合物中分別加入少量的DNase I 對DNA分

37、子進行切割。 第五章 分子生物學(xué)研究法 六. DNA與蛋白質(zhì)相互作用研究 如果某種特異蛋白能夠與DNA分子的某一特定區(qū)段結(jié)合, 那么, 它將保護DNA這一區(qū)段上的酶切位點免受DNase I的切割, 因而也就不能產(chǎn)生出相應(yīng)長度的切割條帶 (與對照相比)，在電泳凝膠的放射自顯影圖片上, 與對照相比將出現(xiàn)一個空白區(qū)域，這一區(qū)域被稱之為 “足跡 ”。 第五章 分子生物學(xué)研究法 六. DNA與蛋白質(zhì)相互作用研究 加入 DNase I凝膠電泳放射自顯影足跡圖: DNase I 足跡試驗標(biāo)記的靶DNA片段, 箭頭為DNase I 酶切位點；標(biāo)記的DNA與特異 蛋白結(jié)合后, 切割位 點6, 7, 8 被蛋白質(zhì)

38、保護而免受DNase I 的切割；DNase I 切割、凝膠電泳后的放射自 顯影。A 為對照; B 為樣品 (標(biāo)記DNA+ 蛋白質(zhì))。 6 7 8第五章 分子生物學(xué)研究法 七. Western 印跡雜交 Western印跡雜交 (Western blotting) 技術(shù) 用于檢測目的基因在蛋白質(zhì)水平的表達情況。 如果目的基因的表達產(chǎn)物是一種酶, 則可以通過測定轉(zhuǎn) 基因生物體中該酶的活性, 來達到了解該基因表達情況 的目的。 如表達產(chǎn)物不是酶, 那么就要采用免疫學(xué)方法 (Western blotting)檢測。 第五章 分子生物學(xué)研究法 七. Western 印跡雜交 Western印跡雜交原理

39、 當(dāng)目的基因在生物體內(nèi)正常表達時, 組織細胞中含有一 定量的目的蛋白。 - 用目的蛋白的抗體 (稱為一抗)與目的蛋白反應(yīng)； - 再用能與一抗特異結(jié)合的標(biāo)記抗體 (稱為二抗)反應(yīng)； - 最后通過二抗上標(biāo)記化合物的性質(zhì)對雜交結(jié)果進行分析。 第五章 分子生物學(xué)研究法 七. Western 印跡雜交 2. Western 雜交方法 有印跡雜交和斑點雜交之分。 1) Western 印跡雜交分析 （1）蛋白質(zhì)的提取 （2）蛋白質(zhì)樣品的處理 采用含有 SDS (十二烷基硫酸鈉) 和 -巰基乙醇的樣品緩沖液處理蛋白質(zhì)樣品。第五章 分子生物學(xué)研究法 七. Western 印跡雜交 SDS 的作用： - 使蛋白

40、質(zhì)的亞基解聚, SDS陰離子與松散多肽鏈結(jié)合。 - 使樣品中的蛋白質(zhì)與SDS結(jié)合后, 都帶上大量的負(fù)電 荷（由于SDS帶有大量負(fù)電荷）, 這樣各蛋白質(zhì)分子 間原有的電荷差異就被掩蓋, 剩下的只是分子質(zhì)量的 差異, 此時, 蛋白質(zhì)分子的電泳遷移率取決于它們的分 子質(zhì)量。 -硫基乙醇： - 使二硫鍵還原, 多肽鏈由特定的三維結(jié)構(gòu)變?yōu)樗缮?的伸展?fàn)睢５谖逭?分子生物學(xué)研究法 七. Western 印跡雜交 （3） SDS-聚丙烯酰胺凝膠(SDS)電泳分離 用SDS(sodium dodecylsulfate-polyacrylamide gel electrophoresis ) 凝膠電泳分離。 在蛋白質(zhì)樣品和聚