第十一章-遺傳檢測(cè)與基因治療課件

1、1第十一章遺傳檢測(cè)與基因治療Genetic Diagnosis and Gene Therapy基因工程原理山東理工大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院2（1）苯丙酮尿?。?）21三體綜合征（3）抗維生素D佝僂?。?）軟骨發(fā)育不全（5）進(jìn)行性肌營(yíng)養(yǎng)不良（6）青年少型糖尿病（7）性腺發(fā)育不良A、常顯B、常隱C、X顯D、X隱E、多基因遺傳病F、常染色體病G、性染色體病34主要內(nèi)容基因診斷1基因治療2基因圖譜35基因變異致病類型內(nèi)源基因的變異基因結(jié)構(gòu)突變基因表達(dá)異常外源基因的入侵7第 一 節(jié)基 因 診 斷Gene Diagnosis8一、基因診斷的概念和特點(diǎn)定義利用現(xiàn)代分子生物學(xué)和分子遺傳學(xué)的技術(shù)和方法，直接檢測(cè)基因結(jié)

2、構(gòu)及其表達(dá)水平是否正常，從而對(duì)疾病作出診斷的方法?；蛟\斷的前提：已明確疾病表型與基因的關(guān)系。10二、基因診斷常用技術(shù)方法內(nèi)容：直接診斷致病基因明確間接診斷致病基因不明確， 基因連鎖分析分子基礎(chǔ)基因結(jié)構(gòu)異常 基因表達(dá)異常11基因診斷的對(duì)象1、病原生物的侵入病原體：病毒、支原體、細(xì)菌、寄生蟲(chóng)檢查診斷方法：顯微鏡、免疫學(xué)方法、基因診斷等。尤其是當(dāng)無(wú)抗體時(shí)，基因診斷成為唯一手段。2、先天遺傳性疾病遺傳性疾病: 發(fā)病的原因?yàn)樘囟ɑ虻耐蛔儭?2腫瘤的發(fā)生： 發(fā)病機(jī)理尚不請(qǐng)。 初步認(rèn)為是個(gè)別細(xì)胞基因突變而引起的 細(xì)胞無(wú)限增殖.（包括抑癌基因和癌基因）3、后天基因突變引起的疾病基因診斷的對(duì)象14基因診斷的

3、內(nèi)容定性和定量分析基因序列分析基因突變分析基因拷貝數(shù)分析基因表達(dá)產(chǎn)物分析外源基因檢測(cè)15基因診斷的基本策略：1、檢測(cè)已知的能產(chǎn)生某種特定功能蛋白的基因 這些基因根據(jù)其特定功能已被克隆，并被定位在染色體上，基因序列亦被測(cè)定，致病時(shí)的基因改變亦較清楚。如：已被克隆的病毒、細(xì)菌、霉菌和寄生蟲(chóng)的基因、與致病有關(guān)的癌基因、抗癌基因、地中海貧血、苯丙酮尿癥等遺傳病基因。二、基因診斷常用技術(shù)方法173、檢測(cè)表型克隆基因針對(duì)多基因病（如：重度肥胖、哮喘、高血壓、癲癇、精神病、多種自身免疫性疾?。１硇涂寺〖夹g(shù)是將有關(guān)表型與基因結(jié)構(gòu)結(jié)合，直接分離該表型的相關(guān)基因，并對(duì)疾病相關(guān)的一組基因進(jìn)行克隆，然后用作多種探針

4、，來(lái)診斷多基因遺傳病。方法：1、DDRT-PCR：分析正常和異?；蚪M尋找兩者之間的差異序列2、基因組錯(cuò)配篩選技術(shù)：尋找兩者的全同序列，分離、鑒定與疾病相關(guān)的基因，確定導(dǎo)致疾病的分子缺陷18基因診斷的基本步驟：1、獲得待檢樣品：提取核酸 （PCR提高靈敏度) 2、制備和標(biāo)記核酸探針3、基因檢測(cè)分析 19二、基因診斷常用技術(shù)方法（一）核酸分子雜交技術(shù)（二）聚合酶鏈反應(yīng) (PCR)（三）基因測(cè)序（四）生物芯片20常用的固相核酸雜交方法Southern印跡雜交、Northern印跡雜交、菌落雜交、斑點(diǎn)雜交（狹縫雜交）、原位雜交、夾心雜交等。211988 Saiki1988 Keohanog1985

5、Mullis1971 Korana耐熱DNA聚合酶T4 DNA聚合酶聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Klenow片段)核酸體外擴(kuò)增設(shè)想（二）聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)1. 發(fā)展簡(jiǎn)史 變性95C延伸72C退火Tm-5C溶液反應(yīng)溫度升至中溫72，在 Taq酶作用下，以dNTP為原料，引物為復(fù)制起點(diǎn)，模板DNA的一條單鏈在解鏈和退火之后延伸為一條雙鏈加熱使模板DNA在高溫下90- 95 變性，雙鏈解鏈降低溶液溫度，使合成引物在低溫（3570,一般低于模板Tm值的5左右），與模板DNA互補(bǔ)退火形成部分雙鏈2. PCR的基本反應(yīng)步驟1. 芯片的制備 Gene probes（cDNA、DNA）substrate Ready-to-

6、usemicroarrayOligo probesAGCTorarrayerSample cellsExtract RNA or DNA2) RT or PCR amplification3) Fluorescent labelingReference cellsSample readycombineLabeled RNA or DNA (Sample )Labeled RNA or DNA (Reference) 2)1)3)1)2)3)2. 基因表達(dá)譜雙色標(biāo)記4. 檢測(cè)分析Laser 1Laser 2Detector 1Detector 2Scanner芯片的掃描5. 圖 像 處 理Det

7、ector 1Detector 2False-color differential image6. 圖像分析30（四）基因測(cè)序是最直接、最確切的基因診斷方法。Maxam-Gilbert法（化學(xué)裂解法）Sanger法（雙脫氧末端終止法） DNA自動(dòng)測(cè)序法弗雷德里克 桑格31www.sanger.ac.uk Fred Sanger photographed at the Wellcome Trust Sanger Institute DNA自動(dòng)測(cè)序法設(shè)計(jì)原理：Sanger法為基礎(chǔ)熒光標(biāo)記物：不同顏色的熒光分 別代表A、G、C、T電泳電信號(hào)顯示34（五）其他檢測(cè)技術(shù)1、RLFP分析法檢出方法： So

8、uthern 印跡概念：用同一限制性內(nèi)切酶完全切割同一物種的不同個(gè)體的基因組DNA，出現(xiàn)分子質(zhì)量不同的同源片段，這種由限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)變化導(dǎo)致的DNA片段差異，稱限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（RFLP）。人類基因組中由中性突變導(dǎo)致個(gè)體間核苷酸的差異稱DNA多態(tài)性35PCR/單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析(single strand conformation polymorphism, SSCP)PCR產(chǎn)物變性后，經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳，正?；蚝妥儺惢虻倪w移位置不同，借此可分析確定致病基因的存在。 2、PCR/單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析36ssDNAdsDNA高溫變性，快速冰浴野生型DNA突變型DNASSCP原理示意

9、圖慢快點(diǎn)樣孔373、變性高效液相色譜利用PCR擴(kuò)增過(guò)程的單鏈DNA產(chǎn)物可以隨機(jī)與互補(bǔ)鏈相結(jié)合而形成雙鏈的特性，依據(jù)最終產(chǎn)物中是否會(huì)出現(xiàn)異源雙鏈來(lái)判斷待測(cè)樣品中是否存在點(diǎn)突變。38391、mRNA的定量分析（1）相對(duì)定量 斑點(diǎn)雜交 RT-PCR（2）絕對(duì)定量2、mRNA長(zhǎng)度分析 Northern印跡雜交 RT-PCR（六）基因表達(dá)異常的診斷40三、基因診斷的應(yīng)用遺傳病 產(chǎn)前診斷、優(yōu)生優(yōu)育腫瘤 了解惡性腫瘤的分子機(jī)制，對(duì)腫瘤分類分型及預(yù)后有指導(dǎo)意義。 感染性疾病 具有快速、靈敏、特異等優(yōu)點(diǎn)。法醫(yī)學(xué)中個(gè)體識(shí)別、親子鑒定 有些具有個(gè)體特征的遺傳標(biāo)記可用于個(gè)體識(shí)別和親子鑒定，如DNA指紋分析、短串聯(lián)重復(fù)

10、（STR）多態(tài)性分析等。41腫瘤標(biāo)志物：指特征性存在于惡性腫瘤或由惡性腫瘤細(xì) 胞異常產(chǎn)生的物質(zhì)或宿主對(duì)腫瘤反應(yīng)而產(chǎn) 生的物質(zhì)。（1）酶類腫瘤標(biāo)志物（2）激素類標(biāo)志物（3）胚胎抗原（4）特殊蛋白標(biāo)志物（5）糖蛋白類抗原（6）血中癌基因蛋白（7）唾液酸和唾液酸酰基轉(zhuǎn)移酶（8）多胺免疫組化篩選提高檢出率42感染性疾病的基因診斷目前應(yīng)用最多是PCR法，不僅可檢測(cè)病原體的DNA（如乙肝病毒、巨細(xì)胞病毒、乳頭瘤病毒、結(jié)核桿菌等），而且可檢測(cè)RNA病原體（RT-PCR檢測(cè)艾滋病病毒、丙肝病毒等）。43第 二 節(jié) 基 因 治 療Gene Therapy44一、基因治療的概念經(jīng)典概念(狹義概念)：將具有正常功能

11、的基因置換或增補(bǔ)患者體內(nèi)缺陷的基因，從而達(dá)到治療疾病的目的。廣義概念：將某些遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)移至患者體內(nèi)，使其在體內(nèi)表達(dá)，最終達(dá)到治療某種疾病的方法，均稱之為基因治療。45二、基因治療的總體策略基因矯正 基因置換 基因增補(bǔ) 基因失活 自殺基因的應(yīng)用免疫基因治療耐藥基因治療46幾種常見(jiàn)的基因失活技術(shù)反義核酸技術(shù)核酶技術(shù)三鏈技術(shù)干擾RNA(RNAi)技術(shù)基因治療的其他方法：如“自殺基因”的應(yīng)用，基因疫苗等47A. 賈第鞭毛蟲(chóng)Dicer的晶體結(jié)構(gòu)； RNA干擾機(jī)制示意圖 48“自殺基因”的應(yīng)用：HSV-TK 自殺基因又稱前體藥物酶轉(zhuǎn)化基因，這種基因?qū)胧荏w細(xì)胞后可產(chǎn)生一種酶，它可將原來(lái)無(wú)細(xì)胞毒性或低毒藥物

12、前體轉(zhuǎn)化為細(xì)胞毒性物質(zhì)，將細(xì)胞本身殺死，這種基因被稱為“自殺基因”。 自殺基因?qū)肽[瘤細(xì)胞后，可將腫瘤細(xì)胞殺死。但對(duì)正常細(xì)胞則無(wú)傷害作用。49基因治療：降低成本理論上所有治療基因（包括非分泌蛋白）均可開(kāi)展基因治療基因治療：技術(shù)上難度大，有效性和安全性要求高基因治療：僅10余年歷史，技術(shù)不夠成熟，風(fēng)險(xiǎn)大基因治療的前景分析基因治療的兩種途徑載體目的基因in vivoex vivo靶細(xì)胞511體細(xì)胞基因治療：把外源基因?qū)牖颊叩捏w細(xì)胞，只有特定的個(gè)體受益，但不能遺傳給后代。 2種系細(xì)胞的基因治療：在生殖細(xì)胞（精子、卵子或未分化的受精卵）中引入正?；蚧蛐迯?fù)缺陷基因。能遺傳給后代。優(yōu)點(diǎn)：目的基因轉(zhuǎn)移到

13、機(jī)體的所有組織并遺傳給后代。目前尚未開(kāi)展，一是涉及倫理學(xué)問(wèn)題；二是技術(shù)困難（診斷困難、引起新的插入突變的危險(xiǎn)） 52三、基因治療的基本程序治療性基因的獲得基因載體的選擇靶細(xì)胞的選擇基因轉(zhuǎn)移方法轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的選擇鑒定 利用載體中的標(biāo)記基因回輸體內(nèi)病毒載體非病毒載體體細(xì)胞生殖細(xì)胞化學(xué)法、物理法、病毒載體系統(tǒng)、膜融合法等53四、基因治療的現(xiàn)狀與展望（一）基因治療應(yīng)滿足的條件 1、單基因缺陷疾病 2、僅限體細(xì)胞的基因治療 3、靶細(xì)胞易獲取、培養(yǎng)、及回輸體內(nèi)。 4、治療效果應(yīng)勝過(guò)對(duì)病人的危害。 5、表達(dá)水平無(wú)需調(diào)控且無(wú)副作用。 6、需經(jīng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證安全可行。54四、基因治療的現(xiàn)狀與展望 （二）基因治療有待解

14、決的問(wèn)題 1、難以獲得真正有治療作用的基因。 2、外源基因的表達(dá)難以在體內(nèi)精確調(diào)控。 3、體細(xì)胞經(jīng)體外培養(yǎng)后，其生物學(xué)特性會(huì)有改變。 4、過(guò)多的外源蛋白對(duì)機(jī)體帶來(lái)可能的影響。 5、隨機(jī)整合潛在的威脅。 55轉(zhuǎn)基因治療的問(wèn)題與危險(xiǎn)性安全性:導(dǎo)入的基因缺乏調(diào)控手段；有效性和穩(wěn)定性：缺少高效和導(dǎo)向的載體系統(tǒng)；目前人們多重視分子水平的研究而忽略了整體研究，對(duì)整體宏觀水平缺乏了解。 1999年9月17日，美國(guó)Arizona州18歲的青年格爾辛格在賓夕法尼亞大學(xué)人類基因治療研究所接受基因治療4天后不幸死亡，成為基因治療實(shí)施以來(lái)第1個(gè)直接死于這種試驗(yàn)的病人。 5657遺傳病的基因治療研究 已知人類有4000

15、多種遺傳病，在人群中的發(fā)病率約為4050。但真正了解病因，能進(jìn)行產(chǎn)前診斷的僅限于那些為數(shù)不多的常見(jiàn)遺傳病。 1.在DNA水平明確其發(fā)病原因及機(jī)制；2.必須是單基因遺傳病，而且屬隱性遺傳；3.該基因的表達(dá)不需要精確調(diào)控；4.該基因能在一種便于臨床操作的組織細(xì)胞(如皮膚細(xì)胞，骨髓細(xì)胞等)中表達(dá)并發(fā)揮其生理作用；5.該遺傳病不經(jīng)治療將有嚴(yán)重后果(如不治療難以存活等)?？晒┻x擇并符合上述4條以上要求的不過(guò)只有30余種遺傳病。遺傳病基因治療必須符合以下要求：58基因治療和人類基因組計(jì)劃59人類基因組計(jì)劃由美國(guó)科學(xué)家于1985年率先提出。（1）找出人類所有基因及其在染色體上的位置；（2）解開(kāi)人類3 3.5

16、萬(wàn)個(gè)基因的密碼；（3）確定30億個(gè)堿基對(duì)的排列順序； （4）中國(guó)、美國(guó)、英國(guó)、法國(guó)、德國(guó)、日本6國(guó)產(chǎn)與；（5）千名研究人員參與，耗資30億美元。（6）20世紀(jì)人類自然科學(xué)史上3個(gè)最偉大的工程計(jì)劃。人類基因組計(jì)劃的基本情況60遺傳圖譜轉(zhuǎn)錄圖譜0.7 cM 或 kb 序列圖譜物理圖譜100 kbSTS map遺傳圖物理圖轉(zhuǎn)錄圖序列圖人類基因組計(jì)劃內(nèi)容？繪制四張圖611、基因診斷：診斷遺傳疾病。2、基因治療：可針對(duì)疾病發(fā)生的各個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)導(dǎo)入相應(yīng)基因。3、基因預(yù)防：生產(chǎn)基因疫苗。4、用藥個(gè)體化的實(shí)施：根據(jù)每個(gè)人的基因特征來(lái)選擇藥物及劑量。人類基因組的醫(yī)療價(jià)值62 Is this the future

17、of clinical practice?Diagnosis63* 發(fā)展趨勢(shì) 今 天明 天 診斷 治療 監(jiān)視 基因分型 選擇藥物和劑量基因護(hù)照 geneticpassport外原性物質(zhì)接觸 診斷 預(yù)防 選擇藥物和劑量 監(jiān)視 治療診斷導(dǎo)向治療基因?qū)蝾A(yù)防和量體裁衣治療64醫(yī)生咨詢中心接受咨詢(包括電話)決定檢測(cè)項(xiàng)目并送檢解釋檢測(cè)結(jié)果的臨床意義治療方案建議送檢送檢提供 PGt & PGx 信息個(gè)體化施治新藥研究服務(wù)檢測(cè)中心醫(yī)生.企業(yè)藥物基因組學(xué)研究平臺(tái)-個(gè)體化用藥咨詢中心新藥研究藥物基因組學(xué)服務(wù)病人、受試者檢測(cè)通道咨詢解釋65第三節(jié)基因圖譜66基因作圖基因作圖的目的 基因作圖是將基因分配到染色體的

18、基因座上。通過(guò)對(duì)很多基因和其它標(biāo)記相對(duì)位置的作圖，可能產(chǎn)生一個(gè)染色體圖譜或整個(gè)基因組的圖譜。基因作圖可幫助人們理解與控制生物性狀的遺傳性質(zhì)，特別是通過(guò)遺傳連鎖將一種性狀的遺傳與另一種相聯(lián)系，或者通過(guò)將表型差異與染色體結(jié)構(gòu)的改變聯(lián)系起來(lái)。67在人類中，這使生化機(jī)制不清楚的遺傳疾病的基因在特定染色體或染色體帶型中定位，并通過(guò)與標(biāo)記相連鎖追蹤家譜。對(duì)幾種模式生物在國(guó)際范圍內(nèi)展開(kāi)制作遺傳和物理圖譜的工作，最終目的是確定整個(gè)基因組順序。基因組作圖、分析和測(cè)序的學(xué)科稱為基因組學(xué)(genomics)。68遺傳標(biāo)記：可以穩(wěn)定遺傳的，易于識(shí)別的特殊的遺傳多態(tài)性形式。在經(jīng)典遺傳學(xué)中，遺傳多態(tài)性是指等位基因的變（差

19、）異；在現(xiàn)代遺傳學(xué)中，遺傳多態(tài)性是指基因組中任何座位上的相對(duì)差異或者是DNA序列的差異。遺傳標(biāo)記69遺傳標(biāo)記及其應(yīng)用第一節(jié) 遺傳標(biāo)記 的類型與特點(diǎn)遺傳標(biāo)記（Genetic markers）可以明確反映遺傳多態(tài)性的生物特征。形態(tài)標(biāo)記（morphological markers細(xì)胞學(xué)標(biāo)記（cytological markers）生化標(biāo)記（biochemical markers分子標(biāo)記（molecular markers）70形態(tài)標(biāo)記(morphological markers) 指植物的外部形態(tài)特征，如矮稈、白化、黃化、變態(tài)葉、雄性不育等。71水稻已鑒定出300多個(gè)標(biāo)記基因棉花中已鑒定出160多個(gè)

20、突變基因。72染色體結(jié)構(gòu) (如缺失、易位、倒位、重復(fù)等)細(xì)胞遺傳學(xué)標(biāo)記能夠顯示遺傳多態(tài)性的細(xì)胞學(xué)特征。染色體數(shù)量（如單體、缺體、三體、四體）73染色體長(zhǎng)度、隨體和著絲粒，反映染色體的缺失、易位、倒位、重復(fù)染色體結(jié)構(gòu)C帶、N帶、G帶等，反映染色體上常染色質(zhì)與異染色質(zhì)的分布染色體核型染色體帶型74Cytogenetic Mapping細(xì)胞遺傳學(xué)基因定位示意圖，從圖中可以看出，不同基因定位于染色體不同位置上。這種結(jié)果僅僅是粗略的定位，顯示的是基因在染色體上的物理定位。75生化標(biāo)記(biochemical markers) 利用基因的表達(dá)產(chǎn)物，主要包括貯藏蛋白、同工酶和等位酶等； 可以直接反映基因表達(dá)產(chǎn)物的差異，受環(huán)境的影響較小。不足：標(biāo)記數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足實(shí)際的需要；存在組織和器官特異性。76種子貯藏蛋白的電泳分析已廣泛用于作物品種鑒別和種子純度鑒定。聚丙烯酰胺凝膠電泳77同工酶（isozyme）具有功能相同而結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)不同的一類酶等位酶（allozymes）同一基因座上的不同等位基因編碼的