芘對(duì)斑馬魚胚胎毒性的研究

1、芘對(duì)斑馬魚胚胎毒性的研究摘 要：以斑馬魚的卵黃蛋白原（Vtg）為生物標(biāo)志物，研究芘對(duì)斑馬魚胚胎毒性.用100、200和300 pig-L1 3種 不同濃度的芘和無(wú)水乙醇（空白對(duì)照）同時(shí)處理受精9 h后的斑馬魚胚胎，暴露至72 h與144 h,觀察并統(tǒng)計(jì)斑馬魚 胚胎孵化率、死亡率以及畸形率數(shù)據(jù)以及Vtg基因表達(dá)的情況.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：芘可以影響斑馬魚胚胎的發(fā)育，芘 的暴露導(dǎo)致斑馬魚胚胎出現(xiàn)心包水腫、卵黃囊水腫、脊柱彎曲以及尾部彎曲等中毒癥狀.暴露72 h和144 h后，隨 著芘濃度升高斑馬魚胚胎孵化率下降，畸形率以及死亡率上升，而且中毒程度隨暴露時(shí)間的延長(zhǎng)而增加.與對(duì)照 相比，芘對(duì)斑馬魚Vtg基因

2、表達(dá)量均下降，Vtg基因均沒(méi)有被顯著誘導(dǎo).關(guān)鍵詞：芘；斑馬魚；胚胎；卵黃蛋白原多環(huán)芳烴類化合物（Polycyclic aromatic hydrocarbons , PAHs）的分子中含有兩個(gè)或兩 個(gè)以上苯環(huán)，是一類具有代表性的持久性有機(jī) 污染物（POPs）.分布在水、土壤、大氣、沉 積物等各種環(huán)境介質(zhì)中，在工業(yè)化程度較高地 區(qū)，例如河口、沿海港口和碼頭等近岸環(huán)境最 為常見(jiàn)，主要來(lái)自石油的開(kāi)采、泄漏和污染物 排放1. PAHs具有生物蓄積性長(zhǎng)距離遷移 和生物毒害性4-6等典型的持久性有機(jī)污染物的 屬性.PAHs不僅威脅人類的生活環(huán)境和影響其 健康，而且嚴(yán)重威脅水生生物的生存環(huán)境. PAHs能夠

3、通過(guò)食物鏈進(jìn)入人體，干擾人體內(nèi)分 泌活動(dòng)的正常進(jìn)行，危害人體健康7-8.在水域 生態(tài)系統(tǒng)中，魚類對(duì)對(duì)污染物的毒性作用最為 敏感，組織器官和生理功能都容易受到損害. PAHs暴露可以使魚類胚胎出現(xiàn)卵黃囊腫大、心 包腫大及心臟功能紊亂、脊椎彎曲、頭頜發(fā)育 不全等一系列異常癥狀，并且影響胚胎后續(xù)發(fā) 育乃至早期仔魚死亡率增加9-11.目前，PAHs已 被歐盟和美國(guó)環(huán)保局列為優(yōu)先控制污染物，并 把其中的16種作為環(huán)境污染的監(jiān)測(cè)參數(shù)12.芘是有4個(gè)苯環(huán)結(jié)構(gòu)的PAHs，與PAHs有良 好的相關(guān)性，是高分子量多環(huán)芳烴的典型代 表，常作為監(jiān)測(cè)的指示化合物13.對(duì)水生生物和 人體健康都有潛在毒性效應(yīng).由于具有較強(qiáng)

4、的疏 水性和較低的溶解度，水體中的芘主要分布在 沉積物中，成為我國(guó)淡水沉積物中重要的有機(jī) 污染物.研究證實(shí)，芘具有廣泛的生物毒性，可 以對(duì)微藻14-項(xiàng)、橈足類生物16、貽貝17和魚類等 產(chǎn)生毒性18-19.卵黃蛋白原（Vitellogenin, Vtg ）是存在于 非哺乳動(dòng)物性成熟卵生雌性動(dòng)物血液中的一 種蛋白質(zhì)，是幾乎所有卵生脊椎動(dòng)物卵黃蛋白 的前體20.雌性個(gè)體在卵黃發(fā)育過(guò)程中受到雌 激素的刺激，通過(guò)肝細(xì)胞合成與分泌，隨循環(huán) 系統(tǒng)轉(zhuǎn)運(yùn)到卵巢，然后裂解形成卵黃蛋白.卵黃 蛋白原可以為正在發(fā)育的胚胎提供營(yíng)養(yǎng)和功能 性物質(zhì)，是胚胎和早期幼體發(fā)育的主要營(yíng)養(yǎng)來(lái) 源21-22.作為雌性特異性蛋白的Vt

5、g，在雄性與幼 體內(nèi)含量非常低或不存在，鑒于其肝臟還具有 雌激素受體，所以在環(huán)境雌激素的誘導(dǎo)下，也 可以分泌Vtg.因此魚體內(nèi)Vtg水平的變化可用于 評(píng)估水環(huán)境中類雌激素化合物的污染效應(yīng).目 前，Vtg已被普遍用于環(huán)境內(nèi)分泌干擾物的篩選 以及環(huán)境毒理、污染調(diào)查和相關(guān)研究中，用以檢測(cè)環(huán)境中的雌激素或具有雌激素功能的化合 物23-25.斑馬魚(D anio rerio )的養(yǎng)殖水體小、成本 低、繁殖周期短、產(chǎn)卵量大、胚胎體外受精、 體外發(fā)育、胚體透明，可以在顯微鏡下觀察 到整個(gè)胚胎發(fā)育的過(guò)程，已成為生命科學(xué)研究 的新寵22.目前，斑馬魚作為一種水生模式生 物，被廣泛應(yīng)用于多個(gè)科學(xué)研究領(lǐng)域，例如環(huán)

6、境監(jiān)測(cè)、藥物毒理學(xué)、生態(tài)毒理學(xué)以及疾病研 究等26-28.近年來(lái)，以斑馬魚等魚類胚胎研究 PAHs的致畸性和作用機(jī)理29-31的相關(guān)研究逐漸 開(kāi)展，大多數(shù)集中在萘、菲、苯并a芘等常見(jiàn) 的PAHs，對(duì)芘的研究較少.本實(shí)驗(yàn)研究不同濃 度芘暴露對(duì)斑馬魚胚胎生長(zhǎng)發(fā)育及Vtg含量的 影響，以期為PAHs對(duì)水生生物的毒性提供數(shù)據(jù) 支持.1材料與方法1.1實(shí)驗(yàn)材料受試生物：實(shí)驗(yàn)用的斑馬魚(Danio rerio ) 由嘉應(yīng)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室繁育.試驗(yàn)藥品：芘購(gòu)自Sigma公司，以無(wú)水乙醇 為溶劑先配制成含有1 000 mg/L的母液，然后再 稀釋成試驗(yàn)所需要的各濃度.RNAiso Plus (TAKAR

7、A，RNase-Free WI， USA)(TAKARADalian， ChinaDalian， China)， DNase ( RQ1DNase， Promega， Madison，F(xiàn)irst Strand cDNA Synthesis KitDalian， China )， SYBR Premix1.2斑馬魚的胚胎收集和毒性試驗(yàn)斑馬魚胚胎收集：挑選出健壯的性成熟斑 馬魚，在28龍恒溫環(huán)境中，按照雌、雄2:3的比 例在前一天晚上放入帶孵化器的玻璃缸中， 雌、雄用隔板分開(kāi)，玻璃缸用黑布遮光.第二天 除去黑布，抽出隔板，以燈光照射.斑馬魚受光 照的刺激雌魚產(chǎn)卵，雄魚排精.待其產(chǎn)卵完成 后，去除未

8、受精的胚胎并將受精胚胎上的異物 去除，收集胚胎，在6孔細(xì)胞培養(yǎng)板、28龍恒溫 環(huán)境下孵化.毒性試驗(yàn)：芘溶液對(duì)斑馬魚胚胎毒性試驗(yàn) 方法參照0 ECD32方法進(jìn)行靜態(tài)染毒.試驗(yàn)用6孔 細(xì)胞培養(yǎng)板作為染毒試驗(yàn)容器，根據(jù)前期預(yù)試 驗(yàn)，確定芘的最高耐受濃度和最低全致死濃 度，按一定比例設(shè)置0、00、200、300 pg/L 4個(gè) 濃度梯度.每個(gè)濃度設(shè)6個(gè)平行，并設(shè)對(duì)照組.隨 機(jī)挑選發(fā)育正常的受精卵平均放入芘溶液中， 試驗(yàn)在28 C的恒溫箱內(nèi)進(jìn)行，光周期的設(shè)定為 12 h：12 h，定時(shí)觀察并記錄發(fā)育過(guò)程中的毒理 學(xué)終點(diǎn).每組每個(gè)濃度梯度收集15條斑馬魚仔 魚，儲(chǔ)存在-80 C冰箱中備用.1.3觀察記錄胚

9、胎的孵化率、死亡率和畸形率本試驗(yàn)選定的毒理學(xué)終點(diǎn)為胚胎發(fā)育72 h、 144 h的死亡率、孵化率和畸形率.每天至少兩次 在解剖顯微鏡下觀察胚胎發(fā)育情況，在觀察過(guò) 程將肉眼看到白色或倒置顯微鏡下觀察為黑色 的卵被判斷為死亡個(gè)體，從培養(yǎng)板中及時(shí)挑出. 觀察時(shí)盡可能在室溫28 C時(shí)進(jìn)行，動(dòng)作迅速， 完畢后放回恒溫箱中.分別在72 h和144 h統(tǒng)計(jì)各 實(shí)驗(yàn)組胚胎孵化率、死亡率和畸形率，并在顯 微鏡拍攝仔魚的發(fā)育狀況.1.4芘對(duì)斑馬魚胚胎目標(biāo)基因表達(dá)的影響試驗(yàn)1.4.1提取總RNA取保存在-80 C的斑馬魚胚胎研磨成粉 末，每個(gè)樣品中加入1mL Isoplus RNA ( RNAiso Plus)提取

10、液，勻漿后進(jìn)行胚胎總RNA的提取. RNA提取后進(jìn)行基因組DNA的去除，并用分光 光度計(jì)檢測(cè)RNA的濃度及其完整性，保證 A260/A280 的比值在 1.82.1.1.4.2 cDNA的制備取一定量的RNA于離心管中，總體積為 3*L, 一組樣品中以最小RNA濃度為基準(zhǔn).如最 小量樣品中RNA含1 000 ng/pL，取3 pL，RNA含 量為3 000 ng，另一樣品RNA濃度為1 200 ng/pL，則需要取樣2.5 pL，另加0.5 pL 的DEPC- water.加入1pL Oligo dT試劑，手指輕彈管底混 勻，72 C熱水浴10 min后將離心管放置-20 C冰 箱冷卻1 mi

11、n，離心1 min.加入1 X mastermix試劑（2.5 日L dNTP ,2日L FS buffer ,1 日LDTT, 0.5L MMLV反轉(zhuǎn)錄酶等試劑的混合物， 混勻）.42 C水浴中孵育2 h. -80 C保存?zhèn)溆? 1.4.3 PCR 擴(kuò)增引物稀釋10倍，10嘰的引物加入90日L的 UPW-water.將反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA樣品稀釋 10倍，直接在獲得的樣品中加入90嘰的UPW- water. 準(zhǔn)備32支0.2 mL PCR管，總反應(yīng)混合體系 體積為30 pL,依次添加以下試劑：cDNA樣品 10*L, ddH2O 15.8*L, 10 xBuffer 3 pL，primer1

12、 （上游引物）0.3 pL，primer 2 （下游引 物）0.3 *L, Taq酶0.6 *L,混勻.進(jìn)行PCR反 應(yīng)檢測(cè)，設(shè)定PCR程序，基因V tg1、Vtg3- Vtg8反應(yīng)條件為94 C 3 min預(yù)變性,94 C 30 s 變性，57 C 30 s退火，72 C 40 s延伸，72 C 5 min,12 C 5 min, 33個(gè)循環(huán)；efla基因反應(yīng)條件為94 C預(yù)變性5 min, 94 C變性30 s, 61 C 退火 30 s, 72 C延伸30 s, 72 C 7 min, 12 C 5 min, 33個(gè)循環(huán).如若擴(kuò)增完成后不及時(shí)進(jìn)行下一步實(shí) 驗(yàn)，將樣品放置4 C冰箱冷藏備用

13、.1.4.4電泳鑒定進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳.稱取0.6 g瓊脂糖粉， 加到40 mL 1xTBE電泳緩沖液中，搖勻，在微 波爐中加熱1分鐘，待瓊脂糖完全溶解后取出. 冷卻至60 C左右，加入5 pL Gold View核酸染 料，輕輕搖勻，以避免產(chǎn)生氣泡.冷卻至不燙手 時(shí)倒膠，室溫下冷卻凝固，小心地向上垂直拔 出梳子，將凝膠放入電泳槽中，加1xTBE電泳 緩沖液，直到液體表面覆蓋凝膠5 mm左右.用 移液槍分別吸取各濃度組10 pL DNA樣品置于保 鮮膜上，另外再吸取1.5 pL green buffer緩沖 液，然后與樣品反復(fù)吹吸混勻.吸取5 p L marker試劑和8 pL混合好的樣品小心

14、地加入點(diǎn)樣 孔.打開(kāi)電源開(kāi)關(guān)，將調(diào)節(jié)電壓至110 V-120 V,電泳約15 min20 min.根據(jù)紫外光下的觀察 結(jié)果，用凝膠圖像分析系統(tǒng)對(duì)電泳條帶進(jìn)行 PCR定量分析.1.5數(shù)據(jù)處理所有的實(shí)驗(yàn)重復(fù)4次,用2- A A Ct法結(jié)合定 量PCR數(shù)據(jù)計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量，實(shí)驗(yàn)結(jié)果 用平均值土標(biāo)準(zhǔn)誤差（mean SDE）表示.采用 SPSS17.0統(tǒng)計(jì)；分析軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì) 分析，使用單因素方差分析（ANOVA）法和 Duncan多重比較法對(duì)實(shí)驗(yàn)所得的數(shù)據(jù)進(jìn)行比 較，觀察暴露組和對(duì)照組間各觀測(cè)指標(biāo)的是否 存在顯著性差異，其差異性用字母標(biāo)記統(tǒng)計(jì)值 的方法來(lái)表示，同一個(gè)字母表示數(shù)值間差異不 顯

15、著（P0.05）,不同的字母則表示數(shù)值差異 顯著（P0.05 ）.2結(jié)果與分析2.1芘暴露對(duì)斑馬魚胚胎及幼魚形態(tài)學(xué)的影響芘溶液對(duì)斑馬魚胚胎毒性試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，對(duì) 照組的斑馬魚胚胎發(fā)育正常，芘溶液對(duì)斑馬魚 胚胎和仔魚產(chǎn)生各種毒性效應(yīng)，如圖1所示.從 圖可見(jiàn)，芘溶液暴露處理后，斑馬魚胚胎以及 幼魚出現(xiàn)心包水腫、卵黃囊水腫、脊柱彎曲和 尾部畸形等不同程度發(fā)育異常癥狀，甚至有死 亡現(xiàn)象，死亡胚胎呈白色不透明狀.D卵黃囊腫大E心包水腫、卵黃囊腫大F心包水腫、卵黃囊腫大G脊柱、尾部彎曲H脊柱、尾部彎曲I脊柱彎曲圖1芘暴露對(duì)斑馬魚胚胎形態(tài)變化及中毒癥狀注：PCE表示心包水腫，YSE表示卵黃囊腫大，SC表示 脊柱

16、彎曲，TC表示尾部彎曲2.2芘暴露對(duì)斑馬魚胚胎死亡率、孵化率及畸 形率的影響芘溶液對(duì)斑馬魚胚胎毒性試驗(yàn)中，其胚胎 發(fā)育72 h、144 h的死亡率、孵化率和畸形率如 表1所示.隨著芘的質(zhì)量濃度加大，斑馬魚的孵 化率下降，在初始質(zhì)量濃度1。- L-1時(shí)，孵 化率為(75.0。 2.73 ) %，與對(duì)照組(78.57 1.65 ) %相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)；在 中濃度組2。g - L-1時(shí)，孵化率為(67.14 1.65 ) %，與對(duì)照組差異顯著(PG.G5 )；在最 高質(zhì)量濃度3。g - L-1時(shí)，孵化率為(61.43 3.69)%，與對(duì)照組差異顯著，各實(shí)驗(yàn)組間孵化 率也存在顯著差異

17、.芘的質(zhì)量濃度與斑馬魚胚胎和幼魚的畸形 率以及死亡率呈正相關(guān)，而且隨著時(shí)間的延 長(zhǎng)，畸形率和死亡率升高.在初始質(zhì)量濃度1。 g - L-1時(shí)，72 h和144 h畸形率分別為(5.。 4.3。)和(27.744.64)%，均與對(duì)照組(。.。.。) %差異顯著；在中濃度2。 日g - L-1時(shí)，72 h和144 h畸形率分別為(1。.。土 2.72) %和 ( 41.67 1.92 ) %，均與對(duì)照組有 顯著差異；在最高濃度組3GG g - L-1時(shí)的72 h、144 h兩者畸形率分別為(18.341.92 ) %和(46.55 4.83 ) %，均與對(duì)照組有 顯著差異.芘溶液最低濃度組的斑馬魚

18、幼魚在72 h的 死亡率是(3.34 3.85 ) %，與對(duì)照組(2.5。 3.19 )無(wú)顯著差異，但在144 h時(shí)的死亡率 (27.5G6.31 ) %與對(duì)照組(1。.。2.72 ) %存在顯著差異；中濃度組的幼魚在 72 h的死亡率是(4.17 3.19 ) %，與對(duì)照組 無(wú)顯著差異，但在144 h時(shí)的死亡率(35.GG 4.3G) %與對(duì)照組有顯著差異；最高濃度 組的幼魚在72 h和144 h的死亡率分別是(8.34 1.92) %和(4G.83 5.69) %，均與 對(duì)照組差異顯著.表明低濃度時(shí)對(duì)斑馬魚胚胎 發(fā)育影響較小，高濃度對(duì)斑馬魚發(fā)育產(chǎn)生較大 影響.表1芘暴露對(duì)斑馬魚發(fā)育的毒性影

19、響質(zhì)量濃度/孵化菊畸形豹死亡豹(上曠匚)72 h 144 h 72 h144 h078.57 1.651 0.00 0.001 0.00 0.002.50 3.1910.00 2.7210075.00 2.73 5.00 4.30 27.74 4.643.34 3.85127.50 6.31b20067.14 1.65b 10.00 2.72141.67 1.924.17 3.1935.00 4.3030061.43 3.69 18.34 1.92d 46.55 4.838.34 1.92k40.83 5.69c注：結(jié)果為每組4個(gè)重復(fù)的平、均值士標(biāo)準(zhǔn)誤差(mean 士 SDE )表示，同一列不

20、同字母表示組間差異 顯著(P0.05 )2.3芘暴露對(duì)卵黃蛋白原(Vtg)基因表達(dá)的影響芘溶液對(duì)斑馬魚胚胎毒性試驗(yàn)。、1。、2。、3GG ug/L 4個(gè)濃度梯度.如圖2所示，與對(duì)照 組相比，芘暴露對(duì)卵黃蛋白原(Vtg)基因 Vtg1、Vtg3、Vtg5和Vtg7基因表達(dá)誘導(dǎo)顯示總體 呈現(xiàn)下降的趨向，Vtg4和Vtg6基因隨著芘濃度 的升高，基因表達(dá)量增加，但各濃度組的表達(dá) 量均較對(duì)照組下降.對(duì)照組中Vtg1基因表達(dá)量為1.2。，Vtg1在 各濃度組的基因表達(dá)量分別為。.36、。.23、。.12. 與對(duì)照組相比，Vtg1基因表達(dá)量均降低；且各 濃度組之間隨著芘溶液濃度的升高而下降，均 有顯著差異

21、(？。.。5),各平行實(shí)驗(yàn)組間沒(méi)有 顯著差異.對(duì)照組中Vtg3基因表達(dá)量為1.83, Vtg3在各 濃度組的基因表達(dá)量分別為。.6。、。.43、G.39. 與對(duì)照組相比，Vtg3基因表達(dá)量均降低；且各 濃度組之間隨著芘溶液濃度的升高下降， Vtg3基因沒(méi)有被芘誘導(dǎo).對(duì)照組中Vtg4基因表達(dá)量為1.31, Vtg4在 各濃度組的基因表達(dá)量分別為。.38、。.45、。.49. 與對(duì)照組相比，Vtg4基因表達(dá)量均降低；但各 濃度組之間隨著芘溶液濃度的升高而Vtg4基因 表達(dá)量上升，但不顯著.對(duì)照組中Vtg5基因表達(dá)量為1.62, Vtg5在各 濃度組的基因表達(dá)量分別為。.66、。.34、G.16.

22、與對(duì)照組相比，Vtg5基因表達(dá)量均降低；且各 濃度組之間隨著芘溶液濃度的升高而下降， Vtg5基因沒(méi)有被芘誘導(dǎo).對(duì)照組中Vtg6基因表達(dá)量為1.。9,Vtg1在各濃度組的基因表達(dá)量分別為。.4。、。.96、1.。2.與對(duì)照組相比，Vtg6基因表達(dá)量均降低；但各 濃度組之間隨著芘溶液濃度的升高而Vtg6基因 表達(dá)量上升，Vtg6基因沒(méi)有被芘顯著誘導(dǎo).對(duì)照組中Vtg7基因表達(dá)量為1.17, Vtg7在 各濃度組的基因表達(dá)量分別為0.41、0.35、0.20. 與對(duì)照組相比，Vtg7基因表達(dá)量均降低；且各 濃度組之間隨著芘溶液濃度的升高而下降，均 有顯著差異（PV0.05）,各平行實(shí)驗(yàn)組間沒(méi)有 顯著

23、差異.芘質(zhì)量濃度Z（g-L芘質(zhì)量濃度Z（g-L-1）*招糕其rgKw混-A1.801.601.401.201.000.800.600.400.20芘質(zhì)量濃度/ （片g300CTL1002001.601.401.201.000.800.600.400.20200300CTL100芘質(zhì)量濃度/ （ug 芘質(zhì)量濃度/ （片g300CTL1002001.601.401.201.000.800.600.400.20200300CTL100芘質(zhì)量濃度/ （ug -L1）0.201.400.00CTL1002003000000000000864208642011111 0. 0. .0 0. 0. *招糕其

24、rgKws81ACTL100200300芘質(zhì)量濃度Z（g-L_1）芘質(zhì)量濃度Z（1.400.00CTL1002003000000000000864208642011111 0. 0. .0 0. 0. *招糕其rgKws81ACTL100200300芘質(zhì)量濃度Z（g-L_1）芘質(zhì)量濃度Z（g-L_1）00000004208642111 0. 0. 0. 0. *招糕其rgKw981A1.201.000.800.600.400.20.CTL100200300芘質(zhì)量濃度Z（g-L_1）圖2芘暴露對(duì)卵黃蛋白原基因表達(dá)的影響本實(shí)驗(yàn)研究了芘暴露72h、144 h的斑馬魚 胚胎生長(zhǎng)發(fā)育情況，運(yùn)用熒光定量PCR測(cè)定斑 馬魚胚胎期Vtg含量，結(jié)果表明：與對(duì)照組相 比，除了 100 pg-L-1濃度組外，斑馬魚胚胎孵 化率顯著下降，畸形率增加，死亡率上升；而 72 h和144 h相比，中毒的程度隨暴露時(shí)間的延 長(zhǎng)而加重低濃度芘溶液在斑馬魚胚胎或幼魚體 內(nèi)沉積量低，產(chǎn)生的毒性相應(yīng)較低；然而隨著 溶液中芘含量的升高，斑馬魚胚胎及其幼魚體 內(nèi)芘的沉積量增加，大大降低了斑馬魚的胚胎 孵化率，加重了心包水腫、